Die Autoren haben keine Bestätigungen.

1. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Platte 20.000 Zellen in 2 mL Kulturmedium in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte mit steriler Technik in eine biologische Kabinett.</li>
	<li>Platz 6-Well Platten in einem befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) 24 Stunden damit die Zellen an Platten halten.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Photosensitizers für Behandlung der Zellen
<ol><li>0,5, 1 und 2 mM 5-ALA-Lösungen in Kulturmedium vorzubereiten. Wenn fötale bovine Serum (FBS) zutat Kulturmedium ist, vorzubereiten und behandeln Zellen mit 5-ALA in Kulturmedium Lösung mit 0,1 % FBS für Inkubationen. 11 , 12 In diesem Fall SCC-13 Zellen FBS, erfordern keine so 5-ALA direkt Keratinozyten serumfreien Medium ergänzt mit bovinen Hypophysen-Extrakt und epidermalen Wachstumsfaktor hinzugefügt wurde.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit mindestens 2 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Aspirieren Sie PBS und 2 mL 0, 0,5, 1 oder 2 mM 5-ALA-Lösungen in separaten Platten oder Brunnen.</li>
	<li>Inkubation der Zellen mit 0, 0,5, 1 oder 2 mM 5-ALA auf einem 36 bis 37 ° C heizen Block für 30 min. schützen die Zellen vor Belichtung während der Inkubation mit Aluminiumfolie.</li>
	<li>Aspirieren Sie die 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA-Lösungen und waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS.</li>
	<li>Aspirieren Sie PBS und 2 mL Kulturmedium für blaue Lichteinstrahlung.</li>
</ol>3. blaue Licht Phototherapie
<ol><li>Vor der Bestrahlung von Zellen, aktivieren Sie das blaue Licht Gerät (z.B., Light Emitting Diode, Leuchtstofflampen oder Halogenlicht) und führen Sie einen Zyklus lang (1.000 s) zum Aufwärmen des Gerätes. Das blaue Licht Gerät hätte eine Output-Wellenlänge von 417 + /-5 nm. Wodurch das Gerät für einen Zyklus vor der Behandlung laufen sorgt dafür, dass das blaue Licht-Wellenlänge und Bestrahlungsstärke innerhalb der photoaktivierungen-Phase konsistent sind.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Photometer zur Messung der Bestrahlungsstärke an der Zelloberfläche. Die blaue Licht Bestrahlungsstärke an der Zelloberfläche sollte 10 mW/cm2. Der Abstand zwischen dem Licht und der Zellen müssen möglicherweise angepasst werden, um eine Bestrahlungsstärke von 10 mW/cm2 abhängig von der Intensität der Lichtquelle zu erreichen.</li>
	<li>Legen Sie 0, 0.5, 1 und 2 mM ALA Behandlungsgruppen auf eine schwarze Fläche unter der blauen Lichtquelle. Bestrahlen die Zellen mit blauem Licht für 1.000 s (16 min und 40 s) für eine totale Fluence von 10 J/cm2. Nach blauen Licht photoaktivierungen sind die Zellen für die Analyse bereit.</li>
</ol>4. Erhebung und Färbung
<ol><li>Bereiten Sie Flow-Puffer nach Herstellerrichtlinien (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Aspirieren Sie Kulturmedium und waschen Zellen mit 2 mL PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA und lassen Sie Zellen, ca. 3-5 Minuten zu lösen. Die Zellen können unter dem Mikroskop Zelle Ablösung bestätigen untersucht werden.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL Kulturmedium (oder PBS) mit 10 % fötalen Rinderserum, die Trypsin zu deaktivieren.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellsuspension in beschrifteten 5 mL Messrohre.</li>
	<li>Drehen Sie 5 mL strömungsrohr in einer Zentrifuge bei 201 X g für 5 min. Aspirat Lösung ohne Zelle Pellet.</li>
	<li>Jede Probe 200 µL fließen Puffer mit konjugierten annexin V Antikörper (1 µL annexin v pro 39 µL fließen Puffer) hinzufügen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen und in den Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) für 20 min annexin V Bindung zu ermöglichen.</li>
	<li>Jede Probe 3 µL 7-AAD hinzufügen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
</ol>5. durchflusszytometrischen Analyse
<ol><li>Flow Cytometer Hersteller Richtlinien für die Aufstellung (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Erfassen Sie und analysieren Sie Proben mit Durchflusszytometrie. 13
</li>
	<li>Führen Sie statistische Vergleich Behandlungs-und Kontrollgruppen mit Varianzanalyse (ANOVA)14. Vergleichen Sie die Mittel von den Behandlungsgruppen zum Mittelwert des Steuerelements mit einem Dunnett-Test für die post-Hoc Analyse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Dermatology+Forum+guidelines+on+topical+photodynamic+therapy.">European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy.</a> European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).</li><li>Ozog, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+clinical+consensus+guide.">Photodynamic therapy: A clinical consensus guide.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).</li><li>Abrahamse, H., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy.">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li><li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+and+the+development+of+metal-based+photosensitisers.">Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers.</a> Metal-Based Drugs. 2008, 276109 (2008).</li><li>Ohgari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+involved+in+&#948;-aminolevulinic+acid+(ALA)-induced+photosensitivity+of+tumor+cells:+Relation+of+ferrochelatase+and+uptake+of+ALA+to+the+accumulation+of+protoporphyrin.">Mechanisms involved in &#948;-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin.</a> Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).</li><li>Kessel, D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+photodamage+and+PDT-induced+apoptosis.">Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).</li><li>Goldberg, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+skin+rejuvenation.">Photodynamic therapy in skin rejuvenation.</a> Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).</li><li>Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+acne+vulgaris:+A+critical+review+from+basics+to+clinical+practice:+Part+I.+Acne+vulgaris:+When+and+why+consider+photodynamic+therapy.">Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).</li><li>Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+acne:+An+evidence-based+review.">The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).</li><li>Allison, R. R., Moghissi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncologic+photodynamic+therapy:+Clinical+strategies+that+modulate+mechanisms+of+action.">Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).</li><li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+ultra+short+photodynamic+therapy:+heating+fibroblasts+during+sub-30-minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+increases+photodynamic+therapy-induced+cell+death.">Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).</li><li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+ultra+short+sub-30+minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+vitro.">Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+Annexin+V+and+Propidium+Iodide+Labeling.">Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+impact+of+thermal+aminolaevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+apoptosis+and+reactive+oxygen+species+generation+in+human+dermal+fibroblasts.">Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts.</a> British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).</li><li>Gilaberte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+intrinsic+factors+involved+in+the+resistance+of+squamous+cell+carcinoma+to+photodynamic+therapy.">Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).</li><li>Yoon, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanophotosensitizers+engineered+to+generate+a+tunable+mix+of+reactive+oxygen+species,+for+optimizing+photodynamic+therapy,+using+a+microfluidic+device.">Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device.</a> Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).</li><li>Chen, Y. -. C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cancer+cell+sphere+formation+for+characterizing+the+efficacy+of+photo+dynamic+therapy+in+3D+cell+cultures.">High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures.</a> Scientific Reports. 5, 12175 (2015).</li><li>Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+PDT+on+breast+cancer+spheroids.">Low-dose PDT on breast cancer spheroids.</a> Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature+on+5-aminolevulinic+acid-based+photodynamic+reaction+in+keratinocytes+in+vitro.">The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro.</a> Photodermatology, Photoimmunology &amp; Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).</li><li>Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+Accumulation+of+protoporphyrin+IX+after+topical+application+of+5-aminolevulinic+acid+and+its+methylester+and+hexylester+derivatives+in+normal+mouse+skin.">Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).</li><li>Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+different+illumination+parameters+on+protoporphyrin+IX+induced+cell+death+in+squamous+cell+carcinoma+cells.">The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).</li></ol>

DUSA/Sun Pharma 5-ALA und dem BLU-U leichte Gerät zur Verfügung. Dieses Manuskript wurde von Dr. Jagdeo Restwert unterstützt Finanzierung. Den Inhalt repräsentieren nicht die Ansichten des US-Department of Veterans Affairs oder Regierung der Vereinigten Staaten.

Gab es ein deutlichen Anstieg der SCC-13 Apoptose nach 30 min Inkubationen von 0,5, 1 und 2 mM 5-ALA gefolgt von 1.000 s von blauem Licht. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit unseren bisher veröffentlichten Untersuchungen zeigen, dass 5-ALA Inkubationen von 30 min, gefolgt von blauem Licht Aktivierung führt zu eine dosisabhängige Zunahme des Anteils der fibroblastenzellen Apoptose12, 14.
Diese experimentellen Umgang mit Studium PDT hat Vorteile und Einschränkungen. Die beschriebenen Methoden entsprechen den klinischen Praxis als handelsübliche PS und Lichtquelle dienten. Forscher können die Methoden mit verschiedenen Zelltypen, PSs, Lichtquellen und Bestrahlung Parameter anpassen. Allerdings gibt es Grenzen dieses Ansatzes, da dieses Protokoll für adhärente Zellen kultiviert in einem monomolekularen Film konzipiert wurde. In der klinischen Praxis können Unterschiede im Gewebe Architektur oder Krankheit Pathologie (z.B. Hyperkeratose oder Fibrose) PS Aufnahme verringern oder ein leichtes Eindringen15. Infolgedessen können die Behandlung Dosen und experimentelle Befunde nicht direkt in die klinische Praxis entsprechen. Sphäroid Tumormodellen und Mikrofluidik-Chip sind als Methoden genauer Tumor Mikroumgebungen16,17,18replizieren untersucht worden. Sphäroide haben innere und äußere zelluläre Nischen, die differentiell integrieren die Photosensibilisatoren und heterogener Tumor Architektur darstellen. Andere Forscher haben mikrofluidischen Chips auf Bildschirm Behandlungsbedingungen und vaskuläre Auslieferung von Photosensibilisatoren verwendet. Mikrofluidische Chips können jedoch zu kostspielig oder schwierig zu implementieren für Forscher nicht mit der Technik vertraut sein. Darüber hinaus können Sphäroide und mikrofluidischen Chips nicht die klinische Behandlung von Hautkrebs wider Photosensibilisatoren in denen direkt an die Tumor-Oberfläche ohne vaskuläre Verbreitung angewendet werden. Forscher müssen die vor- und Nachteile der Monolayer Kultur, Sphäroid Tumormodellen und mikrofluidischen Chips für Studium PDT in verschiedenen Krankheiten Systeme zu bewerten. Da gibt es keine Immunzellen oder extrazelluläre Matrix, ist es nicht möglich festzustellen, wie PDT komplexe Zell-Zell-Interaktionen auswirkt. Forscher müssen in Vitro experimentellen Ergebnisse mit Tiermodellen und klinischen Studien bestätigen. Um hohe Inter Test Validität zu erreichen, ist es wichtig, einheitliche Inkubation und Lichtparameter erhalten beim in-vitro- PDT Experimente durchführen.
Temperatur ist bekannt, die Wirksamkeit von PDT19zu ändern. Eine Studie zeigte, dass Zelltod, 5-ALA-Aufnahme, PP-IX Bildung und Freisetzung von Zytokinen durch Inkubation der Zellen mit 5-ALA bei Temperaturen bis auf 44 ° C19verbessert werden können. Inkubation Temperaturen über 44 ° C zu thermisch induzierte Zelltod führen können, und Inkubation Temperaturen unter 20 ° C können nicht führen zu erheblichen 5-ALA-Aufnahme und Akkumulation19. Es wird empfohlen, Forscher PS Inkubationen auf eine Temperatur regulierbare Heizung-Block bei einer konstanten Temperatur zu steuern für potenziell verwirrende thermische Effekten führen. Darüber hinaus ist es wichtig, für eine ausreichende Menge an Zeit, um die Umwandlung von 5-ALA in PP-IX ermöglichen dem Photosensitizer inkubieren. In diesem Protokoll wurden SCC-13 Zellen mit 5-ALA für 30 min inkubiert, die erfolgreich Zelle Apoptose induziert. Wir haben bereits gezeigt, dass eine 10 min Inkubation von 5-ALA Apoptose in Fibroblasten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle Fibroblasten11,14nicht signifikant erhöhen. PP-IX beginnt in Maus Haut ansammeln, nach 5-ALA für sechs Minuten bei 37 ° c inkubieren ist Daher, nach zehn Minuten 5-ALA Inkubation möglicherweise nicht ausreichend Anhäufung von PP-IX, Zelle Apoptosis20zu induzieren. Es wird empfohlen, eine minimale Inkubationszeit von 20 bis 30 min für 5-ALA basierend auf unseren bisherigen Studien11,14. Forscher müssen möglicherweise Inkubationszeit basierend auf das Labor, Photosensitizer, Zelltyp und klinischer Indikation zu optimieren. Antikörper-Titration und Optimierung-Experimente können für beste Ergebnisse mit Hersteller-Richtlinien durchgeführt werden. Andere Tests von Interesse können nach blauen Licht photoaktivierungen einschließlich Dihydroethidium Fluss durchflusszytometrischen Quantifizierung von ROS durchgeführt werden. 14
Variation in Höhe von Licht pro Flächeneinheit (d. h. Bestrahlungsstärke) geliefert und die gesamten Bestrahlungsdosis (d. h. Fluence) in der photoaktivierungen Phase beeinträchtigen ROS-Bildung und Zelle Apoptosis21. Die Beziehung zwischen Fluence, Bestrahlungsstärke und Zeit kann durch die folgende Gleichung beschrieben:
Fluenz (J/cm2) = Bestrahlungsstärke (W/cm2) x Zeit (s)
Fluenz Zeit abhängig ist, kann Verlängerung oder Verkürzung der photoaktivierungen Phasen Wirksamkeit der Behandlung ändern. Die Bestrahlungsstärke ist proportional zum Abstand zwischen der Lichtquelle und das Zielgewebe im Quadrat. Infolgedessen, wenn das Licht zu weit weg ist, möglicherweise nicht genügend Lichtenergie geliefert, das Zielgewebe begeistern die PS. Alternativ kann die Bestrahlungsstärke um Licht reflektiert die umgebenden Flächen erhöht werden. Daher empfehlen wir leichte Bestrahlungen mit den Zellplatten Kultur gelegt auf eine schwarze Fläche, Lichtreflexion zu verhindern. Forscher können kommerziell verfügbar oder FDA-zugelassene blaue Leuchtdioden und fluoreszierende Geräte für Versuchszwecke PDT erwerben, sondern diese Geräte möglicherweise verschiedene Leistungsstufen und Lichtfeld Einheitlichkeit. Eine Wellenlänge-spezifischen Photometer sollte verwendet werden, um die Bestrahlungsstärke auf der Zelloberfläche und Gleichmäßigkeit des Lichtfeldes vor jedem Experiment für konsistente Ergebnisse zu messen. Ein handelsüblicher Diffusor kann zur Feld Einheitlichkeit zu erhöhen bei Bedarf.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir einen in-vitro- Ansatz für die Untersuchung von PDT durch Detaillierung Theorie, experimentelle Methoden, Einschränkungen, potenzielle Fallstricke und Empfehlungen für die Optimierung beschrieben. PDT ist eine nützliche klinischen Verfahren und in-vitro- Forschung für die Entwicklung von neuartigen PSs, Optimierung von Protokollen und neue Indikationen für PDT erlauben kann.

Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS), gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Zelle Apoptose induzieren. Die Federal Drug Administration (FDA) genehmigt PDT zur Behandlung von aktinischen Keratosen (AK) und klinische Leitlinien empfehlen PDT als Behandlung für bestimmte nicht-Melanom-Hautkrebs und Akne Vulgaris1,2. Aufstrebenden nicht-dermatologische Anwendungen für PDT sind Behandlung von Magen-Darm-, Prostata- und gynäkologischen Krebserkrankungen3. PDT ist eine vorteilhafte therapeutische Modalität wie niedrige Kosten, nicht-invasive und minimale Nebenwirkungen und Narbenbildung2zugeordnet.
Im ersten Schritt der PDT ist ein PS angewendet und akkumulieren intrazellulär2erlaubt. In den USA ist aktuell 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) häufig zur Behandlung von AKs. Während der Inkubation wird Phase 5-ALA in Protoporphyrin IX (PP-IX) über den Häm-Biosynthese-Weg im eingebauten Zellen3umgewandelt. Krebs und Pre-Krebszellen gesunken Ferrochelatase Aktivität, die das Endprodukt Protoporphyrin IX (PP-IX) umwandelt, Häm. Krebs Zellen ansammeln infolgedessen PP-IX im Vergleich zu normalen Zellen4,5. Diese Anhäufung von PP-IX in Krebs und Pre-Krebszellen im Verhältnis zu dem umgebenden Gewebe ermöglicht eine PDT ein gezieltes Vorgehen mit minimalen Nebenwirkungen zu sein. Lichteinstrahlung führt zu reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Generation wenn Sauerstoff angeregten Elektronen aus PP-IX annimmt. PP-IX hat eine Spitze Absorption im UV-Spektrum mit kleineren Gipfel während des sichtbaren Lichtspektrums, darunter blau und rot Licht2. ROS-Bildung führen letztlich zu zellapoptose, Membran Störung, mitochondriale Schäden, Immunmodulation, Proliferation von Keratinozyten und Kollagen Umsatz6,7,8,9 , 10.
PDT wurde in den 1970er Jahren entwickelt und ist eine sich entwickelnde therapeutische Modalität3. Das Protokoll FDA-Zulassung für die Behandlung von AKs empfiehlt 5-ALA Haut Inkubation für 14 – 18 h, aber 1 bis 2 h Inkubationen sind weit verbreitet in der klinischen Praxis2. In Vitro, haben wir gezeigt, dass kürzere 15 min 5-ALA Inkubationen Fibroblasten zellapoptose im Vergleich zu unbehandelten Fibroblasten11,12erhöhen können. Darüber hinaus werden neuartige Chlorin, Phthalocyanin und Nanopartikel basierende PSs untersucht, um PDT Wirksamkeit3zu verbessern. Hier präsentieren wir eine in-vitro- Methode für ein Studium PDT in eine anhaftende Plattenepithelkarzinom Zellen. In diesem Protokoll sind SCC-13 Zellen inkubiert mit 0, 0.5, 1.0 und 2 mM 5-ALA für 30 min und photoaktiviert mit 417 nm blaue Licht für 1.000 s. Das primäre Ergebnis Maß ist Apoptose und Nekrose, annexin V und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) Durchflusszytometrie gemessen. Dieses Behandlungsprotokoll PDT simulieren soll und kann angepasst werden, um die Anwendung der PDT mit anderen Zelllinien, Photosensibilisatoren, Inkubation Temperaturen oder photoaktivierungen Wellenlängen zu studieren. Vorbereitung der zusätzliche Kontrollgruppen möglicherweise erforderlich, einschließlich ungefärbten, einzelne Fluorophor gebeizt, negative und positive Kontrollen für Durchflusszytometrie. Eine umfassende Überprüfung der Theorie, Protokolle, Versuchsplanung und gating für Apoptose/Nekrose Durchflusszytometrie finden Sie ebenfalls13.

<table><tbody><tr><td>Keratinocyte serum free medium&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17005042</td><td>Culture medium for SSC-13 cells</td></tr><tr><td>DMEM low glucose glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>10567022</td><td>Possible culture medium for other cell types</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Thermofisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td>For cell counting and plating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BLU-U light&amp;nbsp;</td><td>DUSA</td><td>Request from manufacturer</td><td>Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5-ALA</td><td>DUSA</td><td>Request from manufacturer</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>C17032</td><td></td></tr><tr><td>FlowCellect Annexin Red Kit</td><td>Millipore Sigma&amp;nbsp;</td><td>FCCH100108&amp;nbsp;</td><td>Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer</td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD</td><td>Request from manufacturer</td><td>Any flow cytometer may be used&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Counting Chamber</td><td>Hausser</td><td>3120</td><td>For cell counting and plating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>Request from manufacturer</td><td>Flow cytometry analysis software</td></tr></tbody></table>

an in vitro approach to photodynamic therapy

Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS), gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Zelle Apoptose induzieren. Der Federal Drug Administration genehmigt PDT zur Behandlung von aktinischen Keratosen und klinischen Leitlinien empfehlen PDT als Behandlung für bestimmte nicht-Melanom-Hautkrebs und Akne Vulgaris. PDT ist eine vorteilhafte therapeutische Modalität wie niedrige Kosten, nicht-invasiv, und mit minimalen Nebenwirkungen verbunden und erschrecken. Im ersten Schritt der PDT ist ein PS angewendet und intrazellulär sammeln. Nachfolgende Lichtbestrahlung induziert reaktive Sauerstoff Spezies Formation, die letztlich zur zellapoptose, Membran-Störung, mitochondriale Schäden, Immunmodulation, Proliferation von Keratinozyten und Kollagen Umsatz führen. Hier präsentieren wir Ihnen eine in-vitro- Methode für ein Studium PDT in eine adhärente Zell-Linie. Dieses Behandlungsprotokoll PDT simulieren soll und kann angepasst werden, um die Anwendung der PDT mit verschiedenen Zelllinien, Photosensibilisatoren, Inkubation Temperaturen oder photoaktivierungen Wellenlängen zu studieren. Plattenepithelkarzinom Zellen inkubiert mit 0, 0.5, 1.0 und 2 mM 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) für 30 min und photoaktiviert mit 417 nm blaue Licht für 1.000 s. Die primären Endpunkt Maßnahme war Apoptose und Nekrose, annexin V und 7-Aminoactinomycin D Durchflusszytometrie gemessen. Es gab eine dosisabhängige Zunahme der zellapoptose nach 30-minütiger Inkubation von 5-Ala. Um hohe Inter Test Validität zu erreichen, ist es wichtig, einheitliche Inkubation und Lichtparameter erhalten beim in-vitro- PDT Experimente durchführen. PDT ist eine nützliche klinischen Verfahren und in-vitro- Forschung für die Entwicklung von neuartigen PSs, Optimierung von Protokollen und neue Indikationen für PDT erlauben kann.

Nach SCC-13 Zellen waren für 30 min mit 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA inkubiert und bestrahlt mit 1.000 s blaues Licht, gab es eine dosisabhängige Zunahme der zellapoptose. Insgesamt Apoptose (Mittelwert ± Standardfehler von Mittelwert) betrug 3,94 ± 0,34 7,90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 und 38.33 ± 1,81 nach 30 min Inkubation mit 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA, bzw. 1000 Sekunden blau Licht (Abbildung 1). Den mittlere Anteil der Apoptotic Zellen unter 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA inkubierten Gruppen ANOVA verglichen. Zellen mit 1 und 2 mM 5-ALA behandelt hatte eine deutliche Steigerung bei der Apoptose der Zelle im Vergleich zu 0 mM 5-ALA behandelten Zellen. Abbildung 2A zeigt repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Anspritzung forward Scatter (FSC) versus Side Scatter (SSC) für SCC-13 Zellen inkubiert mit 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-Ala Der Kreis Anspritzung umschließt die SCC-13-Zell-Population. Für dieses Experiment 7500 Ereignisse wurden gesammelt und das SCC-13 Zelle Bevölkerung Tor gefangen zu mindestens 90 % der Ereignisse. Abbildung 2 b zeigt eine repräsentative Handlung des 7-AAD auf der x-Achse und annexin V auf der y-Achse. Die Zell-Populationen sind in vier Quadranten gated (Q1 bis Q4) apoptotische Zellen zu unterscheiden. Q1 (hohe annexin V, niedrige 7-AAD) stellt Zellen frühen Apoptose unterziehen. Q2 (hohe annexin V, hohe 7-AAD) repräsentieren Zellen späten Apoptose und Nekrose. Q3 (niedrige annexin V, hohe 7-AAD) stellt Zellen Nekrose. Q4 (niedrige annexin V, niedrige 7-AAD) stellt Zellen nicht unterziehen Apoptose und Nekrose. Um den Prozentsatz der Zellen Apoptose zu berechnen, haben wir den Prozentsatz der Zellen in Q1 und Q2. Inkonsistenz in 5-ALA Inkubation Periodenlänge, Inkubationstemperatur oder photoaktivierungen Bestrahlungsdosis kann PDT Wirksamkeit ändern. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative annexin V und 7-AAD Fluss durchflusszytometrischen Handlung, wenn die Inkubationstemperatur variiert wird (d.h., 27, 36 und 42 ° C). Es gab eine abhängige Temperaturerhöhung in Apoptose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Abbildung 1: dosisabhängige Zunahme der Apoptose nach 30-minütiger Inkubation von 5-Ala 5-ALA inkubiert bei 36 ° C für 30 Minuten gefolgt von 1.000 s von blauem Licht in SCC-13 Zellen. Balken stehen für durchschnittliche prozentuale annexin V positive Zellen in jeder Behandlung und Kontrollgruppe. Experimente wurden in technischen dreifacher durchgeführt. Statistischer Signifikanz wurde bestimmt durch ANOVA, p < 0,05, die mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Abbildung 2: Vertreter Flow Cytometry Grundstücke. (A) repräsentative forward Scatter vs. Seite zytometrie Streudiagrammen in willkürlichen Einheiten (AU) für x- und y-Achse für 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA inkubierten Zellen. Für dieses Experiment 7500 Ereignisse wurden gesammelt und das SCC-13 Zelle Bevölkerung Tor erfasst 90 % der Ereignisse. (B) repräsentative annexin V vs. 7-AAD Durchflusszytometrie Grundstücke in AU für x- und y-Achse für 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA inkubierten Zellen. Q1: frühen Apoptotic Zellen, Q2: späten Apoptotic/nekrotischen Zellen, Q3: nekrotische Zellen und Q4: lebensfähige Zellen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Abbildung 3: 5-ALA bei unterschiedlichen Temperaturen Bebrüten PDT Wirksamkeit vorbehalten. Repräsentative annexin V vs. 7-AAD Durchflusszytometrie Grundstücke in AU für x- und y-Achse für SCC-13 Zellen inkubiert mit 0,5 mM 5-ALA auf 27, 36 und 42 ° C. Q1: frühen Apoptotic Zellen, Q2: späten Apoptotic/nekrotischen Zellen, Q3: nekrotische Zellen und Q4: lebensfähige Zellen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS) gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Apoptose induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine in-vitro- PDT-Protokoll PDT zu simulieren, die verwendet werden, um Unterschiede in PS Inkubation und Lichtbehandlung Parameter untersuchen soll.

Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

8.6K Aufrufe.  University of California, Davis. Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS) gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Apoptose induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine in-vitro- PDT-Protokoll PDT zu simulieren, die verwendet werden, um Unterschiede in PS Inkubation und Lichtbehandlung Parameter untersuchen soll.

Serie: An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Forschung

Medizin

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.

This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).

Photodynamische Therapie mit Blended leitendes Polymer / Fullerene Nanopartikel Photosensibilisatoren

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

Chemie

5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Primary Bone Tumor and Bone Metastases Cell Lines

Bone metastases are associated with poor prognosis and low quality of life for the affected patients. Photodynamic therapy (PDT) emerges as a noninvasive therapy that can target local metastatic bone lesions. This paper presents an in vitro method to study the PDT effect in adherent cell lines. To this end, we demonstrate a step-by-step approach to subject both primary (giant cell bone tumor) and human bone metastatic cancer cell lines (derived from a primary invasive ductal breast carcinoma and renal carcinoma) to 5-aminolevulinic acid (5-ALA)-mediated PDT. 
After 24 h post 5-ALA-PDT irradiation (blue light-wavelength 436 nm), the therapeutic effect was assessed in terms of cell migration potential, viability, apoptotic features, and cellular growth arrest (senescence). Post 5-ALA-PDT irradiation, musculoskeletal-derived cell lines respond differently to the same doses and exposure of PDT. Depending on the extent of cellular damage triggered by PDT exposure, two different cell fates-apoptosis and senescence were noted. Variable sensitivity to PDT therapy among different bone cancer cell lines provides useful information for selecting more appropriate PDT settings in clinical settings. This protocol is designed to exemplify the use of PDT in the context of musculoskeletal neoplastic cell lines. It may be adjusted to investigate the therapeutic effect of PDT on various cancer cell lines and various photosensitizers and light sources.

<meta charset="utf8"></head><body>5-Aminolävulinsäure-vermittelte photodynamische Therapie an primären Knochentumor- und Knochenmetastasenzelllinien

This protocol presents a step-by-step methodological approach of exposing bone metastatic cells lines and primary bone tumors to 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy (PDT). The effects on cell migration potential/invasiveness, viability, apoptosis, and senescence potential are also analyzed following PDT exposure.

5-Aminolävulinsäure-vermittelte photodynamische Therapie an primären Knochentumor- und Knochenmetastasenzelllinien

Bone metastases are associated with poor prognosis and low quality of life for the affected patients. Photodynamic therapy (PDT) emerges as a noninvasive ...

Krebsforschung

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen<em&gt; In-vitro-</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Biotechnik

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built using a set of conventional programmable light-emitting diodes (LEDs), a liquid crystal display (LCD) module, and a light sensor connected to a commercial microcontroller board. The box-based structure of the prototype was made with medium-density fiberboards (MDFs). The internal compartment can simultaneously allocate four cell culture multiwell microplates.
As a proof of concept, we studied the cytotoxic effect of the photosensitizer (PS) verteporfin against the HeLa cell line in two-dimensional (2D) culture. HeLa cells were treated with increasing concentrations of verteporfin for 24 h. The drug-containing supernatant medium was discarded, the adherent cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS), and drug-free medium was added. In this study, the effect of verteporfin on cells was examined either without light exposure or after exposure for 1 h to light using red-green-blue (RGB) values of 255, 255, and 255 (average fluence of 49.1 &#177; 0.6 J/cm2). After 24 h, the cell viability was assessed by the 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.
Experimental results showed that exposure of cells treated with verteporfin to the light from the device enhances the drug&#39;s cytotoxic effect via a mechanism mediated by reactive oxygen species (ROS). In addition, the use of the prototype described in this work was validated by comparing the results with a commercial PDT device. Thus, this LED-based photodynamic therapy prototype represents a good alternative for in vitro studies of PDT.

Here, we describe a novel, simple, and low-cost device to successfully perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays using two-dimensional HeLa cell culture and verteporfin as a photosensitizer.

Ein selbst gebautes photodynamisches Therapiegerät auf Basis von Leuchtdioden zur Verbesserung der Verteporfin-Zytotoxizität in einem 2D-Zellkulturmodell

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

Biochemie

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic chemotherapy due to their precise spatiotemporal activation by directing a benign, non-ionizable light to a specific location within the patient&#39;s body. This paper presents a set of methods to evaluate the in vitro potency and ex vivo efficiency of the photoactivation of photocontrolled, biologically active compounds as well as the in vivo efficacy at early stages of drug development. The methodology is applied to anticancer cytotoxic peptides, namely, the diarylethene-containing analogs of a known antibiotic, gramicidin S. The experiments are performed using 2D (adherent cells) and 3D (spheroids) cell cultures of a cancer cell line (Lewis lung carcinoma, LLC), live tissue surrogates (pork meat mince), and an allograft cancer model (subcutaneous LLC) in immunocompetent mice. The selection of the most effective compounds and estimation of realistic phototherapeutic windows are performed via automated fluorescence microscopy. The photoactivation efficiency at varying illumination regimens is determined at different depths in a model tissue, and the optimal light dosage is applied in the final therapeutic in vivo experiment.

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

This protocol presents a set of experiments adopted for the evaluation of photoswitchable anticancer peptides, that can be used in the preclinical screening of such compounds. This includes cytotoxicity assessment in 2D and 3D cell cultures, the evaluation of ex vivo (model tissue) photoisomerization efficiency, and in vivo efficacy.

In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

LED-Based In Vitro Screening for Assessing Photoactivable Molecules in Bacterial Photodynamic Inactivation

The rise of multi-drug-resistant infections and the lack of new antibiotic classes have renewed interest in alternative therapies like photodynamic inactivation of bacteria (aPDI). This process involves the administration of a photosensitizer (PS) activated by a suitable visible light source, producing exacerbated levels of reactive oxygen species (ROS) that damage crucial cellular biomolecules, ultimately causing bacterial cell death. It is crucial to create standardized, easy-to-use, and reproducible initial tests to assess and compare the effectiveness of light-induced phototoxicity of potential photosensitizers. This study introduces a simple and efficient in vitro technique for assessing photodynamic activity against planktonic bacterial cells. By employing a 96-well microplate format along with a large LED panel, the system facilitates the systematic evaluation of various compounds. Such a configuration allows for high-throughput screening of potential photosensitizers in a controlled and consistent environment, simplifying the process of identifying promising candidates for further development. This flexible platform serves as an important step in advancing the development of innovative photodynamic therapies for managing antibiotic-resistant infections.

This protocol describes a straightforward and economical method for evaluating the effectiveness of potential photosensitizers in antibacterial photodynamic inactivation (aPDI), using a 96-well plate format combined with an LED panel light source. This approach enables the simultaneous testing of multiple experimental conditions, including different concentrations, compounds, and bacterial strains.

LED-basiertes In-vitro-Screening zur Beurteilung photoaktivierbarer Moleküle bei bakterieller photodynamischer Inaktivierung

The rise of multi-drug-resistant infections and the lack of new antibiotic classes have renewed interest in alternative therapies like photodynamic ...

In Vitro Phototoxicity Assay: A PDT-based Method to Evaluate the Phototoxic Potential of a Photosensitizer in Lung Cancer Cells

Source: Chang, J. E., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54865/anticancer-efficacy-photodynamic-therapy-with-lung-cancer-targeted">Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016).
Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light. In this protocol video, PDT-based method is used to evaluate the phototoxic potential of a potential photosensitizer in lung cancer cells.

Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie

Zusammenfassung

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5-Aminolävulinsäure-vermittelte photodynamische Therapie an primären Knochentumor- und Knochenmetastasenzelllinien

5-Aminolävulinsäure-vermittelte photodynamische Therapie an primären Knochentumor- und Knochenmetastasenzelllinien

Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

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LED-basiertes In-vitro-Screening zur Beurteilung photoaktivierbarer Moleküle bei bakterieller photodynamischer Inaktivierung

In vitro Phototoxizitäts-Assay: Eine PDT-basierte Methode zur Bewertung des phototoxischen Potenzials eines Photosensibilisators in Lungenkrebszellen