Name: acellular and cellular lung model to study tumor metastasis
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
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Min. P. Kim erhalten Zuschüsse aus der zweiten John W. Kirklin Forschungsstipendium, American Association for Brust-Chirurgie, Graham Foundation, Houston Methodist Spezialität Arzt Forschungsgruppe Grant, und Michael M. und Joann H. Kegel-Forschungspreis. Wir danken Ann Saikin für die Sprache Bearbeitung des Manuskripts.

Die Protokolle für Tierversuche wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Houston Methodist Research Institute genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit allen Vorschriften, Gesetze, Richtlinien und Richtlinien.
1. Rat Lunge Ernte
<ol><li>Ein 4 bis 6 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley Ratten durch eine intraperitoneale (IP) Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) in seine Flanke zu betäuben. Narkose durch die Suche nach einer Abwesenheit von Bewegung bei die hinteren Gliedmaßen Zehe mit Zange gequetscht ist zu gewährleisten.</li>
	<li>Rasieren Sie nach 10 min, Brust und Bauch und wischen Sie die Haut mit einem Chlorhexidin-Tupfer.</li>
	<li>Abziehen Sie die Haut, indem Sie es sich mit der Pinzette und mit einem Einweg Skalpell einritzen. Führen Sie nach der Eröffnung der Brusthöhle durch Eingrabung mit Skalpell eine bilaterale Thorakotomie von der vorderen Seite des Brustkorbes auf der linken und der rechten Seite der Membran mit einer Schere schneiden. Hinweis: Dies ist eine Operation nicht überleben.</li>
	<li>Halten Sie den Brustkorb und Spritzen Sie 2 mL Heparin (1.000 Einheiten/mL) in die Rechte Herzkammer des schlagenden Herzens mit Hilfe einer Nadel 27 G. Hinweis: Dies wird Bildung von Blutgerinnseln in der Lunge verhindern.</li>
	<li>Vollständig zu entfernen Sie den Brustkorb mit einer Schere und platzieren Sie eine 18 G-Nadel in der linken Herzkammer wie ein Schlot, bis Blut herauskommt. Dann Spritzen Sie 15 mL heparinisierten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (12,5 Einheiten/mL; heparinisierten PBS) in die Rechte Herzkammer mit einer 25 G Nadel.</li>
	<li>Schneiden Sie der minderwertigen und überlegenen Vena Cava, zwei große Venen auf der rechten Seite des Herzens, und spülen Sie die Lunge mit einer zusätzlichen 10 mL heparinisierten PBS in der rechten Herzkammer mit einer 27 G Nadel. Hinweis: Die minderwertige Vena Cava ist unter dem Boden des Herzens als eines großen Schiffes visualisiert mit rotem Blut gefüllt. Ebenso ist die überlegene Vena Cava im oberen Teil des Herzens als eines großen Schiffes visualisiert.</li>
	<li>Schneiden Sie die Luftröhre, an der Basis der Schilddrüse. Entfernen Sie vorsichtig die absteigende Aorta auf der Ebene der Truncus Vene und Äste der Aorta am Arch.</li>
	<li>Nehmen Sie die Herz-Lungen-Block aus der Brusthöhle und dem Rest des Körpers Ratte.</li>
	<li>Führen Sie Ventriculotomy durch Schneiden, die Hälfte der rechten und linken Ventrikel und legen Sie eine maßgeschneiderte vorgefüllten 18 G Edelstahl-Nadel Kanüle durch den rechten Ventrikel in den wichtigsten Pulmonalarterie (PA).</li>
	<li>Sichern Sie die Kanüle mit einer 2: 0-Seidenkrawatte und setzen Sie sorgfältig den rechten Ventrikel und Atrium.</li>
	<li>Legen Sie ein weiblicher Luer-SCHOTT in der linken Herzkammer und sichern Sie es mit einer 2: 0-Seidenkrawatte.</li>
	<li>Spülen Sie die Herz-Lungen-Block mit 20 mL heparinisierten PBS durch die PA-Kanüle und legen Sie sie in ein 50 mL-Tube mit Nährmedien oder heparinisierten PBS. Hinweis: Gehen Sie zu Schritt 3.1 Einrichten des Bioreaktors, für ein Handy-Modell. Fahren Sie bei einem azellulären Modell mit Schritt 2.1 für die Decellularization.</li>
</ol>2. Lunge Decellularization
<ol><li>
Vorbereitung des Referats decellularization
	<ol>
<li>Bereiten Sie jede Decellularization Kammer/Flasche durch piercing zwei Löcher in die Kronkorken und schnappte ein weiblichen Luer in die Löcher (Abb. 1A und 1 b). Sichern Sie ihn mit einem schwarzen Nylon-Ring auf der anderen Seite. In ähnlicher Weise, Bohren Sie ein einziges Loch in ein anderes Kronkorken für die intravenöse Set Anlage (Abbildung 1). Hinweis: Abbildung 1A und 1 b sind von der gleichen Kronkorken von zwei verschiedenen Seiten. Abbildung 1 ist eine andere Kappe mit einem Loch im Schritt 2.1.1 dargelegten.</li>
		<li>Legen ein 0,5 Zoll Rohr (in der Lungenarterie oder PA-Ende) und 6-Zoll-Rohre (Abbildung 1J) auf einen weiblichen Luer von innen die Kronkorken (Abbildung 1A und 1 b) und befestigen Sie einen männlichen Luer-Lock an den Enden. Legen Sie die Sperre mit einer 500 mL Flasche, als der Decellularization Kammer/Flasche.</li>
		<li>Schließen Sie ein Ende der zwei Röhren von 2 ft (verbunden mit einem männlichen Luer-Lock) an beiden Enden der Pumpenrohr (Abbildung 1 H), die auf den Pumpenkopf (Abbildung 1E und 1F) mit einer Patrone (Abbildung 1) mit einem weiblichen Luer befestigt wird Sperre (Abbildung 1I).</li>
		<li>Verbinden Sie die anderen Enden der 2 ft Röhren (von Schritt 2.1.3) jeweils zu einem weiblichen Luer Lock Kopf auf die Decellularization Kammer/Kronkorken (Abbildung 1 L).</li>
		<li>Richten Sie ein 250 mL heparinisierten PBS Flasche (mit 200 mL PBS) durch den Strang einer umgekehrten Flasche auf einem Ständer mit dem proximalen Ende des Fahrgast-/intravenöse (Abbildung 1), eingefügt in die Kronkorken und dem distalen Ende, verbunden mit der Decellularization c 2 ft-Rohr zu ersetzen Hamber/Flasche PA Ende (Abbildung 1 b). Schließen Sie diese 2 ft Schlauch bis zur Flasche entsorgen. Hinweis: Die Flaschen werden im Karton, festgelegt, wie in Abbildung 1 Kdargestellt. Die intravenöse Rohre kommen aus den hängenden Flaschen Reagenzien in der Lunge Gerüst zu verzichten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lung Decellularization Prozess
	<ol>
<li>Laufen Sie die heparinisierten PBS bei einem physiologischen Durchblutung Druck von 30 mm Hg (Abbildung 1 K), bis es frei in der Decellularization Kammer/Flasche fließt und dann befestigen Sie die Herz-Lungen-Block bis zum PA-Ende durch die PA-Kanüle.</li>
		<li>Zu halten, läuft die Pumpe ständig, so dass überschüssige Pufferlösung in der Decellularization Kammer/Flasche verworfen wird.</li>
		<li>PA für 15 min bei einem Perfusionsdruck von 30 mm Hg für den ersten Waschgang (Abbildung 1 K) durchlaufen Sie heparinisierten PBS.</li>
		<li>Ersetzen Sie die heparinisierten PBS-Flasche mit 0,1 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in entionisiertem Wasser und Durchspülen der Lungenkrebs für 2 h für die Decellularization.</li>
		<li>Perfundieren Sie nach der Decellularization deionisiertes autoklaviert Wasser durch die Lunge Gerüst für 15 Minuten.</li>
		<li>Dann perfundieren Sie 1 % nicht-ionische Waschmittel in entionisiertem Wasser für 10 Minuten.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Decellularization Kammer/Flasche mit 500 mL autoklaviert PBS mit 1 X Antibiotika (Penicillin-Streptomycin Amphotericin) ergänzt die hängenden Lunge in der Flasche mit dem Deckel intakt zu halten.</li>
		<li>Entsorgen Sie die intravenöse richten, habe das 2 ft Rohr befestigt an den Entsorgung Container zurück zur Lungenarterie Ende der Decellularization Kammer, und führen Sie die Pumpe mit 6 mL/min (Abbildung 1 L).</li>
		<li>Durchspülen Sie der Lunge für 72 h und wechseln Sie die PBS mit Antibiotika alle 12 h. Hinweis: Die azelluläre Lunge ist sofort einsatzbereit. Es kann bei-80 ° c bis benötigt gespeichert werden. Wenn Rosa Flecken oder Blutgerinnseln deutlich in die Lungenlappen visualisiert werden können, entsorgen Sie die Lunge. Es ist möglich, nach dem Zufallsprinzip für DNA oder Histopathologie zu testen. Eine komplette azelluläre Lunge wird nicht angezeigt, dass Zellen und 99,9 % der DNA abgewaschen. Hinweis: Beim Arbeiten mit einem zellulären Lunge Modell überspringen der Decellularization. Die geerntete Lunge (Schritt 1) kann direkt im Bioreaktor eingestellt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Bioreaktor-Set-up
<ol><li>Bereiten Sie die Bioreaktor-Flasche und die Elemente für den Aufbau benötigt.<ol>
<li>Drei Bohrungen in einem 500 mL-Flasche in gleicher Entfernung und einer weiblichen Luer in alle drei Löcher, mit schwarzem Nylon Ringe (Abb. 2A und 2 b) zu beheben. Hinweis: In beiden Löchern endet die Luer-Lock Gesicht außen, während ein Ende das Innere der Flasche zeigt.</li>
		<li>Schneiden Sie eine 6 im Pumpenrohr, eine 2 im Rohr, eine 6 im Rohr, ein Schlauch 1,5 ft, eine 2 ft Rohr und eine 10 ft Oxygenator pro Bioreaktor.</li>
		<li>Schneiden ein 18 G Edelstahl-Nadel und wieder, verbinden Sie die Enden mit biokompatiblen Rohre für eine Trachealkanüle Kanüle.</li>
		<li>Wickeln Sie das Rohr Oxygenator mit Luer Lock Konnektoren an den Enden auf einem Magnetventil Drahtgeflecht mit Autoklav Bänder (Abbildung 2).</li>
		<li>Autoklaven der oben genannten Elemente und halten Sie sie im UV Licht für 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richten Sie die Pumpe in die regelmäßige Zelle Kultur brutmaschine (37 ° C, 5 % CO2) mit richtigen Abstand zwischen den Fächern, eine 500 mL Flasche passt.</li>
	<li>Die Pumpe Patrone Sprühen Sie 70 % Äthanol auf und schließen Sie die Pumpe Schlauch mit Luer Lock Buchsen an beiden Enden an der Pumpe.</li>
	<li>Richten Sie die Oxygenator umwickelt das Magnetventil Drahtgeflecht in die Zelle Kultur brutmaschine indem das Pumpenrohr und das andere Ende mit dem 1,5 ft Rohr im Bioreaktor ein Ende (Abfluss) der Oxygenator anschließen.</li>
	<li>Richten Sie die Bioreaktor-Flasche in eine biologische Kabinett mit aseptischen Bedingungen.<ol>
<li>Befestigen Sie ein 3-Wege-Hahn (gelb) auf den Kopf eines weiblichen Luer Steuerung durch PA.</li>
		<li>Schließen Sie ein One-Way-Absperrhahn (blau) an einen anderen weiblichen Luer Lock SCHOTT für Zelle Aussaat durch die Luftröhre (Abb. 2F).</li>
		<li>2 im Schlauch auf der Außenseite zu verbinden (weiß) und 6 im Schlauch auf der Innenseite der Flasche zu die Medien, zu zirkulieren. Passen Sie einen männlichen Luer Lock zu einem Schlauch 2 ft und befestigen Sie einen weiblichen Luer Lug Stil Tee bieten Zugang zum Hinzufügen oder entfernen alles.</li>
		<li>Legen Sie ein One-Way-Absperrhahn auf eine Öffnung des Dreiwege Steckers (weiblichen Luer Lug Stil Tee).</li>
		<li>2 ft Röhren einen männlichen Luer Lock und einem weiblichen Luer Lock zuordnen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 mL RPMI1640 mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika Zellkulturmedium (variiert je nach Anforderung der Zelle) und übertragen Sie des Bioreaktors in den Inkubator zu. Schließen Sie die Oxygenator Schlauch an die beiden offenen Enden (One-Way-Absperrhahn und Tee Connector) einen geschlossene Bioreaktor zu machen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pre-laufen Sie die Pumpe mit 6 mL/min in die Zelle Kultur brutmaschine mit Zellkulturmedien Oxygenator und Röhren, füllen, damit keine Luftblasen im Schlauch vorhanden.</li>
	<li>Nachdem die Rohre mit Medien befüllt sind, schließen Sie den Absperrhahn und entfernen Sie die Bioreaktor-Flasche aus dem Inkubator durch Trennen der Oxygenatoren von beiden Enden der Bioreaktor-Flasche.</li>
	<li>Setzte die Bioreaktor-Flasche in der Biosicherheit Kabinett, Nährmedien durch den Absperrhahn übergeben, und der Hahn durch den Luer-Anschluss-Stecker PA Kanüle von der Lunge Gerüst (azellulärer oder zellulären) zuordnen. Hinweis: Hier ist es möglich, die azellulären Modell (nach dem Decellularization-Verfahren) oder eine frisch geerntete Herz-Lungen-Block zu verwenden (d. h., die zellulären Modell, wie es behält die native rattenzellen).</li>
	<li>Übergeben Sie Kultur Medien durch ein One-Way-Absperrhahn Luft zu entfernen und binden die trachealen Kanüle durch einen Seidenfaden zur Trachea.</li>
	<li>Achten Sie darauf, um zu vermeiden, Verdrehung der PA und der Trachea. Nahe der Bioreaktor-Flaschenverschluss mit der Lunge Gerüst im Inneren wieder aseptisch des Bioreaktors in den Inkubator zu übertragen und starten Sie die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 6 mL/min.</li>
	<li>Führen Sie Kulturmedien für 10-15 min um sicherzustellen, dass alle Lappen bekommen aufgeblasen und die Lunge sieht in guter Form (Abbildung 2).</li>
</ol>(4) Metastasen Modell und Cell Seeding
Hinweis: Fahren Sie auf die Zelle mit dem oben genannten Lunge Modell für einen Primärtumor WACHSTUMSSTUDIE Aussaat. Ändern Sie die Lunge Gerüst (azellulärer oder zellulären) wie folgt für die metastatische Modell.
<ol><li>Nehmen Sie den Bioreaktor mit der Lunge Gerüst aus dem Inkubator und steckte es in die Biosicherheit Kabinett.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Luer-Lock-Spritze 5 mL Kultur Medien über die Luftröhre und öffnen Sie die Bioreaktor-Kappe mit den hängenden Lunge Gerüst (Abb. 2F).</li>
	<li>In diesem Schritt muss eine weitere Person in der Modifikation von der Lunge zu einem metastasierendem Modell helfen.</li>
	<li>Bekommen Sie Seide 2-0 bereit und eckige Zange verwenden, um einen Pass durch die Luftröhre am Gabelung Punkt zu machen.</li>
	<li>Binden Sie die Luftröhre gonna die Rechte Lunge an der Bifurkation Stelle und überprüfen Sie den freien Fluss der Medien durch die Luftröhre, die linke Lunge vorbei Nährmedien. Hinweis: Sobald die Luftröhre an der Bifurkation Stelle gebunden ist, werden Zellen ausgesät durch die Luftröhre automatisch zu säen, die linken Lappen weitergeleitet. Es kann vor der Aussaat der Zellen durch Druck Kultur Medien durch die Luftröhre getestet werden. Im metastasierten Modell bewegt sich die Medien auf den linken Lappen, die aufgeblasen werden, und nicht auf den rechten Lappen10.</li>
	<li>Eine 20 mL Luer Lock Spritze auf die Trachealkanüle Kanüle und fügen Sie ATCC Lungenkrebszellen (A549, H1299) in 50 mL RPMI1640 komplette Nährmedien (Abb. 2F).</li>
	<li>Führen Sie die Zelle, die Aussaat in der Biosicherheit Kabinett. 15 mL von Zellen in der Spritze und lassen Sie es durchlaufen die Lungenlappen durch die Schwerkraft. Fügen Sie den Rest der Zellen, bevor eventuelle Luftblasen durchlaufen.</li>
	<li>In azellulärer Lunge Aussaat, tropfte in den Bioreaktor Flasche PERFUNDIERTEN Medien sammeln Sie und lassen Sie es durchlaufen die Luftröhre wieder 3 X. Hinweis: Die PERFUNDIERTEN Medien hat manchmal die Krebszellen ausgesät. Daher für die effiziente Saat, setzen Sie wieder die Medien wieder in der Luftröhre durch die Spritze.</li>
	<li>Einmal ausgesät, ziehen Sie die Spritze, 15 min. warten frische Medien hinzufügen und des Bioreaktors Inkubator wieder zurückzukehren. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen im Schlauch.</li>
	<li>Starten der Pumpe, damit die Medien mit 6 mL/min durchspülen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+Statistics.">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li><li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture.">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308 (2012).</li><li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin.">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), 1056-1063 (2014).</li><li>Mishra, D. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules.">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li><li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model.">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model.">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), 1167-1174 (2015).</li><li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model.">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die ex-Vivo 4-D Lunge bietet die Möglichkeit, Tumorwachstum und Metastasierung in einem Labor zu untersuchen. Eine native Lunge-Matrix ist ein komplexes System, das unterstützt normalgewebe und Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Matrix Interaktionen, Zelldifferenzierung und Gewebe Organisation unterhält. Es bietet Gelegenheit, fügen Sie jeder Tumor Mikroumgebung Komponenten, um ihre Auswirkungen auf das Tumorwachstum und die Interaktion mit anderen Zellen zu studieren.
Die Lunge-Ernte...

Krebsmetastasen ist der Schuldige hinter den meisten krebsbedingte Todesfälle und stellt die ultimative Herausforderung bei den Bemühungen zur Bekämpfung von Krebs. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Protokoll für eine vierdimensionale (4D) Zellkultur zu entwerfen, die eine Dimension des Flusses, neben dem dreidimensionalen (3D) Zelle Wachstum hat. Es steht für die drei Phasen des Prozesses Metastasen [d.h., der Primärtumor, zirkulierende Tumorzellen (CTC) und metastatischen Läsionen].
In den letzten drei Jahrzehnten brachte Wissenschaftler auf der ganzen Welt eine unvergleichliche Fülle von Informationen zu verstehen, die Mechanismen der metastatischen Progression bei verschiedenen Krebsarten, die die Aussicht auf eine Heilung oder progressionsfreie Überleben verbessert. Deutlich verbessert die klinische Behandlung von einigen Krebsarten wie Brustkrebs,1; Einige Krebsarten wie Lungenkrebs, haben jedoch noch eine schlechte überleben2. In Vitro und in Vivo Tiermodellen haben maßgeblich bei der Schaffung von neuen Erkenntnisse über die Mechanismen, die die Entwicklung der Krankheit zugrunde liegen. In den letzten Jahren Zell-Linie abgeleitet Xenotransplantate (CDX) und Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDX) wurden von größerem Interesse, da sie viele relevanten Merkmale des menschlichen Primärtumor3, z. B. Wachstum Kinetik, histologischen Merkmale, Verhalten bewahren Merkmale und das Ansprechen auf die Therapie. Jedoch hat jedes Modell seine Grenzen zum Verständnis des Mechanismus der CTC-Bildung und Metastasen in entfernten Organ4,5,6.
Vor kurzem haben wir ein 4-D- ex Vivo Lunge Krebs Modell durch die Verwendung von des Konzepts der Orgel reengineering und Perfusions-basierte Zellkultur entwickelt. Es ahmt die menschliche Lunge-Krebs-Wachstum durch die Bildung von perfusable Tumor Knötchen, die im Laufe der Zeit, mit einem ähnlichen menschlichen Krebs abgesondert wachsen Protein Produktion7. Es repräsentiert die Gen-Ausdruck-Signatur, die prognostiziert schlechte Überlebensrate bei Patienten mit Krebs und zeigt auch eine therapeutische Antwort von Tumor-Regression auf Cisplatin Behandlung8,9. Die Lunge-Modell wurde weiter modifiziert, so dass es metastatische Läsionen bilden kann. Die CTCs entwickeln sich aus einem Primärtumor und Intravasate in das Gefäßsystem und Leber in die kontralaterale Lunge metastatischen Läsionen10zu bilden. Genexpressionsstudien empfehlen eine ausgeprägte Expressionsprofil des Primärtumors, CTCs, und die metastatischen Läsionen und die Hochregulation der Teilmenge von Genen, die für den Phänotyp10erforderlich. Dieser metastatischen Prozess erfolgt aufgrund des Vorhandenseins von biologischen Bedingungen bei Patienten mit Krebs gesehen. Der Vorteil dieses Modells ist das Vorhandensein einer natürlichen Matrix und Architektur und eine Perfusion der Nährstoffe, die zur Bildung von Knötchen Tumor führt. Darüber hinaus gibt es auch Gelegenheit, die Auswirkungen der verschiedenen Komponenten des Tumors Mikroumgebung oder Drogen auf Tumorprogression im Laufe der Zeit zu studieren. Dieses Modell kann verwendet werden, um einen Zellbereich Krebs (Lungenkrebs, Brustkrebs, Sarkom etc.) in einem Labor zu wachsen.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump head</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump cartridge</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Female luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Male luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>black nylon ring</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>Wire mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>Female luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Female luer thread style coupler</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave connector</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &amp;trade;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>for cannula</td></tr></tbody></table>

acellular and cellular lung model to study tumor metastasis

Es ist schwierig, Tumorzellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Tumorprogression zu isolieren. Wir haben eine ex Vivo Lunge Modell, die das Zusammenspiel von Tumorzellen mit einer natürlichen Matrix und kontinuierlicher Strom an Nährstoffen zeigen kann, sowie ein Modell, das die Interaktion von Tumorzellen mit normalen zellulären Komponenten und eine natürliche Matrix zeigt. Die azellulären ex Vivo Lunge Modell wird durch eine Ratte Herz-Lungen-Block zu isolieren und entfernen alle Zellen, die mit dem Decellularization-Verfahren erstellt. Die rechten Bronchus abgebunden und Tumorzellen werden durch eine Spritze in der Luftröhre platziert. Die Zellen bewegen und die linke Lunge zu füllen. Die Lunge befindet sich dann in einem Bioreaktor, der Lungenarterie einen kontinuierlichen Fluss von Medien in einem geschlossenen Kreislauf erhält. Der Tumor auf die linke Lunge angebaut ist der Primärtumor. Die Tumorzellen, die in den zirkulierenden Medien isoliert werden Tumorzellen im Umlauf sind und die Tumorzellen in der rechten Lunge sind metastatischen Läsionen. Das zelluläre ex Vivo Lunge Modell entsteht durch das Auslassen des Decellularization-Prozesses. Jedes Modell kann verwendet werden, um verschiedene Forschungsfragen zu beantworten.

Die Lunge von Ratte geerntet unterhält die intakte Gefäßsystem Alveolen11 (Abb. 3A und 3 b). Auf Decellularization sind die extrazelluläre Matrix Komponenten eine azelluläre Lunge, wie Kollagen, Fibronektin und Elastin,11 (Abbildung 3, 3D, 3Eund 3F) erhalten. Die Decellularization führt zu eine vollständige E...

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Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine ex Vivo Lunge Krebs Modell, die imitiert die Schritte der Tumorprogression und hilft, um einen Primärtumor zu isolieren, zirkulierende Tumorzellen und metastatischen Läsionen.

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.5K Aufrufe.  Houston Methodist Hospital Research Institute. Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine ex Vivo Lunge Krebs Modell, die imitiert die Schritte der Tumorprogression und hilft, um einen Primärtumor zu isolieren, zirkulierende Tumorzellen und metastatischen Läsionen.

Serie: Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Forschung

Krebsforschung

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Immunologie und Infektion

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Ein permanentes Fenster zur Untersuchung von Krebsmetastasen in der Lunge

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Untersuchung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional process wherein cells from the primary tumor disseminate and seed metastases, tumor cells in existing metastases can also redisseminate and give rise to new lesions in tertiary sites in a process known as &#34;metastasis-from-metastases&#34; or &#34;metastasis-to-metastasis seeding.&#34; Metastasis-to-metastasis seeding may increase the metastatic burden and decrease the patient&#39;s quality of life and survival. Therefore, understanding the processes behind this phenomenon is crucial to refining treatment strategies for patients with metastatic cancer.
Little is known about metastasis-to-metastasis seeding, due in part to logistical and technological limitations. Studies on metastasis-to-metastasis seeding rely primarily on sequencing methods, which may not be practical for researchers studying the exact timing of metastasis-to-metastasis seeding events or what promotes or prevents them. This highlights the lack of methodologies that facilitate the study of metastasis-to-metastasis seeding. To address this, we have developed - and describe herein - a murine surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, allowing specific marking and fate tracking of tumor cells redisseminating from the lung to tertiary sites. To our knowledge, this is the only method for studying tumor cell redissemination and metastasis-to-metastasis seeding from the lungs that does not require genomic analysis.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Metastasen-zu-Metastasen-Seeding mit einer neuen In-vivo-Technik zur Verfolgung der Ausbreitung von Brustkrebs 

We present a method for studying tumor cell redissemination from lung metastases involving a surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, followed by the identification of redisseminated tumor cells in tertiary organs.

Verfolgung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen mittels Photokonversion

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

Zusammenfassung

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Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Ein permanentes Fenster zur Untersuchung von Krebsmetastasen in der Lunge

Verfolgung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen mittels Photokonversion

Verfolgung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen mittels Photokonversion

Verfolgung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen mittels Photokonversion