Kardiomyozyten, die aus induzierten Pluripotenten Stamm- oder IPS-Zellen erzeugt werden, werden zunehmend verwendet, um eine Vielzahl biologischer Fragen auf dem Gebiet der Herzelektrophysiologie zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technologie sind, dass sie eine dramatische Erhöhung des Durchsatzes sowie subtypspezifische Wirkungspotentialaufnahmen in ventrikulären wie Myozyten ermöglicht, mit einem ventrikulären spezifischen Promotorelement. Die Einführung genetisch kodierter Spannungssensoren durch lentivirale Transduktion ermöglicht die optische Bildgebung von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten Wirkungspotentiale.
Beginnen Sie mit dem Mischen von Lentivirus-haltigen Zellkultur-Überstand mit Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium, in einem Verhältnis von eins zu eins. Fügen Sie Hexadimetherinbromid in einer Endkonzentration von 8 Mikrogramm pro Milliliter hinzu, um die Infektionseffizienz zu verbessern. Und ersetzen Sie das Kardiomyozyten-Pflegemedium in der IPS-Zell-abgeleiteten Kulturschale von Cardiomyozyten durch das Infektionsmedium.
Kultur die infizierten Kardiomyozyten für 12 Stunden bei 37 Grad Celsius, und ersetzen Sie die Infektion Medium mit frischen Kardiomyozyten Erhaltungsmedium. Vor der Bildgebung, tauschen Sie das Zellkulturmedium mit Tyrodes Lösung, ergänzt mit Kalzium. Legen Sie dann die Kardiomyozyten in eine Bildkammer auf der Bühne eines invertierten Epifluoreszenzmikroskops, das mit einem Bildsplitter ausgestattet ist.
Wenn elektrisches Tempo erforderlich ist, installieren Sie Tempoelektroden in der Bildgebungskammer und schließen Sie die Elektroden an einen Stimulusgenerator an. Bringen Sie die Zellen in den Fokus, und lokalisieren Sie eine Zelle, die die genetisch kodierte Spannungsanzeige in der Mitte des Betrachtungsfeldes ausdrückt. Stellen Sie den optischen Pfad so ein, dass das emittierte Licht an den Bildteiler geleitet wird, und schalten Sie den Filterwürfel im Mikroskop auf den Filter, der mit den Filtern im Bildteiler kombiniert werden soll.
Stellen Sie in der Software, die die Kamera steuert, die Erfassungseinstellung so ein, dass eine Hochgeschwindigkeits-Bildgebung möglich ist, und richten Sie den Bildteiler gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Die beiden Bilder, die die beiden verschiedenen Emissionswellenlängenbänder darstellen, sollten nebeneinander liegen und jeweils die Hälfte des Bildes einnehmen. Überprüfen und passen Sie den Fokus des von der Kamera erzeugten Bildes bei Bedarf an.
Und stellen Sie die Helligkeit des Beleuchtungslichts so ein, dass eine Pixelsättigung vermieden wird. Stellen Sie die Erfassung der Zeitreihe ein, und verdunkelen Sie das Licht im Raum, um zu vermeiden, dass Streulicht die Messung beeinflusst. Öffnen Sie dann den Anregungslichtauslöser und beginnen Sie mit der Erfassung der Bildserie, um das elektrische Tempo zum entsprechenden Zeitpunkt zu starten, wie es experimentell angemessen ist.
Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, schließen Sie den Anregungslichtverschluss nach Bedarf und speichern Sie die Aufnahme auf der Festplatte. Wenn Sie dann die Aufnahmeeinstellung unverändert lassen, zeichnen Sie den Hintergrund über einen Bereich des Coverslips ohne Zellen auf. Für die Analyse der optischen Membranpotentialaufzeichnungen öffnen Sie den tiff-Stack mit den Zellen in ImageJ, und verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um einen Bereich von Interesse über eine fluoreszierende Kardiomyozyte im roten Kanal zu zeichnen, wobei darauf zu achten ist, dass der Bereich groß genug ist, dass sich die Zelle während der Kontraktion nicht aus der Region entfernt.
Wählen Sie als Nächstes Analysieren, Tools, Region of Interest Manager und Add T aus, um die Region als Region of Interest 1 hinzuzufügen. Ziehen Sie den Interessenbereich über dieselbe Zelle im grünen Kanal, und fügen Sie diesen Bereich als Region of Interest 2 hinzu. Deaktivieren Sie im Menü "Messungen analysieren und festlegen" alle Optionen mit Ausnahme des mittleren Grauwertes.
Klicken Sie im Bereich "Region of Interest Manager" auf Mehr und Mehrfachmessung, um die Optionen Alle Slices und eine Zeile pro Slice messen auszuwählen, und klicken Sie auf OK. Es wird ein Fenster geöffnet, das eine Kalkulationstabelle mit den drei Zeilen enthält. Verwenden Sie Datei und Speichern unter, um die Kalkulationstabelle in einer durch Kommas getrennten Wertdatei zu speichern. Schließen Sie das Fenster mit dem Bildstapel und dem Tabellenkalkulationsfenster, ohne das Fenster "Bereichs-des Interessen-Managers" zu schließen, und öffnen Sie den tiff-Stack mit der Hintergrundmessung.
Klicken Sie im Bereich "Region of Interest Manager" auf "Mehr und Mehrfachmessung", um die Optionen Alle Slices und eine Zeile pro Slice messen auszuwählen, und klicken Sie auf OK. Speichern Sie dann die Hintergrunddaten in einer separaten csv-Datei. Hier wird eine repräsentative einzelne IPS-Zell-abgeleitete Kardiomyozyten mit den weißen gepunkteten Linien dargestellt, die die Interessenbereiche markieren, die während der bildgebenden Analyse in den RFP- und GFP-Kanälen gezeichnet werden. Das Signal aus dem RFP-Kanal zeigt eine periodische Erhöhung der Fluoreszenzintensität während jedes Aktionspotentials aufgrund einer zunehmenden erzwungenen oder Resonanzenergieübertragung, die durch Veränderungen des Membranpotentials verursacht wird.
Entsprechend zeigt das GFP-Signal eine periodische Abnahme der fluoreszierenden Intensität. Das RFP/GFP-Verhältnis ist das biologische Signal, das in nachgeschalteten Analysen verwendet wird, wie z.B. Aktionspotentialdauer 50 und 90 Messungen. Bei dieser Methode zeigten beispielsweise 30 Tage alte ventrikuläre wie IPS-Zellabgeleitete Kardiomyozyten, die bei 0,5 Hertz platziert wurden, eine mittlere Aktionspotentialdauer von 50 von 439 Millisekunden und eine mittlere Aktionspotentialdauer von 90 von 520 Millisekunden.
Die elektrische Stimulation der IPS-Zell-abgeleiteten Kardiomyozyten bei steigenden Stimulationsraten alle fünf Schläge zeigte eine fortschreitende Verkürzung der Aktionspotentiale, wenn die Schlagrate zunahm. Darüber hinaus führte die Behandlung der spontan schlagenden IPS-Zell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit Isoproternol, einem nichtselektiven Beta-Adreno-Rezeptor-Agonisten, zu einer prompten Erhöhung der Schlagrate, die mit zunehmenden Dosen des Agonisten weiter erhöht werden konnte. Während diese Methode einen überlegenen Durchsatz im Vergleich zu klassischen elektrophysiologischen Messungen bietet, muss man sich seiner Grenzen bewusst sein, einschließlich einer zeitlichen Auflösung, die durch die intrinsischen kinetischen Eigenschaften des Fluoreszenzspannungssensors begrenzt wird.
