Die Autoren danken den Midwestern University Office of Research und geförderte Programme für ihre Unterstützung.

1. bereiten Sie Medien für anaerobe Kultur von verschiedenen Säugetieren Zelllinien
<ol><li>
Das komplette PS-74656 Medium für eine anoxische Zelle Kultur25zu machen.
	<ol>
<li>Die sterile Nitrit-Stammlösung (5 M; 100 X) durch 17,25 g Nitrit in 50 mL destilliertem, entionisiertem Wasser auflösen und dann Filtern Sie, um sie zu sterilisieren.</li>
		<li>0,5 mL der Nitrit-Stammlösung pro 50 mL niedrige Glukose DMEM (1 g/L Glukose) mit 110 mg/L von L-Glutamin, 584 mg/L Natrium Pyruvat und 10 % fötalen Rinderserum hinzufügen (FBS; Hitze-inaktivierten). Hinweis: Die Verwendung von FBS-Konzentrationen größer als 10 % giftig sind. Der Hinweis ein Krebs-Zell-Linie getestet hatte eine geringe Toleranz für Medien mit Nitrit (MDA-MB-231, Brust-Krebs-Zell-Linie) und wurde somit in das Fehlen von Nitrit angebaut. Darüber hinaus obwohl PS-74656 Medium unterstützt das Wachstum von allen Zelllinien, die getestet wurden (n = 9), bestimmte Zelllinien (z.B. Vero-Zellen) ausgestellt, höhere Konzentrationen der Zelle und eine höhere Rentabilität im PS-74656 mit hoher Glucose (4,5 g/L) DMEM 25.</li>
		<li>Platz 20 mL des Mediums in einem sterilen 50 mL konische Zentrifugenröhrchen. Ziehen Sie die Kappe nicht; Es sollte locker sein.</li>
		<li>De-Gas das Medium indem man den Schlauch in ein Vakuum Glasglocke auf einem ca. 45° Winkel, um die mittlere Fläche zu maximieren.</li>
		<li>Wenden Sie ein Vakuum, das mit einer Vakuum-Pumpe oder eines gleichwertigen Dokuments bei Raumtemperatur. Behalten Sie das Vakuum bis Bläschen (24 – 48 h) nicht mehr eingehalten werden.</li>
		<li>Entfernen Sie den Schlauch aus dem Glas und sofort schließen Sie die Kappe Abdichtung der Röhre um das Eindringen von Luft in das Medium zu minimieren.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr in der anaeroben Handelskammer.</li>
		<li>Lösen Sie die Rohr-Kappe und ermöglichen Sie die Atmosphäre in der Röhre, mit der der anaeroben Gasgemisch in die Kammer für mindestens 24 h equilibrate. Hinweis: Das Medium sollte in der Kammer verbleiben, bis es aufgebraucht ist. Für die Beschleunigung des Prozesses, bündig des Rohrs mindestens 3 X mit der anoxischen Gasgemisch mit einer sterilen transferpipette gefüllt mit anoxischen Gas, bestehend aus H2, CO2und N2.
</li>
		<li>Entgasen Sie alle Rohre (10-15 min) in den anaeroben Raum gelegt, wie oben beschrieben, bevor das Rohr Abdichten und Platzierung in der Kammer. Vor dem Gebrauch spülen Sie es mit der anaeroben Gasgemisch mit 1,5-2 mL Transfer Pipetten oder Pipettenspitzen, die mit anoxischen geleert wurden gas-mindestens 3 X.</li>
		<li>Während in der anaeroben Kammer entfernen Sie 100 µL des Mediums in ein steriles Röhrchen für entgastes Mikro-Zentrifuge und testen Sie es für den gelösten Sauerstoff mit einer Sauerstoff-Sonde innerhalb der Kammer. Hinweis: Die Sauerstoff-Elektrode ist pro des Herstellers Protokoll vor dem Gebrauch kalibriert. Lesungen der richtig entgast und ausgewogenen anaeroben Gas Mischung Medien sind 0. Achtung: Wenn die Messwerte über 0,3 ppm Sauerstoff sind, weiterhin die Medien in der anaeroben Kammer inkubieren, da mehr Zeit für das Medium equilibrate erforderlich ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) anoxischen Anbau von verschiedenen Säugetieren Zelllinien
<ol><li>
Bestimmten Tag-1
	<ol>
<li>Zellen (37 ° C, 5 % CO2) in einem T150 Kolben bis 90 % Zusammenfluss zur anoxischen und Inklusieve Kultur Steuerung für drei 24-Well-Platten (80 % Zusammenfluss) eine ausreichende Anzahl von Zellen zu wachsen. Hinweis: Für diese Studie wurden HeLa 229 und Vero-Zellen verwendet. Dieses Protokoll wurde auch getestet und erwies sich als erfolgreich für das Wachstum und die Aufrechterhaltung der sieben anderen Zelle Linien25.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium aus der Flasche durch Absaugen und waschen Sie es mit 10 mL HBSS.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Medium mit 5 mL Trypsin. Schütteln Sie die Flasche bis die Zellen aus dem Kunststoff optisch trennen. Aspirieren Sie die meisten der Trypsin, tippen Sie auf die Flasche um adhärenten Zellen verdrängen. Fügen Sie 10 – 15 mL hohe Glukose DMEM (4,5 g/L Glukose, 110 mg/L von L-Glutamin, 10 % FBS, 50 µg/mL von Gentamicin), die Trypsin zu inaktivieren.</li>
		<li>Genannte die Zellen mit einen 25-mL-Pipette, bis alle Klumpen der Zelle gestört werden.</li>
		<li>Zählen der Zellen und die Lebensfähigkeit der standard Hemocytometer und die Trypan blauen Farbstoff Ausgrenzung Methode oder das automatisierte Äquivalent zu bestimmen.</li>
		<li>Aussetzen Sie die Zellen in der hohen Glukose DMEM, wie bereits erwähnt, eine Zelldichte von 2,24 x 105 Zellen/mL.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL Zellsuspension in die Vertiefungen einer Gewebekultur 24-Well-Platte (2,24 x 105 Zellen/Well; 80 % Zusammenfluss). Samen 1 Platte für die anoxischen Kultur und eine andere für eine Kontrollkultur Inklusieve.</li>
		<li>Inkubation der Zellen bei 37 ° C in Inklusieve Bedingungen (5 % CO2) für 24 h. Hinweis: Die Zellen können in verschiedenen gut dimensionierte Platten beschichtet. Jedoch läuft die Zellen für anoxischen Wachstum in Korbflaschen Aussaat das Risiko einer Einschleppung von Sauerstoff in das System, es sei denn Vorsicht geboten ist, um atmosphärische Gas komplett ausspülen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestimmten Tag 0
	<ol>
<li>Legen Sie nach 24 h Inkubation Inklusieve die Platten für den anoxischen Wachstum in der anaeroben Kammer (eine anaerobe Handelskammer; ( Abbildung 1).</li>
		<li>Sofort ändern Sie das Medium in antibiotikafreien de vergast PS-74656 Medium, welches für 24 h zur anaeroben Kammer gewöhnt worden. Legen Sie die Platte in einen Behälter mit einem feuchten Tuch und schließen Sie locker zu, um die Feuchtigkeit zu halten. Hinweis: Die Platten für Inklusieve Wachstum sind identisch mit der Ausnahme behandelt, die alle Behandlungen unter atmosphärischen Bedingungen durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestimmten Tag 1
	<ol>
<li>Tag1 der anaerobe Bebrütung beginnt nach 24 h Inkubation in der kommerziellen anaeroben Kammer enthält die standard anaeroben Gasgemisch von 10 % H2, 10 % CO2und 80 % N2.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen für verschiedene Zeiträume.</li>
		<li>Überwachung der anaeroben Mediums für die farbliche Veränderung im Laufe der Zeit. Hinweis: Eine Farbverschiebung von rot-Orange, Magenta signalisiert die Zeit, um das Medium zu ändern. Dies kann auftreten, bis zu 2 Wochen dauern. Eine Farbverschiebung im Medium von rot-Orange bis gelb zeigt das Vorhandensein der bakteriellen Kontamination.</li>
		<li>Wenn das Medium von rot, Magenta wechselt, entfernen Sie Runagate Zellen durch Aspiration.</li>
		<li>Ort der angesaugten abgebrannten Medien mit den Runagate Zellen in entgast und anaerobe Gas equilibriert Microfuge Röhren, in der Nähe der Rohre gleichzeitig sicherstellen, dass die Dichtung sicher ist, und anschließend sie (326 x g; bei Raumtemperatur für 10 min zentrifugieren). Sofort ersetzen Sie die angesaugten Medien im Brunnen mit 1 mL des neuen entgast PS-74656 Medium.</li>
		<li>Legen Sie das Microfuge Rohr mit gebeizte Zellen in der anaeroben Kammer vor dem Öffnen. Aspirieren der abgebrannten Mediums und ersetzen Sie es mit frischen entgast PS-74656 Medium auf ein Gesamtvolumen von 1 ml in der Tube Microfuge.</li>
		<li>Die Zellen aus der Tube zu einem Brunnen in der Gewebekultur 24-Well-Platte zurück.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Bewertung der phänotypischen Zelldifferenzierung Mikroskopie von anaerob kultivierten Zellen
<ol><li>
Während in der anaeroben Kammer, die Platte in einer wiederverschließbaren Box mit der anaeroben Gasgemisch gespült und schließen Sie die Box. Hinweis: Das Feld muss einem feuchten Papiertuch um Spenden Feuchtigkeit und verhindern das Austrocknen der Plattenrandes enthalten. Für die Mikroskopie Arbeit brötchentüten die beste, da sie dünn sind.<ol>
<li>Um die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten, komplett verschließen der Tasche und aus der Kammer zu entfernen.</li>
		<li>Sorgfältig die Plastiktüte über die Platte zu dehnen, Zellen mit einem inversen Phase-Kontrast-Mikroskop mit Kamera-Anlage und trifft Vergößerung bei verschiedenen Vergrößerungen.</li>
		<li>Die Platte in den versiegelten Beutel an die Kammer zurück, und weiter die Inkubation, wie in Schritt 2.3.3 beschrieben.</li>
		<li>Separat die Runagate Zellen zu analysieren, die in der Schwebe sind, führen Sie die Schritte in Schritt 2.3.5. Hinweis: Diese Zellen können dann aerobic zu Testzwecken verwendet werden oder zur anaeroben Kammer für die Prüfung dieser spezifischen Bevölkerung zurückgegeben werden können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Methode stellt erstmals Säugetier-Zellen, die für längere Zeit in Abwesenheit von Sauerstoff gezüchtet wurden. Basierend auf aktuellen Beobachtungen, scheint der anoxischen Wachstum Fähigkeit über einen nicht fermentative Weg universal unter Säugerzellen Linien28, wo führte die anaerobe Wachstum Phänotyp Divergenz. Dies war für alle Zelllinien getestet beobachtet. Mit dem anaeroben Anbau wachsenden Ausmaßes der Zellen wurde abgerundet, entwickelt eine Aussetzung-wie Bevölkerung und waren in der Lage zu replizieren. Die sekundäre Zelle Art blieb mit dem Substrat verbunden; Allerdings kehrten die Zellmorphologie zu einer Spindel (dendritische) Form. Diese Ergebnisse weisen darauf hin ein häufiger Fehler in Analysen und Beobachtungen in Bezug auf anoxischen Gewebekultur Anbau. Es ist allgemein anerkannt, dass bei Säugerzellen Inklusieve Bedingungen (5 % CO2) angebaut Aufrunden und lösen, sie sterben. Im Gegenteil scheint korrekt für Zellen, Zellen, die aufgerundet haben in Abwesenheit von Sauerstoff, in welchem Fall gewachsen zu sein und getrennt, sind einfach eine Subpopulation morphologisch unterschiedliche Zelle.
Es ist die Optimierung der anoxischen Wachstumsbedingungen Zelllinie angewiesen. Mittlere PS-74656 insgesamt unterstützt das Wachstum der Zelle alle Linien unter Inklusieve und anoxischen Wachstumsbedingungen, mit Ausnahme von MDA-MB-231, eine Brust-Krebs-Zell-Linie das Wachstum in der Abwesenheit von Nitrit bevorzugt. Eine erfreuliche Beobachtung ist, dass sogar mit einer 98 % Absterben von Zellen pro Bohrloch, der Rest repliziert wird wiederum eine hoch angepasste Bevölkerung. Die kritische Aktion soll Kulturen zu erhalten, auch wenn nur wenige Zellen direkt von Mikroskopie eingehalten werden. Pflege muss so ausgeübt werden, um sicherzustellen, dass die freistehenden Zellen tot, Trypan blauen Farbstoff Ausschluss oder durch eine alternative Zelle Lebensfähigkeit Nachweisverfahren sind. Es sei darauf hingewiesen, dass mit solch einer großen Abnahme Zellzahlen, genügende Brunnen ausgesät werden müssen, um ausreichende total Zellzahlen für spätere Experimente haben. Der erwartete Verlust der lebensfähigen Zellen ist Zell-Linie und Aussaat Zusammenfluss angewiesen; somit optimale Zellzahlen im Laufe der Zeit müssen experimentell ermittelt werden und nicht von Erkenntnisse mit anderen Zelllinien extrapoliert werden. Das heißt, ein guter Ausgangspunkt ist eine 80 %-Zusammenfluss, hat die größte Chance für optimales Wachstum. Es ist darauf hinzuweisen, dass jede Einwirkung von Sauerstoff während der anaeroben Verfahrensschritte, egal wie kurz die Ergebnisse aufgrund der gemeldeten spontane zelluläre HIF-1gefährdet-alpha Antwort11,12.
Für dieses Verfahren ist die wichtigste Schritt die Entgasung des Mediums, Röhren, und alle anderen Apparate und Materialien verwendet. Die Einführung von auch sehr geringe Mengen an Sauerstoff könnte den Übergang von der Gärung Stoffwechsel in die anaerobe Atmung stoppen. Alternativ könnte es den fermentativen Stoffwechsel verlängern, damit keine Experimente bei der Messung der Hypoxie, nicht Sauerstoffmangel führen. Die Verwendung dieses neuartige Verfahren zur Messung der Zytotoxizität und chemotherapeutischen Aktivität könnte dazu beitragen, Medikament bei der Behandlung von soliden Tumoren erklären.

Zellen von soliden Tumoren, Stammzell-Nischen und die Auskleidung der Schleimhaut-Oberflächen gibt es in Umgebungen, in denen geringere Sauerstoffgehalt, darunter Anoxie1,2,3,4erleben. In normalen physiologischen Staaten variiert Sauerstoffversorgung jenseits der Hypoxie, Sauerstoffmangel (das völlige Fehlen von Sauerstoff)5,6. Die Erkenntnis, dass Luftsauerstoff säugerzelle Replikation beeinträchtigt und das Zellwachstum in-vitro- Bedingungen abgereichertem Sauerstoff optimiert werden kann wurde in den frühen 1970er Jahren berichtet. Richter Et al. 7 zeigten, dass 1 – 3 % der Sauerstoffsättigung (Hypoxie) Beschichtung gegenüber Luftsauerstoff (20 %) gesteigert. Die menschliche diploide Zelle Lebensdauer ist auch in der Kultur hypoxischen Bedingungen8verlängert.
In Vivo, hypoxische Bedingungen auftreten, wenn Sauerstoff speichert abgereichertem (z. B.bei intensivem Training), wobei die ATP-Produktion in der Skelettmuskulatur von Atmung auf Gärung (anaerobe Atmung) mit ausgeschaltetem der Endprodukt Milchsäure-9. Pathologisch, in Krebstumoren, das Innere des Tumors Masse ist, aufgrund der schlechten Vaskularisation anoxischen hypoxischen10. Die Wirkung der begrenzten Durchblutung auf Tumor Innenräume wird unabhängig vom Tumor Innenräume kolonisiert durch obligat Anaerobier1überprüft. Mechanistisch, Tumor Zelle Überleben in Hypoxie wird angenommen, dass die Expression des Gens Hypoxie-induzierbare Faktor 1-Alpha allein abhängig (HIF1-Alpha), das ist die erste spontane Reaktion auf Hypoxie4,11 , 12. HIF1-Alpha wird durch HITZESCHOCKPROTEINE, die HIF1binden unter hypoxischen Bedingungen induziert-alpha Promoter und Upregulate gen Transkription12. Diese HITZESCHOCKPROTEINE werden geglaubt, um die Induktion der verschiedenen Phänotypen gesehen in den Tumor hypoxischen Mikroumgebung zu unterstützen. Diese Phänotypen weisen einen erhöhten Ausdruck der Zellmembran Glukose-Transporter und die Rate der Glykolyse (Warburg-Effekt)13. Das Ergebnis ist ein Wechsel von Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung zu Laktat-Gärung.
Anoxischen überleben kann auch Alternativen zu Glukose zu überleben Phänomen14,15Unterstützung nutzen. Die untersuchte Säugetiere Beispiel ist der Maulwurf Ratte, die für fast 20 Minuten ohne Sauerstoff durch eine Fruktose-driven glykolytischen Gärung Weg14überleben können. Eine alternative Anpassung tritt in bestimmten Fisch (z.B.Karpfen [Carassius SP.], die deutlich länger überleben können Zeiträume mit Glykolyse mit Ethanol als das terminal Nebenprodukt)15. In beiden Fällen treibt die Gärung den Stoffwechsel, so dass das Überleben in der Abwesenheit von Sauerstoff. Die aktuelle Hypothese anoxischen überlebenswichtig ist, dass so lange als HIF1-Alpha ist bei Hypoxie, mitochondriale Atmung aktiviert, ohne die Notwendigkeit für Sauerstoff, tritt unter anaeroben Bedingungen16. Darüber hinaus wird postuliert, dass die Verwendung von fermentative Weg für hypoxische/anoxischen überleben Tumor überleben verbessert, da die Zellen oxidativen Stress, die könnte vermeiden sich nachteilig auf die Zelle überleben17. Dieses Postulat wird unterstützt durch eine kürzlich durchgeführte Studie zeigt, dass in Kardiomyozyten, Hypoxie den oxidativen Stress auf den Tumor Zelle17platziert senkt.
Bis heute hat die essentielle Natur eines fermentative Signalwegs für anoxischen Säugetier-Zelle Überleben in der Literatur, im großen Teil auf die Unfähigkeit, Kultur Säugerzellen in das völlige Fehlen von Sauerstoff für mehr als 3 Tage schon tief verwurzelt. Allerdings tritt eine Alternative zum Überlebenskampf der anaeroben Glykolyse in Bakterien. In bestimmten Bakterien dient Stickstoff oder Sulfat (unter anderen Verbindungen) als terminal Elektronen Akzeptoren für das Cytochrom-Oxidase-System in der Abwesenheit von Sauerstoff-18. Obwohl die bakterielle und Eukaryotische Evolution parallel seit der letzte universelle gemeinsame Vorfahr abweichende aufgetreten, wird geschätzt, dass Mitochondrien Energie Zellen 1,542 Millionen Jahre bevor die Sauerstoffversorgung der Ozeane19 bereitstellten . Da Forscher haben gezeigt, dass die isolierte Mitochondrien ATP in der Abwesenheit von Sauerstoff zu Nitrit als das terminal Elektron Akzeptor produzieren können, ist es vernünftig anzunehmen, dass Zellen über einen Zeitraum länger als 3 Tage in der Abwesenheit von Sauerstoff funktionieren könnte 20 , 21 , 22 , 23. in dieser Studie beschriebene Methode hat ein Dienstprogramm für die anaerobe Säugetier-Zelle Wachstum von zahlreichen Zelllinien.

<table><tbody><tr><td>Whitney A35 anaerobic chamber</td><td>Don Whitley Scientific&amp;nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td>The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr><tr><td>pipet aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>sterile transfer pipets</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50 cc sterile conical centrifuge tubes</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>vaccum jar</td><td>Nalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose (4.5 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose (1 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>sterile pipets</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask (T75 or T150)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture treated dishes</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>glad ziplock sandwich bags</td><td>Ziploc</td><td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin microtiter pipets</td><td>Mettler Toledo</td><td>Rainin Classic Pipette PR-100</td><td></td></tr><tr><td>microtiter tips</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-213233 &amp;amp; sc-201717&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>test tube rack (50cc tubes)</td><td>The Lab Depot</td><td>HS29050A</td><td></td></tr><tr><td>sodium nitrite</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&amp;amp;region=US</td><td></td></tr><tr><td>clear boxes with lids</td><td>Rosti Mepal</td><td>Rubber maid</td><td></td></tr><tr><td>paper towels</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>In house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes sterile</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200273</td><td></td></tr><tr><td>biohazard bags with holder (desktop)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Gloves</td><td>VWR</td><td>89428</td><td></td></tr><tr><td>oxygen electrode</td><td>eDAQ</td><td>EPO354</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>pH paper/ pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines

Die meisten Schleimhaut-Oberflächen zusammen mit den Mittelpunkten in Tumoren und Stammzell-Nischen sind geographische Bereiche des Körpers, die anoxischen sind. Bisherige Studien zeigen, dass die Inkubation in Inklusieve (5 % CO2 in Luft) oder hypoxischen Bedingungen (niedrige Sauerstoffniveaus) gefolgt von einer anoxischen Inkubation (fehlender freier Sauerstoff) Ergebnisse in begrenzte Lebensfähigkeit (2 – 3 Tage). Eine neuartige Methode wurde entwickelt, eine anoxische Zellkultivierung (für mindestens 17 Tage, die maximale Zeit getestet). Der wichtigste Aspekt dieser Methodik soll sicherstellen, dass kein Sauerstoff in das System eingeführt wird. Dies ergibt sich durch das Ausgasen von Medien und durch Spülung Röhren, Gerichte, Fläschchen und Pipetten mit einem anaeroben Gasgemisch (H2, CO2, N2) gefolgt von schönem zu equilibrate der anoxischen (Sauerstoff) Umwelt Materialien vor dem Gebrauch. Zusätzliche Sorgfalt muss beim Erwerb von Mikrofotos um sicherzustellen, dass die Aufnahmen erhalten keine Artefakte enthalten. In Abwesenheit von Sauerstoff ist Zellmorphologie erheblich verändert. Zwei unterschiedliche morphotypen sind für alle anaerob wachsen Zellen festgestellt. Die Fähigkeit zu wachsen und zu pflegen Säugerzellen in Abwesenheit von Sauerstoff kann zur Analyse der Zellphysiologie, Biofilm-Interaktionen und die Charakterisierung von biosynthetischen Bahnen für neuartige Wirkstoffforschung angewendet werden.

Die Stärke dieses Protokolls unterstützt die Langlebigkeit und das Wachstum von mehreren Zelllinien und in der Erkenntnis, dass es eine tiefgreifende Veränderung und Divergenz in der Zelle Morphologie25. Das wichtigste Element dieser Studie ist die Übertragung und die Pflege der Zellen unter strenger anaerobiose. Dies erfordert eine anaerobe Kammer organisiert, um das Protokoll (Abbildung 1) zu maximieren und die Gewissheit, dass die Zellen für die Mikroskopie oder andere Tests entfernt befinden sich in einer geschlossenen Umgebung. Bis heute die Palette der anoxischen überleben waren 15 – 17 Tage für unsterbliche Krebs Zell-Linien und bis zu 17 Tagen verwandelt Zelllinien (neun Zelllinien für anoxischen Wachstum gezeigt). Die Ebenen der lebensfähigen Zellen, sank sobald diese Zellen auf anoxische Bedingungen verschoben wurden um mindestens 10 % bis maximal 90 %, bevor sie stabilisiert. Alle Zell-Linien auf die dual Phänotypen zurückgesetzt (angebunden und Runagate) mit dem Anteil der Zellen in der Suspension im Laufe der Zeit erhöhen. Auch nach einer erweiterten Inkubation von mehreren Wochen es blieben einige gefesselten Zellen, aber die Mehrheit der Zellen wurden in die abgerundeten Runagate Morphologie (Abbildung 2). Wie berichtet, sind diese Runagate Zellen lebensfähig und ging durch den Zellzyklus. Es sei darauf hingewiesen, dass die Variablen, die angepasst werden müssen, können der Blutzuckerspiegel und die Nitrit-Konzentration enthalten. Das heißt, aus der mehr als 60 verschiedene Medien-Formulierungen, die für ihre Fähigkeit, Inklusieve und anoxischen Inkubation unterstützen getestet wurden, konnte das PS-74656 Medium unterstützen das Überleben und die Replikation von fast allen Zelllinien getestet.
Eine wichtige Beobachtung war die Differenzierung der anoxischen Zellen, unabhängig von der Zelle getestet, in zwei verschiedene Phänotypen, angebunden und Runagate (Abbildung 2). Analog zu den Inklusieve Monolage Zellen, wurden die gefesselten Zellen der Gewebekultur Kunststoff angebracht. Die Anlage war jedoch schwächer, leichter zu trypsinize oder verdrängen durch Schaben, als die Anlage, die unter den Bedingungen der Inklusieve aufgetreten ist. Darüber hinaus wurde die Zellmorphologie mit mehr Spindel (dendritische) Erweiterungen26kleiner. Die zweite zellulären morphotyp beobachtet wurden Zellen in Suspension (d.h., Runagate Zellen). Diese Zellen umgewandelt spontan frei schwebenden einzelligen Suspensionen in Anwesenheit von Gewebekultur behandelt Kunststoff, die mit einer kleineren Zellengröße und weniger Zytoplasma gerundet wurden. Sie unterschieden sich von den klassischen Aufhängung Kultur Zellen, die in der Regel erfordern eine enzymatische Anpassung, wachsen in Aggregaten, Gewebekultur-unbehandelte Container benötigen und sind größer als ihre Inklusieve Pendants27. Im Laufe der Zeit konnte der anoxischen Zell-Populationen beobachtet werden, von überwiegend gefesselte Monolage mit derjenigen der Runagate Zellen in Suspension zu verlagern. Diese Zellen in Suspension wurden praktikable und replizieren; Pflege musste somit ausgeübt werden sollte der Überstand entfernt werden. Bemerkenswert ist auch, dass das Medium nicht verlangen, die Umstellung der gesamten anaeroben Inkubationszeit. Die mittleren pH-Indikator unter anoxischen Inkubation, im Gegensatz zu seiner Inklusieve Kontrolle war auch unverändert (d.h., blieb rot). Der Prüfer möchte die Runagate Zellen zu ernten, oder ändern Sie das Medium, die Zellen erhalten Sie mit anaeroben Gas gespült Mikro-Zentrifuge Röhren, die geschlossen sind fest in der anaeroben Kammer. Für die Zelle der gefesselte Zellen waschen muss das Verfahren auch in der Kammer keine Sauerstoff-Exposition zu beseitigen durchgeführt werden.
Die endgültige Zellviabilität für eine langfristige Bewirtschaftung wurde zu einem großen Teil abhängig von der Zelle verwendet wird und dem Zusammenfluss, der Brunnen oder die Kolben waren ursprünglich gesäten (Abbildungen 3 und 4). Das heißt, ein guter Ausgangspunkt ist 80 %, die die größte Chance für optimales Wachstum hatte. Darüber hinaus kann ein Zelle Zeile-abhängige Verlust von 10 % bis 60 % der Tragfähigkeit in den ersten 2 – 4 Tagen auftreten. Jedoch während der Aufführung dieses Experiments, die verbleibenden Zellen radelte durch den Zellzyklus und28repliziert. Die Aussaat Zusammenfluss Wirkung auf die Langlebigkeit der Zellkultivierung ist in den Abbildungen 3 und 4ersichtlich. HeLa 229 und Vero-Zellen wurden in 24-Well-Platten, 40 %, 60 % und 80 % der ursprünglichen Zusammenfluss ausgesät (100 % Zusammenfluss = 2,8 x 105 Zellen/gut) und dann in der Abwesenheit von Sauerstoff für 17 Tage inkubiert. Das HeLa 229 anoxische Zellwachstum wurde bei einer anfänglichen Aussaat Zusammenfluss von 80 % optimiert. Im Gegensatz dazu die optimale Aussaat Zusammenfluss Vero-Zellen lag bei 60 %. Dies zeigt die Notwendigkeit, zunächst die Aussaatdichte abhängig von der Zell-Linie verwendet zu optimieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58049/58049fig1.jpg"> Abbildung 1 : Modell der anaeroben Kammer-Set-up für die Kultur von Säugerzellen. Die minimalen benötigten Materialien umfassen Gewebekultur Platten, ein Rohr für das Verwerfen von Medien oder andere Flüssigkeiten und wiederverschließbaren Beutel für die Übertragung der Platten auf dem Mikroskop unter Beibehaltung steriler Transfer mehrkanalpipette, Biohazard Taschen, de-vergast Medien anaeroben Bedingungen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58049/58049fig2.jpg"> Abbildung 2: Anoxischen HeLa Zellen morphologischen Differenzierung. (A) dieses Panel zeigt die Phasenkontrastmikroskopie Inklusieve HeLa-Zelle Steuerelemente 4 Tage nach Impfung mit 20 X Vergrößerung. (B) dieses Panel zeigt der anoxischen HeLa-Zellen 17 Tage nach dem Beimpfen (mit der unverändert von Tag 1 PS-74656 Medium, 80 % ausgesät Zusammenfluss und ein 20 X Vergrößerung). (C) dieses Panel zeigt Mikroskopie Artefakte von Wassertropfen auf der Innenseite von einem verschlossenen Plastikbeutel mit einer anoxischen 24-Well Platte. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58049/58049fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58049/58049fig3.jpg"> Abbildung 3: Verhältnis von anoxischen, Inklusieve HeLa 229 lebensfähige Zellen Post-17 Tagen Inkubation. Dieses Fenster zeigt die Auswirkungen der die Aussaatdichte auf der HeLa 229 Zellviabilität im PS-74656 Medium im Vergleich zu den Inklusieve Kontrolle. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert ± SEM
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58049/58049fig4.jpg"> Abbildung 4: Verhältnis von anoxischen, Inklusieve Vero lebensfähige Zellen nach Inkubation 17 Tage. Dieses Fenster zeigt die Auswirkungen der die Aussaatdichte auf die Vero Zellviabilität im PS-74656 Medium im Vergleich zu den Inklusieve Kontrolle. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert ± SEM

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Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerobe Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien

Hier beschreiben wir eine neue Methode, die den anaeroben langfristige Anbau von etablierten Zelllinien ermöglicht. Die maximale Überlebenszeit, die getestet wurde ist 17 Tage. Diese Methode eignet sich für die Prüfung von Zytostatika und Erforschung der Physiologie der anoxically Zellen repliziert.

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Aufrufe.  Midwestern University. Hier beschreiben wir eine neue Methode, die den anaeroben langfristige Anbau von etablierten Zelllinien ermöglicht. Die maximale Überlebenszeit, die getestet wurde ist 17 Tage. Diese Methode eignet sich für die Prüfung von Zytostatika und Erforschung der Physiologie der anoxically Zellen repliziert.

Serie: Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Forschung

Medizin

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS-fähigen Nichtinvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Biotechnik

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Biochemie

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

Ausbreitung von<em&gt; Homalodisca coagulata Virus-01</em&gt; Über<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Zellkultur

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Immunologie und Infektion

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Biologie

Gewinnung von Skelettmuskeln der Maus zur Kultivierung von Stammzellen und ihrer Nische

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

Autor im Rampenlicht: Ex-vivo-Protokoll zur Kultivierung ruhender Muskelstammzellen mit Nischenkomponenten 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Anaerobe Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien

Zusammenfassung

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Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

Ausbreitung von

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

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