Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Ribosomen aus Mitochondrien menschlicher Zelllinien in großem Maßstab zu reinigen, was für Strukturstudien ausreicht. Diese mitochondriale Ribosomreinigungsmethode ermöglicht die Charakterisierung von Übersetzungskomplexen, Mutanten, Qualitätskontrollbaugruppen und mitoribosomalen Subunit-Zwischenprodukten. Diese können verwendet werden, um wichtige Fragen zur Proteinsynthese in Mitochondrien zu beantworten.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stickstoffkavitation für die Zelllyse verwendet wird und nur 10 bis 10 Kulturzellen benötigt werden, um Mitoribosomen für die hochauflösende Strukturbestimmung vorzubereiten. Diese Technik kann zur Entdeckung neuer Komponenten der Mitochondrien-Übersetzungsmaschinerie führen und kann weiter für die Entwicklung neuartiger Therapeutika für die Krebsbehandlung verwendet werden. Nach der Kultivierung von HEK293S-Zellen gemäß dem Textprotokoll, ernten Sie zwei Ein-Liter-Röhren von Zellen durch Zentrifugation bei 1 000 mal g und vier Grad Celsius für sieben Minuten.
Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie jedes Pellet in 100 Milliliter PBS schnell wieder auf. Dann bündeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie die Suspension bei 1, 200 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes, nach sorgfältiger Dekantierung des Überstandes, wiegen Sie das Pellet.
Verwenden Sie dann 120 Milliliter MIB-Puffer, um ihn wieder aufzuhängen und die resuspendierten Zellen 20 Minuten lang im Kühlraum anschwellen zu lassen. Übertragen Sie die angeschwollenen Zellen in eine vorgekühlte Stickstoffkavitationskammer auf Eis. Fügen Sie dann 45 Milliliter SM4-Puffer zu den Zellen hinzu.
Befestigen Sie die Stickstoffkavitationskammer und füllen Sie sie mit Stickstoff, bis der Druck 500 PSI erreicht. Schließen Sie dann die Wasserhähne und halten Sie sie 20 Minuten auf Eis. Die Stickstoffkavitationszelllysemethode verhindert äußere physikalische Belastung der Zellen, vermeidet Hitzeschäden an Organellen und das Stickstoffgas schützt die Zellen vor Oxidation.
Darüber hinaus ist es eine sehr reproduzierbare Methode. Lösen Sie den Druck in der Kammer langsam aus und sammeln Sie das Lysat. Um dann die Zellreste und Kerne zu entfernen, zentrifugieren Sie das lysierte Material bei 800 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Sammeln Sie den Überstand, indem Sie ihn durch ein gefaltetes Stück Musselintuch in einen Becher gießen, der auf Eis gehalten wird. Entsorgen Sie das Pellet nicht. Setzen Sie das Pellet in 90 Milliliter MiBSM Puffer aus.
Dann, mit einem Teflon Glas nach unten Homogenisator, homogenisieren Sie die Probe und wiederholen Sie die Zentrifugation bei 800 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Wieder sammeln Sie den Überstand, indem Sie ihn durch ein gefaltetes Stück Musselintuch in einen Becher gießen, der auf Eis gehalten wird. Dann kombinieren Sie diesen Überstand mit dem ersten Überstand.
Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 1 000 mal g und vier Grad Celsius. Dann sammeln Sie den Überstand wie zuvor. Nach dem Wegwerfen des Pellets zentrifugieren Sie den Überstand, der rohe Mitochondrien enthält, 15 Minuten lang bei 10 000 mal g und vier Grad Celsius.
Waschen Sie jedes lose Pellet vorsichtig aus, ohne den engen Teil zu stören. Verwenden Sie dann 10 Milliliter MiBSM-Puffer, um das enge Pellet wieder aufzuhängen. Fügen Sie der Probe 200 Einheiten RNase-free DNase hinzu, um die genomische DNA zu entfernen und das Rohr auf einer Walze im Kühlraum für 20 Minuten zu drehen, um die Probe gleichmäßig zu verdauen.
Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 10 000 mal g und vier Grad Celsius und verwenden Sie zwei Milliliter SEM-Puffer, um das Pellet wieder aufzuhängen. Laden Sie die gesamte mitochondriale Suspension auf den Saccharosegradienten. Nach dem Spinnen des Farbverlaufs gemäß dem Textprotokoll, mit einer Transferpipette, sorgfältig sammeln sie das braune Band, das an der Schnittstelle von 32% und 60% Saccharose migriert wird.
Dieses Protokoll verwendet Stickstoffkavitation, um die Zellen zu brechen. Einmal gemeistert, kann eine großflächige Isolierung von hochreinen, intakten Mitochondrien innerhalb von neun Stunden durchgeführt werden und kann leicht modifiziert und für verschiedene Zelltypen und Skalen angepasst werden. Nach dem Auftauen gefrorener Mitochondrien auf Eis, fügen Sie zwei Volumina Lysepuffer zu drei Milliliter mitochondrien hinzu.
Mischen Sie sofort, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Verwenden Sie einen kleinen Teflon Glas-Down-Homogenisator, um bei der Lyse zu helfen und das Homogenat auf Eis für fünf bis zehn Minuten zu inkubieren, um die Reaktion abzuschließen. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 30.000 mal g und vier Grad Celsius für 20 Minuten, um das unlösliche Material zu entfernen.
Dann den Überstand sorgfältig sammeln und das Pellet entsorgen. Wiederholen Sie die Zentrifugation, um die Klärung des Überstandes zu gewährleisten. Dann den Überstand sorgfältig sammeln und das Pellet entsorgen.
Für jeden Milliliter Lysed-Material ein Saccharosekissen in einem TLA-120.2 ultraklaren Rohr vorbereiten, indem Sie 0,4 Milliliter Saccharosekissen in die Rohre einfügen. Schicht etwa einen Milliliter lysierte Mitochondrien auf jedes Saccharosekissen, was zu einem Lysat-zu-Kissen-Verhältnis von 2,5 zu eins führt. Zentrifugieren Sie dann die Probe in einem TLA-120.2 Rotor bei 231, 550 mal g und vier Grad Celsius für 45 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie 100 Mikroliter des Resuspensionspuffers, um das Rohr zu spülen und Restsaccharose zu entfernen. Die Pellets wieder aufhängen und in insgesamt 100 Mikroliter Resuspensionspuffer kombinieren. Beim Wiederaufsetzen des Kissenpellets ist es wichtig, auf Eis durchzuführen, um eine Erwärmung der Probe zu vermeiden und auch das Aufschäumen der Probe zu vermeiden, um die strukturelle Integrität der mitochondrialen Ribosomen zu gewährleisten.
Wirbeln Sie die Probe auf langsame Geschwindigkeit für 30 Sekunden, um die verbleibenden Aggregate aufzulösen und zentrifugieren Sie die Rohre bei 17, 949 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nach messung der Mitoribosomenabsorption bei A260 die gesamte Probe auf ein einziges lineares Saccharose-Gradientenrohr laden.
Zentrifugieren Sie die Probe in einem TLS-55 Rotor bei 213, 626 mal g und vier Grad Celsius für 120 Minuten. Um den Farbverlauf zu zerkleinern, punktieren Sie den Boden des Rohres und sammeln Sie die Probe tropfenweise in einer 96-Well-Platte. Mitoribosome Reinigung sollte nicht mehr als sieben Stunden für eine ausreichende Menge an Mitoribosomen dauern.
Wie in diesem diskontinuierlichen Saccharosegradienten nachgewiesen, wandern die gereinigten Mitochondrien in das braune Unterband an der 32-60%-Schnittstelle. Nach der Trennung von Mitoribosomen von löslichen mitochondrialen Komplexen auf einem Saccharosegradienten werden zwei große mitoribosomale Populationen identifiziert, die monosome 55S und die große Untereinheit 39S. Das Vorhandensein der großen Untereinheitsfraktion deutet darauf hin, dass Zellen in einem aktiv teilenden Zustand geerntet werden.
Dieses Panel zeigt einen Mikrographen mit der Probe aus monosome Peak Two bei einer kalibrierten Vergrößerung von 1,23 Angstroms pro Pixel. Hier sind Daten nach der Erstverarbeitung zu sehen, die intakte Monosomen offenbaren. Schließlich wird in diesem Panel eine monosome 3D-Rekonstruktion veranschaulicht.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie intakte menschliche Mitoribosomen für strukturelle und biochemische Studien vorbereiten können. Unser Protokoll bietet qualitativ hochwertige Endpräparate, die auf andere mitochondriale Makromoleküle extrapoliert werden können.
