Diese Arbeit wurde unterstützt durch National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), das allgemeine Programm der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81772093), der Wissenschaft und Technologie Entwicklung Programm von Suzhou (ZXL2015128), der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20161241), und ein Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Menschlichem Gewebe, die in diesem Protokoll verwendeten nach den Richtlinien des Instituts Humanforschung Ethik-Kommission behandelt wurden (NO.2015120401, Datum: 12. Mai 2015).
1. Vorbereitungen
<ol><li>Sammeln frische Erwachsenen Bauchhaut Gewebe verworfen von plastische Chirurgie am Krankenhaus in einen 50-mL-Tube mit 10 mL eiskaltes Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM). Das Präparat kann bei 4 ° C bis zu 72 h ohne erheblichen Auswirkungen auf die Zellviabilität gehalten werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Reagenzien und Kulturmedium wie unten beschrieben vor.<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 mg/L) bis 50 mL von Phosphat-gepufferte Lösung (PBS), die Waschlösung vorzubereiten.</li>
		<li>Bereiten Sie zwei Sätze von Enzym Verdauung Lösungen: (1) bereiten Sie 50 mL Dispase (2,5 mg/mL in DMEM) und 50 mL Typ I Kollagenase (2,5 mg/mL in DMEM) separat für die konventionelle Methode; und (2) bereiten Sie 50 mL einer Mischung aus Dispase und Typ I Kollagenase (auflösen 125 mg Dispase Pulver und 125 mg Typ I Kollagenase Pulver in 50 mL DMEM) für die neue Methode. Hinweis: Alle Enzym Lösungen sollten mit einem 0,22 µm-Sieb gefiltert und at4 ° c gehalten</li>
		<li>Beide Methoden Verdauung Lösungen vorbereiten: Trypsin 0,05 % und 0,25 % Trypsin im Handel gekauft wurden. Bereiten Sie eine 10 mg/mL DNase ich Lösung durch Auflösen von 50 mg DNase ich in 5 mL PBS Pulver, mit einem 0,22 µm-Sieb Filtern und speichern Sie es bei-20 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 500 mL des Mediums, die enzymatische Verdauung zu neutralisieren: DMEM Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.</li>
		<li>500 mL Inokulation Medium (Wachstum-Faktor-haltige Mittel, genannt G-Medium) vorbereiten: DMEM/F12 (3:1) Medium mit 1 % Penicillin/Streptomycin, 40 µg/mL Fungizone, 40 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und Zuschlag von 2 % B27.</li>
		<li>100 mm Zellkultur Vorbehandeln Gerichte mit 2 mL der Beschichtung Matrix, Typ enthält ich Kollagen für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. konventionelle Methode
<ol><li>
Haut-Gewebe-Vorbehandlung
	<ol>
<li>Nehmen Sie 1,5 cm2 von Hautgewebe und waschen Sie es 1 X mit 10 mL PBS; dann spülen sie mit 10 mL 70 % igem Ethanol für 30 s und inkubieren Sie es 2 X mit 10 mL Waschlösung (PBS, enthält 2 % Penicillin und Streptomycin), 5 min. Hinweis: Alle Waschungen sind im 100-mm-Zelle Kultur Gerichte in einem Laminar-Flow-Kapuze durchgeführt.</li>
		<li>Schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere Entfernen der subkutanen Fettschicht in der Kulturschale 100 mm Zelle und dann wiegen das Hautgewebe (das Gewicht beträgt 1 g in diesem Protokoll). Hinweis: Ausreichende Besatz ist sehr entscheidend für die effiziente Trennung der Epidermis von der Dermis. Die gelbliche Fettschicht kann optisch leicht unterscheiden.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf ein weiteres 100 mm steril Gericht mit der Lederhaut Seite nach unten, und dann schneiden Sie das Hautgewebe in 3 bis 4 mm breite Streifen mit einem Skalpellklinge. Hinweis: Die Dermis-Seite mit der Fettschicht ist visuell erkennbar.</li>
		<li>Das Hautgewebe in der Kulturschale 100 mm 10 mL 2,5 mg/mL Dispase-Lösung hinzu und inkubieren Sie dann die Schale über Nacht bei 4 ° C (nicht mehr als 20 h). Hinweis: Die Menge der Dispase Lösung kann berechnet werden, mit 10 mL Dispase-Lösung für die Verdauung von jedem Gramm Gewebe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trennung von der Epidermis der Hautgewebe
	<ol>
<li>Am zweiten Tag die Epidermis von der Dermis, die mit einer feinen Pinzette abziehen. Hinweis: Ist es schwierig, die Oberhaut abziehen, war die Dispase Verdauung nicht ausreichend, die ist in der Regel aufgrund unzureichender Trimmen des Gewebes. In diesem Fall braucht das Gewebe eine längere Inkubationszeit.</li>
		<li>Hacken Sie die geschälte Epidermis mit 500 µL Zellkulturmedium in ein Gewebe Gülle mit Skalpellklingen; dann, mit 10 mL von 0,25 % Trypsin in einen 50-mL-Tube Aufschwemmen Sie und inkubieren Sie es 20 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C mit schütteln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammlung und Kultivierung von Primärzellen
	<ol>
<li>Neutralisieren Sie die Trypsin-Aktivität durch ein gleiches Volumen der Neutralisierung-Lösung (10 mL in diesem Protokoll) hinzufügen.</li>
		<li>Die epidermalen Zellen durch die Lösung nach oben und unten 20 X mit einer serologischen 10-mL-Pipette pipettieren zu distanzieren und ein 100 µm Zelle Sieb, alle restlichen Gewebe Ablagerungen zu entfernen die Zelle Lösung durchlaufen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zelle Lösung bei 200 X g für 5 min nach der Filtration; Aufschwemmen der Zelle Pellet in Neutralisation Mittel zum Waschen und anschließend Zentrifugieren es wieder bei 200 X g Zelle Pellet zu erhalten.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Medium Low-Calcium, serumfreien Keratinozyten (SFM). Nehmen Sie 10 µL dieser Lösung auf die Ergebniszelle Anzahl und dann Platte ca. 2 x 106 Zellen mit 10 mL der SFM in 100 mm Zelle Kultur Gerichte vorbehandelt mit Beschichtung Matrix (mit Typ I Kollagen). Hinweis: Die Beschichtung ist ein notwendiger Schritt für die konventionelle Methode.</li>
		<li>Ändern Sie das Kulturmedium jeden 2 d. Hinweis: Überprüfen Sie die Zelladhäsion unter dem Mikroskop, vor und nach der Änderung des Kulturmediums.</li>
		<li>Durchgang der Zellen, wenn sie etwa 80 % erreichen Zusammenfluss. Hinweis: Alle Kultur-Gerichte sind mit der Matrix-Beschichtung vorbehandelt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) die neue Methode
<ol><li>
Haut-Gewebe-Vorbehandlung
	<ol>
<li>Sammeln Sie das Gewebe wie beschrieben oben (Schritt 2.1) für die konventionelle Methode.</li>
		<li>Waschen Sie das Hautgewebe 1 X mit 10 mL PBS und dann in einen sterilen Behälter aus Kunststoff durch eine elektronische Waage (das Gewicht ist etwa 1 g in diesem Protokoll) wiegen. Hinweis: Das Mindestgewicht des Gewebes benötigt für dieses Protokoll ist 0,1 g, da es schwierig ist, eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, wenn die Gewebeprobe verwendet zu klein ist. Es gibt keine maximale Gewicht des Gewebes für dieses Protokoll, die letztlich die Umschlagskapazität des Betreibers abhängt.</li>
		<li>Pinzette verwenden, um das Hautgewebe mit 10 mL 70 % igem Ethanol für 30 spülen s.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Gewebe 2 X mit 10 mL Lösung (in Schritt 2.1.1 vorbereitet), für 5 min jedes Mal zu waschen. Hinweis: Alle oben aufgeführten Waschschritte sind im 100-mm-Zelle Kultur Gerichte in einem Laminar-Flow-Kapuze (Gewebekultur Kapuze) durchgeführt.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf eine andere Zelle 100 mm steril Kulturschale.</li>
		<li>Verwendung von Skalpellklingen, Hackfleisch das Gewebe gründlich in ein Gewebe Gülle.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL PBS alle 5 min., um das Gewebe feucht zu halten. Hinweis: Nehmen Sie ca. 15 min für Schritte 3.1.5 - 3.1.7. Die oben genannten Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verdauung von Hautgewebe
	<ol>
<li>Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe-Lösung in eine 50-mL-Tube. Fügen Sie 10 mL Enzym Mischung für je 1 g von Hautgewebe. Mischen Sie die Enzyme mit dem homogenisierte Gewebe gründlich.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung mit schütteln in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 h.</li>
		<li>Fügen Sie ein 1/5 Volumen von 0,25 % Trypsin (2,5 mL in diesem Protokoll) auf die Verdauung-Mischung für weitere 30 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C.</li>
		<li>Fügen Sie DNase ich Lösung für das Enzym-Gemisch im Verhältnis 1: 100 (V/V) (250 µL in diesem Protokoll) und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammlung und Kultivierung von Primärzellen
	<ol>
<li>Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 12,5 mL Neutralisation Medium im Verhältnis 1:1. Pipette die Lösung oben und unten für ungefähr 20 x, mit einer serologischen 10-mL-Pipette, um die Zellen zu trennen.</li>
		<li>Filtern Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100 µm Zelle Sieb, das Gewebe Ablagerungen zu entfernen. Zentrifugieren des Überstands 200 X g für 5 min. beobachten das Pellet am Boden des Röhrchens.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand und waschen Sie die Zelle Pellet mit 10 mL der Neutralisation Medium und Zentrifuge wieder bei 200 X g für 5 min um die Zellen zu sammeln.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Inokulation Medium (G-Mittel aus Schritt 1.2.5) mit 10 µM Y-27632.</li>
		<li>Nehmen Sie 10 µL der Lösung für die Ergebniszelle Anzahl und dann Platte ca. 2 x 106 Zellen mit 10 mL G-Medium in der Kulturschale 100-mm-Zelle. Hinweis: Der precoating Schritt ist nicht erforderlich für die neue Methode, und keine Entfernung der dermalen Schicht ist erforderlich.</li>
		<li>Ersetzen Sie nach 3-d die Inokulation Medium mit Low-Calcium SFM Medium. Ändern Sie das Kulturmedium jeden 2 d. Hinweis: Überprüfen Sie die Zelladhäsion, vor und nach dem Ändern des Mediums.</li>
		<li>Durchgang der Zellen, wenn sie etwa 80 % erreichen Zusammenfluss. Hinweis: Gegebenenfalls Vorbehandeln der Zellen mit 0,05 % Trypsin für 2 min und waschen Sie die Zellen mit PBS, dermale Zellen vor trypsinizing der Epidermiszellen verunreinigen zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Zelle Passagierung
<ol><li>Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie dann 2 mL 0,05 % Trypsin (pro pro 100 mm Schale).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator (37 ° C mit 5 % CO2) für 5 min.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen aus der Kulturschale abgelöst haben.</li>
	<li>Fügen Sie 8 mL DMEM mit 10 % FBS zu neutralisieren die enzymatische Reaktion und dann sammeln die Zellen in einem 15-mL-Tube.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min um die Zelle Pellet zu erhalten.</li>
	<li>Den überstand langsam entfernen dann Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 10 mL SFM Medium und die Anzahl der Zellen.</li>
	<li>Platte 1 x 106 Zellen mit 10 mL der SFM in jeder Zelle 100 mm Schale.</li>
	<li>Verändern Sie das Medium jeder 2 d.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis.">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).</li><li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal,+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin.">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells+of+the+skin.">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li><li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (S1), S2 (2013).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing.">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li><li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells.">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li><li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture.">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv f&#252;r dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Rho-associated+protein+kinase+(ROCK)+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells.">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+isolate+human+epidermal+keratinocytes.">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin).">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cornified+envelope:+a+model+of+cell+death+in+the+skin.">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li><li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells.">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li><li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior.">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Kultivierte primäre HKCs haben häufig genutzt, um Wunden in Kliniken mehr als drei Jahrzehnte lang zu behandeln, und seit dieser Zeit wurde es immer wichtig, ausreichende Zahl von Zellen für klinische Anwendungen in einer fristgerechten Weise effizient zu erhalten. Daher erschwert in der Praxis, die herkömmliche Isolierung-Methode, die die Trennung der Epidermis von der Dermis erfordert, diese Anforderungen durch die geringe Ausbeute an Zellen und die geringe Fähigkeit, adulte Zellen die passage. Hier beschreiben wi...

Ziel war es, ein einfaches und effizientes Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten (HKCs) von adulten Geweben, vor allem für klinische Anwendungen isolieren zu entwickeln. Epidermalen Hautstammzellen, lokalisiert in der basalen Schicht der Haut, besitzen ein hohes Potenzial zu vermehren und zu unterscheiden und bieten Keratinozyten zur Aufrechterhaltung der Funktionen der Haut1,2,3, 4. HKCs von Geweben weit für Haut Gewebe-Engineering und Regeneration Zwecke, vor allem in der Reparatur der beschädigten Haut und in der Gentherapie für klinische Anwendungen5,6 verbreitet sindHaut isoliert. Die Schlüsselfrage für HKC-basierten Anwendungen ist es, effizient zu isolieren und zu große Anzahl von HKCs mit hohem Potenzial in-vitro-7,8zu erweitern. Obwohl verschiedene Forschergruppen Methoden entwickelt, um die Kulturen der Stamm-ähnliche HKCs zu produzieren, sind diese Methoden manchmal zeitaufwendig und kompliziert zu führen und andere Einschränkungen, z. B. niedrige Zelle Renditen und durch die Art der Haut Probe begrenzt 9verwendet. Zum Beispiel beinhaltet die traditionelle Methode, HKCs von Hautgewebe zu isolieren eine zweistufigen enzymatischen Verdauung mit einer Trennung der Epidermis von der Dermis-6. Diese Methode funktioniert in der Regel gut für neonatale Gewebe, aber es wird sehr schwierig, wenn verwendet, um Zellen aus adulten Geweben zu isolieren.
Y-27632, ein Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK), wurde berichtet, erheblich verbessern die Effizienz der epidermalen Stammzellen isoliert und Kolonie Wachstum10,11,12. In einer früheren Studie entdeckten wir, dass Y-27632 das klonale Wachstum der Epidermiszellen erleichtert sondern den Ertrag der dermalen Zellen verringert durch die differentiell Steuerung des Ausdrucks der Adhäsion Moleküle13. Wir stellte auch ein neues konditionierten Inokulation Medium, genannt G-Medium, das Wachstum und Ertrag von primären epidermalen Zellen unterstützt. Durch die Kombination G-Medium mit Y-27632, kann diese neuartige Methode epidermale und dermale Zellen spontan nach Enzym Verdauung, so dass den Schritt der Epidermis-Dermis Trennung13,14trennen. Basierend auf früheren Berichten, beschreiben wir nun die Einzelheiten des Verfahrens der neuen Methode HKCs von Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren.

<table><tbody><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen Inc.&amp;nbsp;</td><td>C10227</td><td>Automatic cell counting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>For cell incubating</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Cell centrifuge</td></tr><tr><td>Constant Temperature Shaker</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>For water bath</td></tr><tr><td>Electronic Scale</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>For tissue weighing</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>50ml Centrifuge Tube</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>For cell centrifuge</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning incorporated</td><td>431792</td><td>Cell filtration</td></tr><tr><td>Phosphate buffered solution</td><td>Solarbio Life Science&amp;nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Component of neutralization medium</td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>Epidermal cells culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1AC5</td><td>Component of neutralization medium</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>For HKC dissociation</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Beijing Solarbio Science &amp;amp; Technology</td><td>T1350-100</td><td>For HKC dissociation</td></tr><tr><td>Coating Matrix Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>For coating matrix</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>F12 Nutrient Mix, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>Component of G-medium</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Preparation for G-medium</td></tr><tr><td>EGF Recombinant Human Protein</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>cell proliferation and cytotoxicity assays</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human Cytokeratin5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Human Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td></tr><tr><td>Mouse anti-human Vimentin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3390</td><td>For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6(GOH3)</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>flow cytometry analysis of HKCs</td></tr><tr><td>Rat IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>negative control antibody of &amp;alpha;6-integrin&amp;nbsp; in flow cytometry analysis&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue

Primären menschlichen Keratinozyten aus frischem Hautgewebe und ihre Erweiterung in-vitro- isoliert haben für Laborforschung und klinische Anwendungen weit verbreitet. Die konventionelle Isolationsmethode der menschlichen Keratinozyten beinhaltet ein zweistufiges sequentielle enzymatische Verdauung Verfahren, die sich bewährt hat, als ineffizient bei der Schaffung von Primärzellen von adulten Geweben aufgrund der niedrigen Zelle Wiederfindungsrate und reduzierten Zelle Lebensfähigkeit. Wir berichteten vor kurzem eine fortgeschrittene Methode, menschliche primäre epidermaler Vorläuferzellen von Hautgewebe zu isolieren, die die Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 im Medium nutzt. Im Vergleich mit dem traditionellen Protokoll, diese neue Methode ist einfacher, leichter und weniger zeitaufwendig, und epithelialen Stammzellen Ausbeute erhöht und verbessert ihre Stammzell-Eigenschaften. Darüber hinaus der neuen Methodik erfordert nicht die Trennung der Epidermis von der Dermis, und eignet sich somit für die Isolierung von Zellen aus verschiedenen Arten von adulten Geweben. Diese neue Isolationsmethode überwindet die größten Schwächen der herkömmlichen Methoden und eignet sich eher für die Herstellung von großen Zahlen von epidermalen Zellen mit hoher Potenz für Labor und klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir die neue Methode im Detail.

Schematische Darstellungen der neuen Methode (Abbildung 1A) und der konventionellen Methode (Abbildung 1 b) sind in Abbildung 1dargestellt. Die konventionelle Methode ist eine zweistufige Verdauung, die eine 2-Tages-Verfahren erfordert. Die neue Methode ist dagegen eine einstufige Verdauung, die dauert rund 3 Stunden durchzuführen. Wichtig ist, erhalten die neue One-Step-Methode zwei Populationen (e...

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A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Aufrufe.  Shandong University. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Serie: A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Forschung

Krebsforschung

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Entwicklungsbiologie

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biologie

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

Biotechnik

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...