Diese Methoden können helfen, wichtige Fragen im Bereich der Ophthalmologie wie Pericyte-Proliferation oder Migration zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass sie eine Vielzahl von Visualisierungsoptionen bieten. Die Verfahren werden Karin Dreisig und Frank W.Blixt, zwei Post-Docs in unserem Labor, demonstrieren.
Um das Auge zu enukleieren, verwenden Sie zuerst ein Skalpell, um die hinteren und vorderen Schlitze von etwa 0,5 Zentimetern im Rattenaugenlid zu machen. Schnappen Sie sich das Auge mit der Zange und neigen Sie vorsichtig zur Seite, um das umgebende Gewebe freizulegen. Entführen Sie das Auge durch Schnitte mit Einerse im Binde- und Muskelgewebe.
Legen Sie das Auge kurz ein bis zwei Minuten in 4%Formaldehyd und phosphatgepufferte Saline. Spülen Sie kurz in Natriumpuffer, bevor Sie ein Loch an der Hornhaut limbus durch Anwendung von leichtem Druck mit der Spitze eines Skalpells. Schneiden Sie entlang der Hornhaut Limbus mit Sezierschere, um die Hornhaut und Linse mit Zange zu entfernen.
Das restliche Gewebe zwei bis vier Stunden mit Netzhaut in 4%Formaldehyd in PBS untertauchen. Kryo-Schutz des Gewebes durch Eintauchen in Sorenson Phosphatpuffer enthält 10%Saccharose und dann 25%Saccharose. Übertragen Sie das Gewebe, sobald es auf den Boden des Behälters gesunken ist.
Einbettung in Yazulla Medium mit 3%Gelatine aus Schweinehaut und 30%albumin aus Hühnereiweiß zubereitet. Als nächstes schneiden Sie 10-Mikron vertikale Kryosektionen der gelatine-eingebetteten Netzhaut bis zum Sehnerv. Die Kryosektionen auf eine Glasrutsche legen und mindestens eine Stunde trocknen lassen.
Nach dem Trocknen die Rutsche 15 Minuten lang mit 0,25%Triton-X 100 in PBS untertauchen. Dann tropfen Sie eine Mischung aus 1:100 PDGF-Rezeptor-Beta und 1:500 NG2 primärer Antikörper in PBST und 1%BSA auf die Kryosektion und legen Sie sie in eine feuchte Kammer bei vier Grad Celsius über Nacht. Waschen Sie am nächsten Tag die Abschnitte, indem Sie die Rutsche zweimal für jeweils 15 Minuten in PBST eintauchen.
Dann tropfen Sie eine Mischung aus 1:100 Anti-Maus Alexa Fluor 594-verknüpft und 1:100 Anti-Rabbit FITC-gebundenen sekundären Antikörpern in PBST mit 3%BSA auf die Kryosektionen verdünnt und für eine Stunde im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation spülen Sie die Glasrutsche in PBST zweimal für jeweils 15 Minuten. Montieren Sie die gefärbten Kryosections mit anti-verblassendem Montagemedium, das DAPI und einen Deckelschlupf enthält.
Eine zweite Netzhautgewebe-Vorbereitungstechnik ist vollgemountet. Verwenden Sie nach der Entfernung der Hornhaut kleine Öffnungsbewegungen von Zangen, um die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel in Richtung des Sehnervs zu trennen. Befreien Sie die Netzhaut am Sehnerv mit einer Sezierschere und machen Sie drei bis vier Schlitze von wenigen Millimetern Länge von der Netzhautperipherie zum Sehnervenkopf.
Die Netzhaut auf eine Glasrutsche verteilen und fünf bis zehn Minuten trocknen lassen. 4%Formaldehyd auf die Netzhaut tropfen und 20 bis 30 Minuten fixieren. Nach der Fixierung mit PBS abspülen.
Für optimale Ergebnisse, Immunostain direkt nach dem Spülen. Zuerst tropfen SIE PBST auf die gesamte Halterung und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Gießen Sie den PBST ab, fügen Sie dann die primäre Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie in einer feuchten Kammer bei vier Grad Celsius über Nacht.
Gießen Sie am nächsten Tag den primären Antikörper ab und tropfen Sie auf PBST, um die Netzhaut zweimal für 15 Minuten jedes Mal zu spülen. Nach dem Abgießen der zweiten Wäsche, tropfen Sekundärantikörperlösung auf die Netzhaut und inkubieren für eine Stunde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der sekundären Antikörper-Inkubation zweimal mit PBST waschen wie zuvor.
Montieren Sie die gebeizte Vollmontage mit einem anti-verblassenden Montagemedium mit DAPI und einem Deckelschlupf. Alternativ zur Vollmontage der Netzhaut kann die Netzhautvaskulatur durch hypotonische Isolierung isoliert werden. Legen Sie die Netzhaut zunächst in einem Milliliter entionisiertes Wasser in eine 24-Well-Platte und schütteln Sie bei 200 Umdrehungen pro Minute mit einer 1,5-Millimeter-Vibrationsumlaufbahn für eine Stunde bei Raumtemperatur, und fügen Sie dann 200 Einheiten DNAse 1 hinzu, um die lysierten Zellablagerungen von der Netzhautvaskulatur zu trennen und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur zu schütteln.
Spülen Sie die Netzhaut in entionisiertem Wasser für jeweils fünf Minuten mit Schütteln bei 150 bis 300 Umdrehungen pro Minute, um neuronale Zellablagerungen zu entfernen. Die Netzhaut sollte mit jeder Spülung transparenter werden, was auf die Entfernung neuronaler Zellablagerungen hindeutet. Nach dem Spülen die Netzhaut in einem Milliliter 4%Paraformaldehyd und PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren.
Spülen Sie mit PBS dreimal. Wenn Sie mit der Immunfärbung fortfahren, blockieren Sie die hypotonisch-isolierte Vaskulatur mit 500 Mikrolitern 10%Eselsserum, das in PBS für eine Stunde verdünnt wird, wobei bei 100 U/min geschüttelt wird. Nach der Blockierung, inkubieren Sie die Netzhaut über Nacht in 600 Mikroliter primärer Antikörperlösung bestehend aus 1:100 PDGF-Rezeptor Beta und 1:500 NG2 primärer Antikörper in 10%Eselserum und PBS verdünnt.
Am nächsten Tag spülen Sie das Netzhautnetz dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten ab, dann in 1:100 Anti-Maus Alexa Fluor 594-verknüpft und 1:100 Anti-Rabbit FITC-gebundene sekundäre Antikörper, verdünnt in 10%Eselserum und PBS mit Schütteln bei 100 Rpm bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln. Nach einer fünfminütigen Wäsche in PBST 15 Minuten lang in 0,2 Nanogramm pro Milliliter DAPI und PBST inkubieren. Waschen Sie dreimal für fünf Minuten mit PBST, während vor Licht geschützt.
Als nächstes schneiden Sie die Spitze einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff. Entfernen Sie scharfe Kanten mit einer Pipettenspitze, und befeuchten Sie die Pasteur Pipette mit PBST, dann aspirieren Sie die Netzhautvaskulatur in die Pipette und geben Sie in eine Vier-Well-Glaskammer-Rutsche. Der feuchtigkeitsbefeuchtende Schritt ist wichtig, um zu vermeiden, dass die Netzhautvaskulatur an der Innenseite der Pasteur Pipette klebt.
Positionieren Sie die Netzhautvaskulatur, indem Sie die Kammerfolie hin und her kippen. Entfernen Sie das Medium aus den Brunnen der Kammerrutsche. Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit flacht die Gefäße auf den Boden des Schlittens ab.
Falls erforderlich, tropfen Flüssigkeitstropfen auf die Netzhautvaskulatur, um sich zu entfalten. Stellen Sie die korrekte Entfaltung unter dem Mikroskop sicher, bevor Sie die Kunststoffbohrungen aus dem Kammerschlitten entfernen. Montieren Sie die gebeizte Vaskulatur mit anti-verblassendem Montagemedium und einem Deckelschlupf.
Die NG2-Immunhistochemie zeigt positive Gefäße im inneren Teil der Netzhaut. Pfeile zeigen kreisförmige und hufeisenförmige Immunreaktivität in den Gefäßen an. Die Pfeilspitze weist auf ein längs geschnittenes Gefäß hin.
Die PDGF-Rezeptor-Beta-Immunhistochemie zeigt eine ähnliche Immunreaktivität wie NG2. Auch hier zeigen die Pfeile und pfeilspitzen Spitzen die Immunreaktivität in den Gefäßen an. Dieses Bild zeigt eine Verschmelzung von NG2 in grün, PDGF-Rezeptor-Beta in Rot und DAPI in Blau.
Durch die Überlagerung der drei verschiedenen Filter, Es wird aufgedeckt, dass NG2 und PDGF-Rezeptor Beta sind ko-lokalisiert. Dieses Bild zeigt eine immunostainierte Vollmontage-Präparation mit NG2-Färbung in Rot. Immunreaktivität ist entlang des oberflächlichen Gefäßnetzes mit intensiver Färbung in abluminalen Pericyten sichtbar.
Die neuronalen Zellen sind als DAPI-Blaue Kerne zwischen der NG2-gefleckten Mikrovaskulatur sichtbar. Dieses Bild zeigt das hypotonische isolierte retinale Netzhautnetz der Ratte, das mit NG2 in grün und PDGF-Rezeptor-Beta in Rot gefärbt ist. Das gesamte Netzwerk zeigte NG2-Immunreaktivität.
PDGF-Rezeptor Beta-Immunreaktivität wurde in Zellsomas gefunden. Bei höherer Vergrößerung ist klar, dass PDGF-Rezeptor-Beta-Färbung nur in Zellsomas im Gefäßnetzwerk zu sehen ist, was auf Pericyt-Immunreaktivität hindeutet. Einschließlich DAPI-Färbung zusammen mit NG2 und PDGF-Rezeptor Beta zeigt drei Pericyte in zwei undefinierten Gefäßwandzellen in diesem hoch-Vergrößerungsbild.
Nach diesen Verfahren können andere Immunostainings wie glatte Muskelzellen oder endotheliale Färbungen verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel, wie sehen Zellen in der Netzhautvaskulatur nach Ischämie aus?
