Name: antimicrobial characterization of advanced materials for bioengineering applications
Uploaded: 2018-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
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Die Autoren möchte erkennen an der Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir für die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit durch die 001UCV-231-2017 und 2018-231-001UCV gewährt.

1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Schneiden Sie die Materialproben zylindrischen Stempel in 10 mm Durchmesser Scheiben mit einem Durchmesser von 10 mm. Hinweis: Spröde Materialien können in geeigneten sterilen Lösungsmitteln für 1 h erweicht und dann in Scheiben schneiden. Z. B. hydrophile Materialien wie Zink Alginat wurden nach diesem Protokoll getestet und waren im Autoklaven Wasser angefeuchtet, bevor sie zu schneiden, um Probe brechen zu vermeiden. Anderen hydrophoben Materialien wie poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) brauchen jedoch keine Art von vorherigen Schwellung um richtig geschnitten werden.</li>
	<li>Trocknen Sie die Beispiel-Material-Disketten bei 60 ° C in einem Vakuumofen (< 10-2 Torr) für 24 h. Hinweis: Einige Materialien können eine hohe Trocknungstemperatur erforderlich. Es ist jedoch wichtig, nicht um eine Temperatur zu erreichen, die das Material thermisch beeinträchtigen könnte.</li>
	<li>Die Material Schichtdicken mit einem digitalen Bremssattel zu messen. Hinweis: Dieses Protokoll empfiehlt die Nutzung von Material Filme mit konstanter und ähnliche dicken beim Vergleich der antimikrobiellen Wirkung von verschiedenen Materialien.</li>
	<li>Jede Probe durch Eintauchen in Ethanol 70 % für 10 min und anschließende Ultraviolett (UV) Strahlung für 1 h pro jeder Seite zu sterilisieren. Hinweis: UV-Bestrahlung kann erfolgen indem jede Probe in eine sterile Petrischale in einem Laminar-Flow-Kapuze mit 12,0 W Lampe UV-C Strahlung. Achtung: Forscher sollten nicht setzen sich auf UV-Strahlung, denn es ist mutagen.</li>
	<li>Führen Sie Schritte 1.1, 1.2, 1.3 und 1.4. mit der materiellen Steuerscheiben. Hinweis: Polyethylenterephthalat (PET) oder alternative nicht-antimikrobielle Materialien könnten als Steuerscheiben in der Diffusion und Kontakt-Methode verwendet werden. Darüber hinaus sollten Nanokomposite oder behandelten Materialien charakterisieren, das Grundmaterial als Kontrollmaterial genutzt werden.</li>
</ol>2. Empfohlene Mikroorganismen
Hinweis: Wir empfehlen die Verwendung von 3 verschiedenen Mikroorganismen, die antimikrobielle Kapazität des geprüften Materials gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen zu studieren.
<ol><li>Reinkulturen von 3 Mikroorganismen zu verwenden: die gram-positiven Bakterien Staphylococcus Aureus, gramnegativen Bakterien Escherichia coliund die Hefe Candida Albicans. Hinweis: Andere Mikroorganismen-Arten können auch mit diesem Protokoll getestet werden durch den Inkubationsbedingungen bei Bedarf ändern. Achtung: Die erforderliche Biosafety-Messungen sind nach der Art der Mikroorganismen, die in diesem Protokoll eingesetzt einzuhalten.</li>
	<li>Arbeiten mit Pre-steril oder autoklaviert Material und mit dem Bunsenbrenner während des gesamten Prozesses der mikrobiellen Manipulation oder einem biologischen Sicherheitsschrank (falls erforderlich) aseptische Bedingungen zu gewährleisten. Hinweis: Empfohlene Autoklaven Bedingungen sind 121 ° C während 15 min für Nährböden und 121 ° C während 20 min für Arbeitsmaterial und biologische Rückstände.</li>
</ol>(3) Agar Festplatte Diffusion Test (Diffusion-Methode)
Hinweis: Wenn eine flüssige Diffusion von antimikrobiellen Substanzen der antimikrobiellen Hauptmechanismus advanced Materials sein könnte, kann die Diffusion-Methode sehr nützliche Informationen über die antimikrobielle Kapazität dieser Materialien bieten. Der materiellen Datenträger befindet sich in der Mitte der Agar-Platte kann bilden eine transparente Ring Zone (Halo) wo eine Wachstumshemmung von Mikroorganismen nach 24 h Kultur erfolgt (siehe Abbildung 1).
<ol><li>
Diffusion-Testverfahren
	<ol>
<li>Vorbereiten und Autoklaven tryptic Soy Agar (TSA) nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Gießen Sie die TSA in sterile Petrischalen unter aseptischen Bedingungen mit dem Bunsenbrenner oder einem Laminar-Flow-Haube. Hinweis: Die TSA Platten müssen 4 – 6 mm dick sein.</li>
		<li>Kultur der verschiedenen Mikroorganismen auf aerob 18 – 24 h in den Petrischalen mit TSA im Brutschrank bei 37 ° c getestet werden</li>
		<li>Vorbereiten und Autoklaven tryptic Soy Bouillon (TSB) nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Gießen Sie die TSB in ein 50 mL vorsterilisierten Zentrifugenröhrchen mit einer vorsterilisierten serologische Pipette unter aseptischen Bedingungen mit dem Bunsenbrenner oder einem Laminar-Flow-Haube.</li>
		<li>Erneut ein paar Kolonien aus Schritt 3.1.3 in 25 mL TSB enthalten in einem sterilen Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Wattetupfer und Wirbel für 1 min um eine gleichmäßige Durchmischung zu erreichen.</li>
		<li>Passen Sie die Extinktion (bei 540 nm) der Kultur mit einem Spektralphotometer für die passende Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) pro mL: ca. 1,5 x 108 KBE/mL für Bakterien und von 1 x 106 , 5 x 106 KBE/mL für die Hefe. Hinweis: Die Kultur und Küvette Volumes, die Absorption messen müssen nach der Art der Spektralphotometer genutzt ausgewählt werden.</li>
		<li>Wirbel der mikrobiellen Brühe für 5 Sekunden zur Verbesserung der Mikroorganismus Dispersion und kurz Eintauchen einer sterilen Wattetupfer in dieser mikrobiellen Suspension. Entfernen Sie das überschüssige Flüssigkeit aus den Tupfer drücken sie gegen die Rohrwandung mit der Kultur.</li>
		<li>Durchziehen Sie gleichmäßig die mikrobielle Brühe Aussetzung mit der sterilen Wattetupfer auf die Oberfläche der TSA Platten in 3 Ebenen zur Deckung ihrer ganzen Oberfläche mit der Mikroorganismus und 5 min nach der Inokulation trocknen lassen. Hinweis: Um Feuchtigkeit zu entfernen, müssen die TSA Platten offen hängend bei 37 ° C für 10-15 min vor der Impfung platziert werden.</li>
		<li>Ein paar Pinzette durch Eintauchen in ein Becherglas mit Ethanol 96 % und dann brennen sie mit einem Bunsenbrenner oder Alkohol Brenner zu sterilisieren.</li>
		<li>Legen Sie die Beispiel-Disketten zur getestet werden und Kontrolle der Scheibe in der Mitte der TSA Platten mit der sterilen Pinzette.</li>
		<li>Aerob inkubieren Sie die TSA Platten hängend bei 37 ° C für 24 h. Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, empfiehlt es die TSA Platten hängend zu inkubieren. Jedoch wenn die probenscheibe von den TSA Platten löst, führen Sie diesen Schritt hängend. In diesem Fall empfiehlt es sich, die Platten in der Laminar-Flow-Haube zu trocknen. Diese antimikrobiellen Test muss mindestens an verschiedenen Tagen an Reproduzierbarkeit zu gewährleisten in Quadriplicate durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Überprüfung der mikrobiellen Aussetzung Konzentration und Reinheit Hinweis: Die folgenden Schritte sind notwendig, um zu überprüfen, dass die mikrobielle Konzentration bestimmt mit dem Spektralphotometer im Schritt 3.1.7 korrekt ist und sicherstellen, dass gab es keine mikrobielle Kontamination der Umwelt. Eine mikrobielle Kontamination der Umwelt kann leicht durch das Auftreten von verschiedenen Arten von mikrobiellen Kolonien nach 24 h Kultur erkannt. Darüber hinaus muss keine Verkeimung des Mediums TSB während ihrer Manipulation in Dezimal Verdünnungsreihen mit einer negativen TSB Steuerplatte sichergestellt werden.<ol>
<li>Die sterile TSB (vorbereitet in Schritt 3.1.4) in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mikropipette mit passenden autoklaviert Tipps unter aseptischen Bedingungen zu verzichten. Einer von ihnen wird als Negativkontrolle TSB genutzt werden.</li>
		<li>Führen Sie Dezimal Verdünnungsreihen mit der mikrobiellen Brühe Suspension in Schritt 3.1.9 in der sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit TSB genutzt.</li>
		<li>100 µL jeder Verdünnung auf TSA Platten mit einem vorsterilisierten Drigalski-Spatel oder ein alternatives Instrument zu verbreiten. Auch verbreitete 100 μL der TSB Medium ohne Mikroorganismus (vorbereitet in Schritt 3.2.1) auf einem TSA-Teller als eine negative TSB Steuerungsplatine.</li>
		<li>Aerob inkubieren Sie die TSA Platten aerob bei 37 ° C für 24 h.</li>
		<li>Die Anzahl der Kolonien zu prüfen, ob die KBE/mL sind ähnlich wie in Schritt 3.1.7 bestimmt.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob keine mikrobielle Umweltverschmutzung auf die TSA Platten mit nur einer Art von Kolonien.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob keine mikrobielle Kontamination auf der TSB Negativkontrolle Platte zeigt keine Kolonien</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Messung der antimikrobiellen Aktivität auf Oberflächen (Kontakt-Methode)
 Hinweis: Wenn Flächenkontakt antimikrobielle Hauptmechanismus einige advanced Materials sein könnte, kann die Kontaktmethode sehr nützliche Informationen über die antimikrobielle Kapazität dieser Materialien bereitstellen. Bei dieser Methode die Mikroorganismen befinden sich direkt auf die Materialoberfläche und ihrer Wachstumshemmung kann nach einer gewissen Zeit bestimmt werden.
<ol><li>
Ursprüngliche Verfahren
	<ol>
<li>Vorbereiten und Autoklaven TSB nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Gießen Sie die TSB in ein 50 mL vorsterilisierten Zentrifugenröhrchen mit einer vorsterilisierten serologische Pipette unter aseptischen Bedingungen mit dem Bunsenbrenner oder einem Laminar-Flow-Haube.</li>
		<li>Kultur, die die verschiedenen Mikroorganismen aerob getestet werden in der Röhre mit TSB in einem Orbitalschüttler (140 u/min) bei 37 ° c über Nacht</li>
		<li>Verdünnen Sie die Übernachtung Kultur in 20 mL TSB in ein 50 mL vorsterilisierten Zentrifugenröhrchen zu einer Konzentration von etwa 106 KBE/mL (ermittelt mit einem Spektrophotometer bei 540 nm). Hinweis: Die Kultur und Küvette Volumes, die Absorption messen müssen nach der Art der Spektralphotometer genutzt ausgewählt werden.</li>
		<li>Führen Sie Dezimal Verdünnungsreihen dieser Kultur in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit TSB. 100 µL der Kultur auf TSA Platten verteilt und inkubieren sie aerob bei 37 ° C für 24 h.</li>
		<li>Die Anzahl der Kolonien zu einer anfänglichen Zellkonzentration von ca. 1 x 106 KBE/mL zu gewährleisten</li>
		<li>Platz 4 Steuerscheiben für mikrobielle zählen nach 24 h und 4 Beispiel-Disketten jeder Art von den getesteten Materialien zum mikrobiellen zählen nach 24 h im Brunnen eine sterile 48-Well-Platte trennt.</li>
		<li>Pipette 150 µL der mikrobiellen Suspension auf jeder Oberfläche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikrobielle zählen zur Kontrolle und geprüften Materialien (nach 24 h)
	<ol>
<li>Nach Schritt 4.1.6 aerob inkubieren der 4 Beispiel-Disketten, die noch in der 48-Well-Platte bei 37 ° C für 24 h. Hinweis: Diese 24 h Inkubationszeit kann geändert werden, um die Wachstumshemmung zu kürzeren oder längeren Zeiten zu studieren.</li>
		<li>Nach 24 h Inkubation pipette 850 µL steriler PBS auf die Oberfläche der Probe 4 Scheiben und mischen Sie es mit den 150 µL der mikrobiellen Suspension.</li>
		<li>Sammeln Sie die PBS/mikrobielle Aussetzung Mischung und jedes Laufwerk von 48-Well-Platte und übertragen Sie sie auf einem vorsterilisierten 10 mL-Tube.</li>
		<li>Wirbel der PBS/mikrobielle Aussetzung Mischung und jedes Laufwerk für 1 min beschallen es bei 50 Hz für 5 min und Wirbel, die er wieder für 1 min um sicherzustellen, dass keine lebensfähigen Mikroorganismen bleiben die Materialoberfläche eingehalten.</li>
		<li>100 µL der Kultur auf TSA Platten verteilt und dezimal Verdünnungsreihen jeder beschallten Kultur in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit TSB durchzuführen und inkubieren sie aerob bei 37 ° C für 24 h.</li>
		<li>Die Anzahl der Kolonien, die die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen auf jede Probe und Kontrolle Plattenoberfläche sind. Drücken Sie diese Anzahl der lebensfähigen Zellen (KBE/mL).</li>
		<li>Nehmen Sie ein Foto von der letzten mikrobielle Kultur für die Probe und Kontrolle Datenträger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. antimikrobielle Ergebnisermittlung
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig1.jpg"> Abbildung 1: Messungen für die normalisierte Breite antimikrobielle "Heiligenschein". Dieses Fenster zeigt den Durchmesser der Hemmung Zone (dIz) und der Disk-Durchmesser (d). <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol><li>
Diffusion-Methode Ergebnisermittlung
	<ol>
<li>Messen Sie den Durchmesser der Hemmung Zone (dIz) und der Disk-Durchmesser (d) (siehe Abbildung 1) mit einem digitalen Bremssattel. Hinweis: Die Hemmung Zone oder antimikrobielle "Halo" entsteht als Folge der mikrobiellen Wachstumshemmung durch die antimikrobielle Material Platte hergestellt (siehe Abbildung 1). Es ist möglich, zu beobachten, dass es eine transparente Ring Zone in der Nähe der Probe im Vergleich zum Rest der Platte wo die Mikroorganismen sind richtig gewachsen (undurchsichtige Zone).</li>
		<li>Bestimmen Sie die normalisierten Breite der antimikrobiellen "Halo" (nwHalo) für die einzelnen Datenträger durch die Anwendung von Gleichung (1). (1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq1.jpg">
</li>
		<li>Der Mittelwert und die Standardabweichung der normalisierten Breite antimikrobielle "Halo" mit den 4 bestimmt nwHalo Werte jeder einzelnen Probe zu bestimmen.</li>
		<li>Nehmen Sie ein Foto von der letzten mikrobielle Kultur mit der materiellen Scheibe. Hinweis: Der Durchmesser der Hemmung Zone (dIz) und der Disk-Durchmesser (d) können auch von der Fotografie im Schritt 5.1.4 mithilfe einer geeigneten Bildbearbeitungssoftware gemessen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kontaktmethode Ergebnisermittlung
	<ol>
<li>Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen erholte sich nach Gleichung (2). (2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq2.jpg"> Hinweis: Hier ist N die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen pro cm2 pro Prüfling wiederhergestellt; C ist die Keimzahl; D ist der Verdünnungsfaktor; A ist die Fläche des Prüfkörpers in cm2 mit der Probe Scheibe Durchmesser bestimmt.</li>
		<li>Bestimmen Sie den Verlust der Lebensfähigkeit (LV), die Hemmung des Zellwachstums reflektieren durch die Anwendung von Gleichung (3). (3)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq3v3.jpg"> Hinweis: Hier ist C die durchschnittliche Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen (N) in KBE/mL•cm2, erholte sich von der Kontrollproben nach 24 h; S ist die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen (N) in KBE/mL•cm2, erholte sich von der Probekörper nach 24 h.</li>
		<li>Der Mittelwert und die Standardabweichung des Verlustes der Lebensfähigkeit mit 4 ermittelten LV(%) Werte jeder einzelnen Probe zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego Ferrer, G., Suay Ant&#243;n, J., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+poly+(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroporous+poly(methyl+methacrylate)+produced+by+phase+separation+during+polymerisation+in+solution.">Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution.</a> Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Llorens-G&#225;mez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+and+water+vapour+sorption+of+highly+porous+poly(methyl+methacrylate).">Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate).</a> Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Campillo-Fern&#225;ndez, A. J., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Monle&#243;n-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels+prepared+by+radical+polymerisation+with+methanol+as+diluent.">Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent.</a> Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).</li><li>Rodr&#237;guez-Hern&#225;ndez, J. C., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Monle&#243;n-Pradas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+nanocomposite+scaffolds+with+ordered+cylindrical+orthogonal+pores.">Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores.</a> J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).</li><li>Br&#237;gido-Diego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylic+scaffolds+with+interconnected+spherical+pores+and+controlled+hydrophilicity+for+tissue+engineering.">Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering.</a> J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-G&#225;mez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+water+diffusion+and+compression+performance+of+crosslinked+alginate+with+a+minuscule+amount+of+graphene+oxide.">Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide.</a> Sci Rep. 7, 11684 (2017).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+irregular+graphene+oxide+tubes+using+green+chemistry+and+their+potential+use+as+reinforcement+materials+for+biomedical+applications.">Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications.</a> PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).</li><li>S&#225;nchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fern&#225;ndez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels+reinforced+with+graphene+oxide:+Remarkable+improvement+of+water+diffusion+and+mechanical+properties.">Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties.</a> J Appl Polym Sci. , (2018).</li><li>Serrano-Aroc, &. #. 1. 9. 3. ;., Iskandar, L., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+synthetic+routes+to+alginate-graphene+oxide+composite+hydrogels+with+enhanced+physical+properties+for+bioengineering+applications.">Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications.</a> Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).</li><li>Llorens-G&#225;mez, M., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Advanced+Hydrogels+of+Calcium+Alginate/Carbon+Nanofibers+with+Enhanced+Water+Diffusion+and+Compression+Properties.">Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties.</a> Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).</li><li>Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+testing+by+a+standardized+single+disk+method.">Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method.</a> A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).</li><li>Taubes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteria+fight+back.">The bacteria fight back.</a> Science. 321 (5887), 356-361 (2008).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=10+x+'20+progress--development+of+new+drugs+active+against+Gram-negative+bacilli:+an+update+from+the+infectious+diseases+society+of+America.">10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die antimikrobielle Aktivität des neuen Hochleistungswerkstoffe durch dieses easy-to-Follow-Protokoll, bestehend aus 2 komplementäre Verfahren basierend auf 2 vorhandenen Methoden analysiert werden kann: die Agar-Disk-Diffusion testen38 und die antimikrobielle Aktivität gemessen am Materialoberflächen gemäß ISO 22196:2007 Norm39.
In diesem Forschungsfeld sind viele antimikrobielle Tests in der Literatur beschrieben sehr Assay abhängig. Daher ist es sehr wichtig, detaillierte und einheitliche Protokolle im Ort in Laboratorien. Dieser Artikel ist ein Schritt in diese Richtung. Darüber hinaus könnte es sehr hilfreich für viele Forscher, die weniger Erfahrung auf diesem Gebiet und erfordern detaillierte, Schritt für Schritt Verfahren zu folgen, um genaue Ergebnisse zu erzielen.
Dieses Protokoll kann mit vielen Arten von Materialien geschnitten Scheibe Formen von 10 mm Durchmesser verwendet werden. Spröde Materialien können in einem geeigneten Lösungsmittel für 1 h den Schneidprozess einfacher Rendern geschwollen sein. So können hydrophile Materialien wie Alginate in autoklaviert destilliertem Wasser hydratisiert werden. Anderen Lösungsmitteln wie Ethanol, Keton und Dichlormethan, können eingesetzt werden, um die hydrophobe Materialien für 1 h vor dem Schneiden sie anschwellen. Jedoch einige Materialien wie poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) müssen nicht geschwollen sein und sie können direkt geschnitten werden. Danach ist es sehr wichtig die Probe materiellen Datenträger in einem Vakuumofen Trocknen und Sterilisieren Sie jedes Exemplar mit Ethanol und UV-Bestrahlung für 1 h um Kontamination zu vermeiden.
Dieses Protokoll empfiehlt TSA und TSB als Kultur, Medien und die Verwendung von Reinkulturen von 3 Mikroorganismen, ein breites Spektrum von Mikroorganismen zu erreichen: die grampositiven Bakterien Staphylococcus Aureus, Gramnegative Bakterium Escherichia coli, und die Hefe Candida Albicans. Alternative Kultur, Medien und andere Mikroorganismen benötigen unterschiedliche Inkubationsbedingungen könnte jedoch auch mit diesem Protokoll verwendet werden. Manchmal wird nur 1 Mikroorganismus getestet, um eine erste Vorstellung von der antimikrobiellen Wirkung eines neuen Materials haben.
Die Materialien zeigen starke antimikrobielle Aktivität gegen die empfohlenen 3 verschiedene Arten von Mikroorganismen sollte auch geprüft werden, gegen Antibiotika-resistente Krankheitserreger wie Methicillin-resistenten Staphylococcus Epidermidis (MRSE), die wurden erfolgreich mit diesem Protokoll genutzt. Andere wichtigeren resistente Mikroorganismen die viel Sorge sind grampositive Methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus (MRSA) und Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE) und Gram-negativen Pseudomonas Aeruginosa40,41.
Biofilm-Hemmung und der antimikrobiellen Wirkung von Materialien gegen andere Arten von Mikroorganismen wie Viren und Parasiten können mit diesem Protokoll getestet werden. Dieses Protokoll bietet jedoch einen sehr guten Ausgangspunkt für eine antimikrobielle Studie eines neuen advanced Materials.
In der antimikrobiellen Agar Festplatte Diffusion Test tritt ein entscheidender Schritt der probenscheibe hat in der Mitte des Tellers platziert werden, da einige Materialien Falten, sobald sie in den Agar Medien Kontakt. In diesem Fall empfiehlt es sich, ein paar sterile Pinzette verwenden, um die Probe sorgfältig zu entfalten. Auf der anderen Seite in der Kontakt-Methode ist es entscheidend, die Kontrolle zu waschen und Beispiel-Disketten sehr gut mit PBS durch pipettieren sie viermal gefolgt von einem kräftig aufschütteln und Beschallung um sicherzustellen, dass keine lebensfähigen Mikroorganismen bleiben auf das Material eingehalten Oberfläche.
Dieses video Protokoll kann genutzt werden, in vielen Bioengineering-Anwendungen, z. B. Bioverfahrenstechnik Gewebetechnik, kontrollierte Medikamentenabgabe, Verpackungsmaterialien, Abwasserbehandlung und Landwirtschaft, die Biomaterialien mit einem hoch wünschenswert antimikrobielle Kapazität.
Die Ergebnisse mit diesem Protokoll sind qualitative (die Bilder) und quantitative (die normalisierten Breite antibakterielle "Halo" und der Verlust der Rentabilität) mit eine gute Analyse ihrer Reproduzierbarkeit (Mittelwert ± Standardabweichung). Beim Vergleich von verschiedener Materials müssen diese Mittelwerte erhalten mit der Diffusion und Kontakt-Methode-Ergebnisse-Analyse analysiert werden, durch einfache ANOVA, gefolgt von der Türkei post Hoc Analyse, um zu studieren, wenn sie, statistisch signifikant sind verschiedene (p < 0,01).

Implantatversagen ist oft eine Folge von mikrobiellen Infektionen, die trotz antimikrobielle Prophylaxe und aseptische Arbeitsbedingungen auftreten. Dieses Problem wird verursacht sehr hohe Kosten im Gesundheitswesen und ist schmerzlich unter Patienten1. Wichtige Bakterien wie Staphylococcus Aureus gelten derzeit als sehr gefährliche Erreger nosokomialer Infektionen mit Kathetern und anderen medizinischen Implantaten verbunden und sind die wichtigsten Schadstoffe von medizinischen Instrumenten2. Daher ist die Entwicklung von neuartigen antimikrobiellen Strategien für Tages- und medizinische Zwecke dringend erforderlich.
Antimikrobielle Wirkstoffe gehören Antibiotika3, Quaternäre Ammoniumverbindungen4, Ionen/Metalloxide5und antimikrobielle Peptide (AMPs)6. Antibiotika sind weniger effizient durch bakterielle Resistenz7, allmählich die spendenbedarf Antibiotika Übernutzung8ist. Quaternäre Ammoniumverbindungen sind nur wegen Antibiotikaresistenz9sehr effizient für den kurzfristigen Einsatz. Ionen/Metalloxide haben lange als sehr effektive antimikrobielle Wirkstoffe verwendet worden und dienen in vielen gemeinsamen kommerziellen Produkten wie Bandagen, Wasserfilter, Farben, etc.10,11,12. Jedoch wurde nachgewiesen, dass diese Arten von Verbindungen zu einigen Arten von Säugerzellen13giftig sein können.
Ampere zeigen ausgezeichnete antimikrobielle und immunmodulatorische Eigenschaften14,15, und Bakterien scheinen16finden es sehr schwierig, eine Resistenz gegen sie zu entwickeln. Allerdings ist der Prozess um reine Ampere produzieren teuer; Daher ist eine groß angelegte Produktion nicht lebensfähig. So entwickelte Strategien zu begegnen, die die Probleme in der Herstellung von AMPs wurden (z.B., kleine Molekulare antibakterielle Peptoid Mimik17, Peptoids18, α-Peptide19 und β-Peptide20). Methacrylat-ended Polypeptide und Polypeptoids wurden für antimikrobielle und Antifouling-Beschichtungen-21synthetisiert.
Die Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe wie fortschrittliche Materialien in reiner oder Mischform, in der Lage, Vorbeugung und Behandlung von multiresistenten Infektionen ist immer notwendig. Zahlreiche neue Hochleistungswerkstoffe für viele Bioengineering-Felder wie Gewebe und Bioverfahrenstechnik wurden mit verbesserten chemischen und physikalischen Eigenschaften in den letzten Jahrzehnten durch verschiedene Methoden entwickelt: Plasmapolymerisation Pfropfen auf eine hydrophobe Substrat22,23,24, Anpassung der Vernetzungsgrad Dichte25,26, Polymerisation in Lösung27,28,29 , 30, Porogen Auflösung31,32, und durch den Einbau von Nanomaterialien wie Graphene oxid (GO)33,34,35,36 und Kohlenstoff Nanofasern (CNFs)37.
Die Studie der antimikrobiellen Kapazität dieser neuen Materialien könnten exponentiell ihre potenziellen Bioengineering Anwendbarkeit und, daher unverzichtbar geworden. Wir präsentieren ein easy-to-Follow-Protokoll um die antimikrobielle Wirksamkeit solcher neuen fortschrittlichen Materialien zu quantifizieren. Hier, nach der Probenvorbereitung zwei komplementäre Methoden gefolgt sind: die erste basiert auf dem Agar Festplatte Diffusion Test38 (Diffusion-Methode) und die zweite basiert auf der ISO 22196:2007 Norm39 , die antimikrobielle Wirkung auf Messen Oberflächen (Kontakt-Methode).

<table><tbody><tr><td>Cylindrical punch&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>10 mm diameter</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>soria genlab</td><td>P101</td><td>90 mm diameter, sterile</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar (TSA)</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>Dehydrated medium 500 g (powder)</td></tr><tr><td>Tryptic soy broth (TSB)</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>Dehydrated medium 500 g (powder)</td></tr><tr><td>Sterile cotton swab</td><td>EUTOTUBO</td><td>300200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>429900</td><td>50 mL, sterile</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83813360</td><td>Absolute ethanol</td></tr><tr><td>Sterile 48-wells plate</td><td>COSTAR</td><td>3548</td><td>Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene</td></tr><tr><td>A pair of tweezers</td><td>BRAUN</td><td>24612036</td><td>Toothless</td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS).</td><td>VWR</td><td>E404-100TAPBS</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum oven with a connected vacuum pump</td><td>JP Selecta, SA</td><td>5900620</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood</td><td>TELSTAR Technologies, SL</td><td>TELSTAR AH-100</td><td>12.0 W lamp of UV-C radiation</td></tr><tr><td>Class II Biological safety cabinet</td><td>LABOGENE</td><td>MARS 1200</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ASTEC CO, LTD</td><td>SCA-165DR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Biosan</td><td>V-1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Macherey-Nagel, Germany</td><td>Nanocolor UV/VIS II</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>JP Selecta, SA</td><td>7001539</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol burner</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>1658/20</td><td>In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>sartorius stedim</td><td>8864845</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>SELECTA</td><td>3000617</td><td>50/60 Hz</td></tr><tr><td>Digital calliper</td><td>ACHA</td><td>17-260</td><td>0-150 mm</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td>25 mL, sterile</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td>5 mL, sterile</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>VWR</td><td>612-5541</td><td>10 mL, sterile</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>FA10005P</td><td>Pipetman L P200L, plastic 20-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>Pipetman P1000, 200-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>GILSON</td><td>FA10016</td><td>Pipetman L P12X300L, 20-300 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-200-960</td><td>2-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-1K0-480</td><td>100-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Pre-sterilized tube&amp;nbsp;</td><td>INSULAB</td><td>301402</td><td>10 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Photo camera</td><td>Canon EOS 5D</td><td></td><td>Any camera with high resolution can also be utilized</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td></td><td>&amp;nbsp;strain V329</td><td>Cucarella et al. &lt;em&gt;J Bacteriol&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;183 (9)&lt;/strong&gt;,&amp;nbsp; 2888&amp;ndash;2896 (2001)</td></tr><tr><td>Gram-negative bacteria &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 101</td><td></td></tr><tr><td>Yeast &lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 1394</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>DASLAB</td><td>175508</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>JP Selecta, SA</td><td>4002136</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer-cuvettes</td><td>UVAT Bio CB</td><td>F-0902-02</td><td>4,5 mL</td></tr><tr><td>Drigalski spatula</td><td>LABBOX</td><td>SPRP-L05-1K0</td><td>Sterile, disposable&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>glass balls (2 mm diameter)</td><td>Hecht Karl</td><td>1401/2</td><td>Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula</td></tr><tr><td>Autoclave bags</td><td>DELTALAB</td><td>200318</td><td>To sterilize microbiological residues or contaminated material</td></tr><tr><td>Electronic pipette filling device</td><td>JetPip</td><td>JET BIOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-100-010</td><td>100 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-250-010</td><td>250 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-500-010</td><td>500 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-1K0-010</td><td>1000 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>DENIA</td><td>2278000000</td><td></td></tr><tr><td>Indicator tape for sterilization</td><td>LABBOX</td><td>STAP-A55-001</td><td>Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.</td></tr><tr><td>Universal test tube rack</td><td>LABBOX</td><td>MTSP-001-001</td><td>To hold centrifuge tubes</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube rack</td><td>VWR</td><td>211-0210</td><td>To hold microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Sterile loop</td><td>ACEFE S.A.</td><td>100140055</td><td>10 &amp;micro;L of capacity for microbial culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M1</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M2</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M3</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type3</td></tr><tr><td>Material M4</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material C</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Control material</td></tr></tbody></table>

antimicrobial characterization of advanced materials for bioengineering applications

Die Entwicklung von neuen fortschrittlichen Materialien mit verbesserten Eigenschaften gewinnt immer mehr Bedeutung in ein breit gefächertes Anwendungsspektrum Bioengineering. So sind viele neue Biomaterialien entworfen, um bestimmte Umgebungen erforderlich für biomedizinische Anwendungen wie Gewebetechnik und kontrollierte Medikamentenabgabe zu imitieren. Die Entwicklung von Materialien mit verbesserten Eigenschaften für die Immobilisierung von Zellen oder Enzyme ist auch ein Aktuelles Forschungsthema in Bioverfahrenstechnik. Allerdings ist eine der begehrtesten Eigenschaften eines Materials in diesen Anwendungen die antimikrobielle Kapazität keine unerwünschten Infektionen zu vermeiden. Hierzu stellen wir Ihnen einfach zu befolgende Protokolle für die antimikrobielle Charakterisierung von Materialien auf Basis von (i) der Agar Festplatte Diffusion Test (Diffusion-Methode) und (Ii) die Norm ISO 22196:2007, die antimikrobielle Wirkung auf Oberflächen (Kontakt zu messen -Methode). Dieses Protokoll muss mit grampositive und Gramnegative Bakterien und Hefen decken ein breites Spektrum von Mikroorganismen durchgeführt werden. Als Beispiel werden 4 Materialien mit unterschiedlicher chemischer Natur getestet nach diesem Protokoll gegen Staphylococcus Aureus, Escherichia coliund Candida Albicans. Die Ergebnisse dieser Tests zeigen nicht-antimikrobielle Aktivität für das erste Material und antibakteriellen Aktivität gegen grampositive und Gramnegative Bakterien für die anderen 3 Materialien erhöhen. Keines der 4 Materialien sind jedoch in der Lage, das Wachstum von Candida Albicanshemmen.

Dieses Protokoll wurde eingesetzt, als Beispiel, die antimikrobielle Kapazität 4 Materialien mit unterschiedlicher chemischer Natur gegen die 3 testen empfohlen Mikroorganismen: Staphylococcus Aureus, Escherichia coliund Candida Albicans . Die Ergebnisse der Agar Festplatte Diffusion Tests (Diffusion-Methode) ausgestellt nicht antimikrobielle Aktivität für das erste Material (M1), wie es in der Steuerelement-Scheibe (C, Bild nicht gezeigt geschah) und erhöhte antibakterielle Aktivität gegen grampositive und Gramnegative Bakterien für die anderen 3 Materialien, M2, M3 und M4 (siehe Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig2.jpg"> Abbildung 2: antimikrobielle Verbreitung Methodenergebnisse. Dieses Fenster zeigt die antimikrobielle Diffusion-Methode für die 4 Material (M1, M2, M3 und M4) Datenträger (10 mm Durchmesser x 1 mm Dicke) gegen S. Aureus und E. Coli nach 24 h Inkubation. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Abbildung 3 zeigt die verschiedenen normalisierten breiten antimikrobiellen "Halo" (nwHalo) für die verschiedenen Beispiel Materialien M1, M2, M3 und M4 gegen grampositive und Gramnegative Bakterien mit Gleichung (1) berechnet. Keines der 4 Materialien konnten jedoch hemmen das Wachstum der Hefe Candida Albicans (Bilder nicht gezeigt).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2.jpg"> Abbildung 3: antimikrobielle Diffusion "Halo" Ergebnisse. Dieses Panel zeigt die normalisierte "Halo" (nwHalo) für jedes Material (M1, M2, M3 und M4) Laufwerk (Durchmesser 10 mm x 1 mm Dicke) gegen S. Aureus und E. Coli nach 24 h Inkubation. Die Unterschiede sind statistisch signifikant (p < 0,01). Jedoch stellte Probe M1 keine antimikrobielle Aktivität. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die Ergebnisse der Kontaktmethode ausgestellt auch nicht antimikrobielle Aktivität für das erste Material (M1), wie es in den Kontrolle Datenträger (C) und die zunehmende antibakterielle Aktivität gegen Grampositive und Gramnegative Bakterien für die anderen 3 Materialien (siehe ( Abbildung 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3.jpg"> Abbildung 4: antimikrobielle Kontakt Methodenergebnisse. Dieses Fenster zeigt die jeweiligen 90 mm Platten des 4 Material (M1, M2, M3 und M4) Oberfläche antimikrobielle Aktivität Tests nach ISO 22196:2007 nach 24 h Inkubation für S. Aureus und E. Coli (Verdünnungsfaktor 10-4). C ist die lebensfähigen Bakterien nach 24 h Inkubation von der Kontrolle Festplatte wiederhergestellt. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Der Verlust der Lebensfähigkeit (%) wurde durch Gleichung (2) und (3) bestimmt, wie in diesem Protokoll angegeben (siehe Abbildung 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Verlust der Lebensfähigkeit von Kontaktmethode. Dieses Fenster zeigt den Verlust der Lebensfähigkeit (%) für M1, M2, M3 und M4 gegen S. Aureus und E. Coli auf den Oberflächen. Probe M1 ausgestellt keine antimikrobielle Aktivität. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Keines der 4 Materialien konnten jedoch hemmen das Wachstum der Hefe Candida Albicans durch die Kontaktmethode entweder (Bilder nicht gezeigt). Daher 3 diese 4 advanced Materials zeigte positive antimikrobielle Ergebnisse gegen grampositive und Gramnegative Bakterien und so könnte sehr nützlich sein für viele Bioengineering Anwendungen hohe antibakterielle Aktivität Anforderungen. Keines der 4 Materialien konnten jedoch hemmen das Wachstum der Hefe.

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Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die antimikrobielle Charakterisierung von Materialien. Hier wird die antimikrobielle Wirkung auf Materialoberflächen gemessen durch zwei Methoden, die einander ergänzen: eine basiert auf dem Agar Festplatte Diffusion Test, und der andere ist ein Standardverfahren, basierend auf der ISO-Norm 22196:2007.

Antimikrobielle Charakterisierung der Hochleistungswerkstoffe für Bioengineering-Anwendungen

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.9K Aufrufe.  Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die antimikrobielle Charakterisierung von Materialien. Hier wird die antimikrobielle Wirkung auf Materialoberflächen gemessen durch zwei Methoden, die einander ergänzen: eine basiert auf dem Agar Festplatte Diffusion Test, und der andere ist ein Standardverfahren, basierend auf der ISO-Norm 22196:2007.

Serie: Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Forschung

Biotechnik

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Immunologie und Infektion

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Targeting Biofilm Assoziierte<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Verwendung von Resazurin Based Drug-Anfälligkeit Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthese von Multi-walled Carbonnanotubes mit Silber-Nanopartikeln und Bewertung ihrer antibakteriellen Aktivitäten und zytotoxische Eigenschaften modifiziert

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been explored previously in clinical and environmental settings and in consumable food products. However, a lack of consistency in the experimental methods and materials used has culminated in conflicting results, even amongst studies of the same nanostructure types and bacterial species. For researchers who wish to employ nanostructures as an additive or coating in a product design, these conflicting data limit their utilization in clinical settings. 
To confront this dilemma, in this article, we present four different methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, and discuss their applicability in different scenarios. Adapting consistent methods is expected to lead to reproducible data that can be compared across studies and implemented for different nanostructure types and microbial species. We introduce two methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and two methods for the antimicrobial activities of nanostructured surfaces. 
For nanoparticles, the direct co-culture method can be used to determine the minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations of nanoparticles, and the direct exposure culture method can be used to assess real-time bacteriostatic versus bactericidal activity resulting from nanoparticle exposure. For nanostructured surfaces, the direct culture method is used to determine the viability of bacteria indirectly and directly in contact with nanostructured surfaces, and the focused-contact exposure method is used to examine antimicrobial activity on a specific area of a nanostructured surface. We discuss key experimental variables to consider for in vitro study design when determining the antimicrobial properties of nanoparticles and nanostructured surfaces. All these methods are relatively low cost, employ techniques that are relatively easy to master and repeatable for consistency, and are applicable to a broad range of nanostructure types and microbial species.

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

We introduce four methods to evaluate the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces using in vitro techniques. These methods can be adapted to study the interactions of different nanoparticles and nanostructured surfaces with a broad range of microbial species.

Evaluierung der antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen in vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

Erzeugung größerer bakterieller Biofilm-Biomasse mit PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Antibakterielle Graphenoxid/Kupfer-Nanokomposite für resistente Bakterien

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to antibiotics. Developing&#160;antimicrobial agents that can replace existing antibiotics is essential because antibiotic-resistant bacteria have resistance mechanisms for all current antibiotics and can promote nosocomial infections. To address this challenge, in this study, we propose graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as antibacterial materials that can replace the existing antibiotics. GO/Cu nanocomposites are characterized by transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. They show that copper (Cu) nanoparticles are well-grown on the graphene oxide sheets. Additionally, a microdilution broth method is used to confirm the efficacy of the antimicrobial substance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), which are frequently implicated in nosocomial infections. Specifically, 99.8% of MRSA and 84.7% of P. aeruginosa are eliminated by 500 &#181;g/mL of GO/Cu nanocomposites. Metal nanocomposites can eradicate antibiotic-resistant bacteria by releasing ions, forming reactive oxygen species, and physically damaging the bacteria. This study demonstrates the potential of antibacterial GO/Cu nanocomposites in eradicating antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Metallische Nanokomposite zur Eliminierung antibiotikaresistenter Bakterien

Herein, we introduce graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as an antibacterial nanomaterial. The antibacterial effectiveness of the GO/Cu nanocomposites was evaluated against both antibiotic-resistant gram-positive and gram-negative bacteria.

Herstellung von antibakteriellen Graphenoxid/Kupfer-Nanokompositen

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to ...

<meta charset="utf8"></head><body> Synthese von Zinkoxid-Nanopartikeln und Analyse ihrer antibakteriellen Wirkung

Preparation of Zinc Oxide Nanoparticles and the Evaluation of their Antibacterial Effects

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant bacterial strains in hospitals has been attributed to the extensive and varied use of antibiotics, further exacerbating the problem of antibiotic resistance. Metal nanomaterials have been widely studied as an alternative solution for eradicating antibiotic-resistant bacterial cells. Metallic nanoparticles attack bacterial cells through various mechanisms, such as the release of antibacterial ions, generation of reactive oxygen species, or physical disruption, against which bacteria cannot develop resistance. Among the actively researched antimicrobial metal nanoparticles, zinc oxide nanoparticles, which are FDA-approved, are known for their biocompatibility and antibacterial properties. In this study, we focused on successfully developing a precipitation method for synthesizing zinc oxide nanoparticles, analyzing the properties of these nanoparticles, and conducting antimicrobial tests. Zinc oxide nanoparticles were characterized using transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS), ultraviolet/visible spectroscopy, and X-ray diffraction (XRD). Antibacterial tests were conducted using the broth microdilution test with the multidrug-resistant strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa. This study demonstrated the potential of zinc oxide nanoparticles in inhibiting the proliferation of antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erforschung der antibakteriellen Wirkung von Zinkoxid-Nanopartikeln bei der Überwindung von Antibiotikaresistenzen

In this study, zinc oxide nanoparticles were synthesized using a precipitation method. The antibacterial effect of the synthesized particles was tested against multidrug-resistant methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa bacterial strains.

Herstellung von Zinkoxid-Nanopartikeln und die Bewertung ihrer antibakteriellen Wirkung

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant ...