Name: isolation of human endometrial stromal cells for in vitro decidualization
Uploaded: 2018-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Alle menschlichen Endometrium Biopsien gesammelt für diese Studie wurden erreicht von der Washington University in St. Louis, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie mit einer institutionellen Review Board (IRB) genehmigt schriftliche Einverständniserklärung.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie 500 mL 1 x Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) durch Zugabe von 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin, die Medien mit Flasche (weiter als HBSS + Medium verwiesen).</li>
	<li>500 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium vorbereiten: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F12) mit Phenol rot, L-Glutamin und 15 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES) durch Zugabe von 1 % Antibiotikum antimykotische Lösung (Endkonzentration ist 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,25 µg/mL Fungizone), das Medium mit Flasche (weiter als HESC Isolation Medien verwiesen).</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mL DMEM/F12 mit Phenol rot, L-Glutamin und 15 mM HEPES durch Zugabe von 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 1 X Na2HCO3und 1 % Penicillin (10.000 U/mL) und Streptomycin (10.000 µg/mL) (Stift Strep) an die Medien, die enthalten (weitere Flasche als HESC Medien verwiesen).</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mL reduziert Serum Medium mit L-Glutamin, 2,4 g/L Natriumbicarbonat und HEPES mit 2 % Holzkohle abgestreift fötalen Rinderserum (CsFBS) und 1 % Strep Stift an die Medien, die Flasche (weiter als Decidualization Medien referenziert) enthalten.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mL Phenol rot frei DMEM/F12 durch Zugabe von 2 % Holzkohle fötalen Rinderserum (CsFBS) in den Medien mit Flasche (weiter als Änderung Medien referenziert) beraubt.</li>
	<li>Vorbereitung 10 nM Estradiol (E2), 1 µM Medroxyprogesteron Acetat (MPA) und 50 µM zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) in einem 15 mL Polypropylen konische Rohr und Hinzufügen einer 2 mL pro gut aliquoten vorbereitete Decidualization Medien für in-vitro- Decidualization-Assay (weiter als EPC Medien verwiesen).</li>
	<li>Bereiten Sie 50 mL des Einfrierens Medien mit 90 % FBS und 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in 50 mL Polypropylen konischem Rohr (weiter als Einfrieren Medien referenziert vor).</li>
	<li>Vorher wiegen 25 mg Kollagenase und 5 mg der DNase I in ein 50 mL konische Polypropylen-Rohr und Speicher bei-20° C.</li>
</ol>(2) menschliche Endometrium-Biopsie-Übernahme
<ol><li>Der IRB genehmigten Klinik in HBSS einzuholen Sie menschlichen Endometrium-Biopsie-Proben in der proliferativen Phase (Tag 9 - Tag 12) des Menstruationszyklus.</li>
	<li>Biopsie-Proben mit 1 mL vorgewärmte 37 ° C HBSS + Medium waschen und vorsichtig schütteln entfernen Sie überschüssiges Blut und Schleim.</li>
</ol>3. Isolation von menschlichen Stromazellen Endometriumzellen (HESC)
Hinweis: Dieses Verfahren isoliert wird in einer sterilen Umgebung unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.
<ol><li>Übertragen die Biopsie mit sterilisierten Pinzette in ein 50 mL konische Polypropylen Zentrifugenröhrchen mit 10 mL frisches HBSS.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Biopsie bei Raumtemperatur bei 500 X g 90 s.<ol>
<li>Wenn die Zelle Pellet Brüche, Re-spin die Biopsie bei 2.000 x g für 90 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium mit einer 1 mL pipettieren und Waschen mit 10 mL von 37 ° C vorgewärmt HESC Isolation Media gefolgt von Zentrifugation bei 500 X g 90 s.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium mit einer 1 mL pipettieren, und kräftig 3 mL frische HESC-Isolation-Medien, die Biopsie zu verdrängen.</li>
	<li>Dekantieren Sie die Biopsie in eine Petrischale mit 5 mL HESC Isolation Medien.</li>
	<li>Zerkleinere die Biopsie in als kleine Stücke wie möglich mit #5 Pinzetten und Scheren feine Geradstich für etwa 20 Minuten.</li>
	<li>Bereiten-DNase I und Kollagenase Enzyme durch Zugabe von 10 mL HESC Isolation Medien zu vorgewogene DNase I (0,5 mg/mL) und Kollagenase (2,5 mg/mL). Mischen Sie mit pipettieren.</li>
	<li>Pipette schneiden Gewebeproben mit einer 1 mL pipettieren in eine neue 50 mL konische Polypropylen-Rohr. Waschen mit 7 mL HESC Isolation Medien und fügen Sie in das Polypropylen Röhrchen, die vollständige Probe zu erwerben.</li>
	<li>Zentrifuge die Probe bei Raumtemperatur bei 800 X g für 2 min. entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit Pipette.</li>
	<li>Filtern Sie die DNase ich und Kollagenase Lösung durch 0,2 µm Filter 10 mL Spritze direkt auf Pellet angebracht.</li>
	<li>Wirbel für 10 s zu Pellet aufzuwirbeln.</li>
	<li>Digest in 37 ° C Wasserbad für 1,5 h, Vortexen für 10 s gründlich alle 10 min, bis Gewebe verdaut wird.</li>
	<li>Filtern Sie die Probe durch ein 40 µm Zelle Sieb gestapelt über eine 50 mL konische Polypropylen Röhrchen, die epithelialen Zellen und Gewebe Schutt zu entfernen. Hinweis: Stromale Zellen sind in der 50 mL konische Polypropylen-Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die 50 mL konische Polypropylen Rohr bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand mit einer 1-mL-Pipette vorsichtig zu entfernen.</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL HESC Isolation Medien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgesaugt, und dann Aufschwemmen Zellen in 6 mL HESC Medien und Pipette vorwärts und rückwärts zu mischen.</li>
	<li>Langsam Schicht auf 3 mL Dichte Gradienten Medien auf die resuspendierte Zellen, übrigen Blutzellen aus den Stromazellen Zellen, ohne dabei die Schichten vermischen zu trennen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das 15 mL Polypropylen-Rohr auf 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Sammeln Sie 5 mL des Überstands in einem neuen 50 mL Polypropylen-Rohr und fügen Sie eine zusätzliche 5 mL HESC Medien um die Zellen zu Aufschwemmen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur, gefolgt von Entfernung des Überstands und Zugabe von 6 mL HESC Medien. Wirbel die Probe für 10 s und Mix von pipettieren weiterleiten und 5 Mal umkehren.</li>
	<li>Aliquoten 10 µL neu suspendierten Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch für Zellzahl.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL von 0,4 % Trypan blau färben zu Zelle aliquoten und mischen Sie mit pipettieren. Laden Sie 10 µL der aliquoten und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.</li>
	<li>Platte die Zellen in eine geeignete Flasche total Zellzahl in 15 mL HESC Medien abhängig.<ol>
<li>Wenn die Gesamtzahl der Zellen weniger als 1 Million ist, Platte alle Zellen in 25 cm Kolben mit 6 mL HESC Medien. Wenn die Gesamtzahl der Zellen mehr als 1 Million ist, Platte alle Zellen in 75 cm Kolben mit 15 mL HESC Medien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Zellen in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C für mindestens 6 h zu gewährleisten korrekte Zelladhäsion und wechseln Sie das Medium HESC-Medien-Kultur.</li>
	<li>Kultur der isolierten HESC in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C für einen Zeitraum von 3-5 Tage bis die Zellen einer Monoschicht erreichen 80-90 % Konfluenz in einem vergoldeten Kolben bilden.</li>
	<li>Wechseln Sie HESC Medium alle zwei Tage.<ol>
<li>Warmen HESC-Medien im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min.</li>
		<li>Aspirieren Sie Medien aus der Flasche und fügen neue HESC-Medien in den Kolben (Arbeitsvolumen: 8 mL oder 16 mL pro 25 cm oder 75 cm Kolben bzw.).</li>
		<li>Setzen Sie Kolben wieder in die 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C, bis 80-90 % Konfluenz erreicht ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald HESC werden 80-90 % Zusammenfluss, Zellen übertragen von 25 cm bis 75 cm Kolben oder aus einem 75-cm-Flasche auf drei 75-cm-Küvetten. Hinweis: HESC kann eingefroren und zu diesem Zeitpunkt für zukünftige Experimente zur späteren Verwendung gespeichert werden.</li>
</ol>(4) Einfrieren und Auftauen embryonaler
<ol><li>Aspirieren Sie Medien aus der 75-cm-Flasche und 2 mL Trypsin-EDTA.</li>
	<li>Inkubieren Sie in einem 5 % CO2 Inkubator für 2-3 min bei 37 ° C, bis die Zellen aus der Flasche zu verdrängen.</li>
	<li>7 mL HESC Medien und Mischung gut durch pipettieren vorwärts- und hinzugeben.</li>
	<li>Bei 800 X g 2,5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt.</li>
	<li>Einfrieren von Rohren mit Zell-Linie, Datum und Passagenanzahl Label.</li>
	<li>Wieder aussetzen der Zelle Pellet in 5 mL des Einfrierens Medien.</li>
	<li>Aliquoten 1 mL neu suspendierten HESC jedes Rohr und Transfer Rohre bis-80 ° C Gefrierschrank.</li>
	<li>Übertragen Sie Rohre zu flüssigem Stickstoff innerhalb von 24 Stunden. Hinweis: Wenn Zellen Auftauen in naher Zukunft planen, speichern Sie gefrorene Zellen bei-80 ° C für einen Monat.</li>
	<li>Zum Auftauen die hESC Heizen Sie HESC Medien für 20 Minuten vor.</li>
	<li>25 cm Kolben 8 mL vorgewärmten HESC Medien hinzufügen.</li>
	<li>Rufen Sie den einfrierenden Schlauch aus dem flüssigen Stickstoff-Tank oder-80 ° C ab und Tauchen Sie das Rohr in 37 ° C Wasserbad für ca. 1-2 min Auftauen der Zellen.</li>
	<li>Aufgetauten HESC auf eine 25-cm-Flasche mit HESC Medien übertragen und in einem 5 % CO2 Inkubator über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Am nächsten Tag wechseln Sie das Medium HESC und warten Sie 2-3 Tage bis HESC konfluierende und Zellen auf 75 cm Kolben wie nachfolgend in Protokoll Nr. 5 übertragen.<ol>
<li>Warmen HESC-Medien im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min.</li>
		<li>Aspirieren Sie Medien aus der Flasche und fügen neue HESC-Medien in den Kolben (Arbeitsvolumen: 8 mL oder 16 mL pro 25 cm oder 75 cm Kolben bzw.).</li>
		<li>Setzen Sie Kolben wieder in die 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C, bis 80-90 % Konfluenz erreicht ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) menschlichen endometrialen Stromazellen Zelle (HESC) Kultivierung
Hinweis: Dieses Culturing Verfahren wird in einer sterilen Umgebung unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.
<ol><li>Vorheizen HESC Medien bei 37 ° C in einem Wasserbad für 20-30 Minuten.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medien aus der Flasche und 0,25 % Trypsin Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (1 mL für 25 cm Kolben oder 2 mL für 75-cm-Kolben).</li>
	<li>Inkubieren Sie in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C für ca. 2-3 min, bis die Zellen verdrängen.</li>
	<li>Klopfen Sie leicht die Küvette Wände um die verbleibenden Zellen verdrängen. 7 mL HESC Medien und Mischung gut durch pipettieren vorwärts- und hinzugeben.</li>
	<li>Pipettieren der Zelle-Mischung in ein 50 mL konische Polypropylen-Rohr und Zentrifuge bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Überstand abgesaugt und erneut aussetzen der Zelle Pellet in HESC Medien.<ol>
<li>15 mL für 25 cm Kolben oder 45mL für 75-cm-Kolben (15 mL) hinzugeben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jede Flasche 25 cm oder 75 cm bzw. 5 mL oder 15 mL Zellsuspension hinzufügen.</li>
	<li>Kultur der isolierten HESC in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C für einen Zeitraum von 3-5 Tage bis die Zellen einer Monoschicht erreichen 80-90 % Konfluenz in einem vergoldeten Kolben bilden.</li>
	<li>Wechseln Sie HESC Medium alle zwei Tage.<ol>
<li>Warmen HESC-Medien im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min.</li>
		<li>Aspirieren Sie Medien aus der Flasche und fügen neue HESC-Medien in den Kolben (Arbeitsvolumen: 8 mL oder 16 mL pro 25 cm oder 75 cm Kolben bzw.).</li>
		<li>Setzen Sie Kolben wieder in die 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C, bis 80-90 % Konfluenz erreicht ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. menschliche endometrialen Stromazellen Zelle (HESC) Beschichtung und SiRNA Transfection
Hinweis: Dieses Verfahren Transfektion wird in einer sterilen Umgebung unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.
<ol><li>Aspirieren Sie HESC Medien aus der 75-cm-Flasche und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung von 0,25 %.</li>
	<li>Inkubieren Sie in 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C für ca. 2-3 min, bis die Zellen verdrängen.</li>
	<li>Sobald Zellen aus der Flasche verdrängt sind, 7 mL HESC Medien hinzufügen und mischen durch pipettieren vorwärts und rückwärts 5 Mal.</li>
	<li>Pipettieren der Zelle-Mischung in ein 50 mL konische Polypropylen-Rohr und Zentrifuge bei 800 X g 2,5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgesaugt und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 10 mL HESC Medien. Hinweis: Wenn Zellen aus mehr als eine Flasche Beschichtung, einfach die Lautstärke HESC Medien.</li>
	<li>Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer.<ol>
<li>Aliquoten 10 µL neu suspendierten Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL von 0,4 % Trypan blau färben auf Zelle aliquoten und mischen, indem Sie vorwärts pipettieren und rückgängig zu machen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platte 0,8 x 105 Zellen pro Bohrloch in 6-Well Platten. Nach zwei Tagen sollten die Zellen 60-70 % Zusammenfluss zur optimalen Transfektion sein.</li>
	<li>Bereiten Sie für jede Probe SiRNA Transfection komplexe mit SiRNA (60 Nanomoles), Transfection Reagens.</li>
	<li>Verdünnen Sie 5 µL Transfection Reagens in 150 µL reduzierte Serum freier Medien und 5 min inkubieren.</li>
	<li>Verdünnen Sie 60 Nanomoles von SiRNA in 100 µL reduzierte Serum freier Medien und 5 min inkubieren.</li>
	<li>Nach 5 Minuten verdünnten SiRNA mit verdünnter Transfektion Reagenzlösung kombinieren und mischen durch pipettieren nach vorne und rückwärts 5 Mal. Hinweis: Wenn eine oder mehrere SiRNA in mehreren Brunnen transfecting, bereiten Sie master-Mix in 10 mL Polystyrol Rohre.</li>
	<li>Inkubieren Sie SiRNA-Transfection Reagens komplexe für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Während diese Inkubation fügen Sie 1 mL der Änderung Medien in jede Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie nach 5 min Inkubation Rohre bei 500 X g für 2 min Lösung zu sammeln und auch mit Zellen und Medien jeweils 250 µL der SiRNA-Transfection Reagens komplexe hinzufügen.</li>
	<li>Mischen Sie, indem Sie sanft schaukelnden und inkubieren Sie die Zellen bei 37° C in einem 5 % CO2 Inkubator für 5 h.</li>
	<li>Nach 5 h wechseln Sie das Medium HESC Medien.</li>
	<li>2 Tage in der Vorbereitung für eine in-vitro- Decidualization Assay inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.</li>
</ol>7. in-vitro- Decidualization-Assay
Hinweis: Dieser Test wird in einer sterilen Umgebung unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.
<ol><li>Bereiten Sie die EPC-Medien vor Behandlungsbeginn die in-vitro- Decidualization wie in Camden Et Al. beschrieben 3 (siehe 1.6).</li>
	<li>Aspirieren Sie die Medien aus der Post-48 Stunde transfizierten Linie HESC aus Schritt 6.16 inkubiert.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL des EPÜ Medien in jede Vertiefung. Beachten Sie: als Kontrolle, eine Gruppe von Zellen mit EPC Medien unbehandelt, lassen. Stattdessen fügen Sie 2 mL HESC-Medien, die Kontroll-Vertiefungen.</li>
	<li>6 Tage inkubieren Sie die Zellen in 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.<ol>
<li>Ändern Sie den EPC-Medien alle 48 Stunden.<ol>
<li>Warm und bereiten EPÜ Medien im Wasserbad 37 ° C für 15-20 min.</li>
			<li>Aspirieren Sie Medien aus dem Brunnen und fügen Sie frischen EPÜ Medien hinzu.</li>
			<li>Platzieren Sie die Platte wieder in den 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysieren Sie nach dem sechsten Tag das Ausmaß der Stromazellen Zelle Decidualization über ELISA und qRT-PCR (wie unten beschrieben).</li>
</ol>8. Bewertung von In vitro- Decidualization nutzen Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)
Hinweis: qRT-PCR erfolgt wie oben beschrieben in Kommagani Et Al10.
<ol><li>Isolieren Sie die gesamte-RNS von HESC unter Verwendung des Protokolls aus einem handelsüblichen RNA Isolierung Bausatz.<ol>
<li>Analysieren Sie die RNA-Menge und Reinheit (ein260/a280) mit einem NanoDrop oder ähnliche Methodik wie in Garcia-Elias Et Al15beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CDNA von 1 µg Gesamt-RNS durch ein handelsübliches reversen Transkription Kit Protokoll zu synthetisieren.</li>
	<li>Führen Sie eine qRT-PCR-Reaktion, wie in einem handelsüblichen qRT-PCR-Kit-Protokoll beschrieben.<ol>
<li>Führen Sie die Reaktion unter Verwendung eines handelsüblichen Real-Time PCR Master Mix und spezifischen gen-Sonden zusammen mit systeminternen Steuerelemente (18, PRLund IGFBP1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Überprüfung der In vitro- Decidualization Verwendung von ELISA
<ol><li>Die sekretierten Prolaktin-Spiegel aus der Gewebekultur Medien unter Verwendung einer handelsüblichen Prolaktin-ELISA-Kit zu quantifizieren.</li>
</ol>10. Überprüfung von In vitro- Decidualization Verwendung von Phalloidin Färbung.
<ol><li>Sterile Deckgläsern in jede Vertiefung eine 12-well-Platte einsetzen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.5.</li>
	<li>Platte 0,8 x 105 Zellen pro Bohrloch eine 12-well-Platte.</li>
	<li>2 Tage inkubieren Sie die Zellen in 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Medien.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 7,3-7,4.</li>
	<li>Befestigen Sie die Zellen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Fixierung-Lösung und 3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 0,1 % nicht-ionische Tenside Polyethylenglykol Tert-Octyl-Phenyl-Äther in PBS für 5 min zu den festen Zellen um die Durchlässigkeit zu erhöhen.</li>
	<li>3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL Phalloidin Lösung pro Deckglas und bei Raumtemperatur für 90 min inkubieren.<ol>
<li>Bereiten Sie 1: 100 Verdünnung mit PBS-Puffer aus mit einer Phalloidin Vorratslösung in 1 Einheit pro 5 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min waschen.</li>
	<li>Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Die Zellen unter Verwendung einer confocal Mikroskop zu beobachten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Maruyama, T., Yoshimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+for+differentiation+and+regeneration+of+the+uterine+endometrium.">Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium.</a> Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+Stromal+Decidualization+Responds+Reversibly+to+Hormone+Stimulation+and+Withdrawal.">Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal.</a> Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).</li><li>Ahn, J. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+decidualization:+of+mice+and+men.">Endometrial decidualization: of mice and men.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).</li><li>Tamura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Function+of+a+Transcription+Factor+WT1+in+Regulating+Decidualization+in+Human+Endometrial+Stromal+Cells+and+Its+Molecular+Mechanism.">Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism.</a> Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).</li><li>Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Decidual+Stromal+Cells+as+a+Component+of+the+Implantation+Niche+and+a+Modulator+of+Maternal+Immunity.">Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity.</a> Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+endometritis+modifies+decidualization+in+human+endometrial+stromal+cells.">Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).</li><li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+quantification+methods+and+optimizing+protocols+for+microarray+hybridization+of+circulating+microRNAs.">Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs.</a> Scientific Reports. 7, 7725 (2017).</li><li>Brosens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endometrial+fibroblasts+immortalized+by+simian+virus+40+large+T+antigen+differentiate+in+response+to+a+decidualization+stimulus.">Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus.</a> Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).</li><li>Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+rapid+actin+assembly+in+human+endometrial+cells+without+affecting+its+synthesis.">Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).</li></ol>

Diese Arbeit wird unterstützt durch die Finanzierung von National Institute of Health (NIH) / National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) Grant (R00 HD080742) und Washington University School of Medicine Start-up-Fonds, r.k. Wir möchten die Washington University Fertility Clinic für die Bereitstellung der endometrial Biopsie Proben zu danken.

Die weiblichen reproduktiven Zyklus zeichnet sich durch einen Anstieg der Progesteron-Spiegel während der luteal Phase, so induzieren die Decidualization des ESC in Runde, epithelialen anmutenden sekretorischen Zellen3,8. Die Einleitung der Decidualization ist Art angewiesen. Beim Menschen tritt Decidualization spontan nach dem Aufstieg der Progesteron-Konzentration, während Mäuse Blastozyste Präsenz10,11</...

Zwischen den Phasen der Menarche und Menopause unterziehen Frauen im gebärfähigen Alter Monatszyklen der Hormon reguliert endometrial Proliferation, Differenzierung und anschließende Vergießen in Vorbereitung auf die Schwangerschaft in einem Prozeß bekannt als Menstruation1 ,2. Solche körperlichen Änderungen des menschlichen Endometriums sind notwendig für richtige Embryos in der Gebärmutter Wand1. Veränderungen des Endometriums, morphologische und biochemische Anpassungen, einschließlich vermittelt während des Menstruationszyklus über Eierstockkrebs Steroid-Hormone Östrogen und Progesteron (P4)3,4,5. Innerhalb der proliferative (oder follikulären) Phase Ebenen präovulatorische Östrogen Anstieg, Einleitung Verdickung der Gebärmutterschleimhaut. Nach Eisprung fördert die sekretorische (oder luteal) Phase einen signifikanten Anstieg der P4-Konzentrationen induzieren die morphologische Transformation von Stromazellen endometriumzellen (ESC) von Fibroblasten-aussehen gerundet, epithelialen wie deziduale Zellen in einem Prozess, bekannt als Decidualization4,6. Unsachgemäße Decidualization wurde als Hauptursache für die Implantation Scheitern und anschließende frühen Embryo fehl-4,7,8gegründet. Daher ist es vorteilhaft, die Diagnose und Behandlung von frühen schwangerschaftverlust, Verständnis der molekularen Mechanismen, die Decidualization.
Derzeit werden mehrere Methoden genutzt, um die zugrunde liegenden Auswirkungen von Decidualization auf Stromazellen endometriumzellen untersuchen. In Vivo, die Maus Gebärmutter künstlich induziert werden können, für Decidualization durch mechanische Stimulation (z.B.Kratzer) oder Öl-Injektion in einem hormonell grundiert Gebärmutter-9. Deutlich von den Menschen, fördert diese synthetischen Stimulation die Differenzierung des uterinen Lumens durch das Aussehen der Blastozyste Präsenz, ein Schritt, der für die Einleitung des Decidualization in Nagetieren10,11erforderlich ist. Entsprechend, durch translationalen Komplikationen im Zusammenhang mit Tiermodellen und die ethischen Dilemmata rund um in-Vivo Studien am Menschen, Decidualization basierte Modelle sind am erfolgreichsten studierte in-vitro-.
In dieser Studie werden die Themen durch die Platzierung von anzeigen in beiden Englisch und Spanisch Lokalzeitungen rekrutiert. Themen als geeignete Kandidaten für diese Studie identifiziert werden gebracht zu einem Treffen mit der Forschungskoordinator, in denen eine vollständige Offenlegung der Risiken werden besprochen. Nach Bestätigung der ein vollständiges Verständnis der potenziellen Risiken wird Probanden Zustimmung in schriftlicher und mündlicher Form erreicht. Einwilligung schließt die Berechtigung (1) unterziehen Aderlass (2) langfristige Speicherung von ihrem Gewebe für die zukünftige Forschung und (3) zur Schaffung von Primärkulturen aus gesammelten Gewebemustern zustimmen. Nach Zustimmung erhalten Themen eine Form, in welcher zulässigen Selbstidentifikation der Rasse/Ethnizität und/oder das Recht auf Geheimhaltung abzuschließen. Ein anschliessender Besuch soll die Endometrium-Biopsie basierend auf das Thema Menstruationszyklus zu erreichen. Freiwillige, die zu dieser Studie rekrutiert die ethnische und rassische Demographie der Metropolregion St. Louis zu reflektieren, wie durch die Volkszählung 2012 dokumentiert und beinhaltete nicht die Beteiligung der gefährdeten Bevölkerung einschließlich Schwangere, Föten, Embryonen, Kinder unter 18 Jahren alt oder anderen gefährdeten Gruppen. Voraussetzungen für die Teilnahme an der Biopsie-Probe-Sammlung gehören (1) wird im Alter von 18-45 Jahre (2) mit regelmäßigen Menstruationszyklus (25-32 Tage) (3), die keine aktuelle Schwangerschaft oder hormonelle/intrauterine Vorrichtung Verhütungsmittel 30 Tage vor der Einschreibung (4) ohne aktuelle vaginale Infektion oder sexuell übertragbare Krankheiten (5), die keine aktuelle Antibiotika-Behandlungen, und (6) haben keine aktuellen abnormen PAP-Abstrich.
Im Rahmen dieser Studie menschlichen Stromazellen endometriumzellen (HESC) kultiviert und künstlich induziert in-vitro- Decidualization durch die Ergänzung der Hormone (Östradiol (E2), Medroxyprogesteron Acetat (MPA) und zyklische Adenosin zu unterziehen Monophosphate (cAMP)) auf das Medium. Bei dieser Methode wird der Grad der Decidualization basierend auf die Gesamtzahl der Tage der hormonellen Behandlung verändert. In Verbindung mit Zellskelett Neuordnung induziert hormonelle Supplementierung biochemische Anpassungen, die wie die deziduale Zellen sekretorischen Qualitäten2,4erleben. Die Expression von Genen Markenzeichen, wie Prolaktin (PRL) und Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindendes Protein 1 (IGFBP1), kann genutzt werden, um zu bestätigen und zu quantifizieren, den Grad der HESC Decidualization5,12, 13 , 14. wichtiger ist, beweist auch die Lebensfähigkeit dieses Protokolls, spezifischen gen-Knockdown durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>For decidualization media</td></tr><tr><td>DMEM / F12 (1:1) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>For cell count</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183018A</td><td>For RNA Isolation/Purification</td></tr><tr><td>TaqMan 2X Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control</td><td>Life Technologies</td><td>4319413E</td><td>For qPCR internal control</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>For qPCR internal control</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>For qPCR internal control</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Human Prolactin ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>EHIAPRL</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>For mounting</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS Reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>45001749</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td><td>Sigma</td><td>M1629-1G</td><td>For EPC Media</td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma</td><td>E1024-1G</td><td>For EPC Media</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885-100MG</td><td>For EPC Media</td></tr><tr><td>Fine straight stitch scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351372</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td><td>Gibco</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic</td><td>Thermo Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-021-cv</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical polypropylene Falcon tube</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Glass Petri dish</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Midsci</td><td>229481</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 Water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS-215</td><td></td></tr><tr><td>LSE Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Human NCOA2 siRNA&amp;nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>L-020159-00</td><td>Gene specific qPCR probe</td></tr><tr><td>Steri-cycle i160 CO2 Incubator&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030301</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>For RNA quantification</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50146771</td><td></td></tr><tr><td>75 cm Canted Neck Cell Culture flask</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Controller Ultra</td><td>Corning</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>19.0.1.334</td><td></td></tr><tr><td>25 cm Canted Neck Cell Culture flask</td><td>Corning</td><td>7200876</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical polypropylene Falcon tube</td><td>Corning</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>1300 Series A2 Biological Safety Hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>accuspin Micro17 centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>13100675</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast real time PCR system</td><td>Applied Biosystems</td><td>3052632</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Immunofluorescence Microscope</td><td>Life Technologies</td><td>01414-155G-291</td><td></td></tr><tr><td>Leica Inverted Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Illrustrator</td><td>Adobe</td><td>22.0.1.253</td><td></td></tr><tr><td>Excel Spreadsheets</td><td>Microsoft</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser 18 mm cover glasses</td><td>NeuVitro</td><td>GG-18</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP176-100</td><td>For RNA lysis buffer</td></tr><tr><td>1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial</td><td>Corning</td><td>430658</td><td>For freezing HESC cells&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>For freezing media</td></tr></tbody></table>

isolation of human endometrial stromal cells for in vitro decidualization

Die Differenzierung der menschlichen Stromazellen endometriumzellen (HESC) von Fibroblasten-aussehen in sekretorischen Dezidua ist eine Transformation, die für die Implantation des Embryos in die Gebärmutterschleimhaut der mütterlichen Gebärmutter erforderlich. Unsachgemäße Decidualization wurde als Hauptursache für die Implantation Scheitern und anschließende frühen Embryo fehl-gegründet. Daher ist das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Decidualization vorteilhaft zur Verbesserung der Rate der erfolgreichen Geburten. In Vivo Studien des künstlichen Decidualization schränken oft aufgrund der ethischen Dilemmata Humanforschung sowie translational Komplikationen innerhalb von Tiermodellen zugeordnet. Dadurch werden in-vitro- Tests durch Primärzelle Kultur oft genutzt, um die Modulation des Decidualization über Hormone zu erkunden. Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von HESC und anschließende künstliche Decidualization über die Ergänzung der Hormone, um die Kultivierung Medium. Darüber hinaus bietet diese Studie einer durchdachten Methode, um Zuschlag jedes Gen des Interesses durch die Verwendung von Lipid-basierte SiRNA Transfektionen. Dieses Protokoll ermöglicht die Optimierung der Kultur Reinheit sowie Produktausbeute, und die Fähigkeit, dieses Modell als eine zuverlässige Methode zu verstehen, die molekularen Mechanismen Decidualization, und der anschließenden Quantifizierung der nutzen maximieren freigesetzten Mittel durch decidualized Stromazellen endometriumzellen.

Decidualization in HESC Kultur
Nach Isolierung, menschliche endometriale Stromazellen Zellen wurden zu einer Monoschicht-Formation mit 80-90 % Konfluenz kultivierten und induzierte für in-vitro- Decidualization durch die Behandlung mit 10 nM E2, 1 µM MPA und 50 µM cAMP (EPC). Morphologische Veränderungen in Vitro Decidualization zugeordnet wurden in Figur 1Avis...

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Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Diese Studie bietet eine validierte und optimierte Verfahren zur Isolierung und Kultur menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen in Vitro Decidualization Assay durchzuführen. Darüber hinaus bietet diese Studie einer detaillierte Methode, um effizient Knockdown ein bestimmtes Gen mit SiRNAs in menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen.

Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

isolation-human-endometrial-stromal-cells-for-vitro

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

10.1K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Diese Studie bietet eine validierte und optimierte Verfahren zur Isolierung und Kultur menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen in Vitro Decidualization Assay durchzuführen. Darüber hinaus bietet diese Studie einer detaillierte Methode, um effizient Knockdown ein bestimmtes Gen mit SiRNAs in menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen.

Serie: Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Medizin

Generation of a Mouse Artificial Decidualization Model with Ovariectomy for Endometrial Decidualization Research

Endometrial decidualization is a unique differentiation process of the endometrium, closely related to menstruation and pregnancy. Impairment of decidualization leads to various endometrial disorders, such as infertility, recurrent miscarriage, and preterm birth. The development and use of the endometrial decidualization model in reproductive studies have been a highlight for reproductive researchers for a long time. The mouse has been extensively used in studying reproduction and decidualization. There are three well-established mouse models regarding decidualization, namely natural pregnancy decidualization (NPD), artificial decidualization (AD), and in vitro decidualization (IVD). Among them, AD is considered a reliable model for mouse decidualization, which is easy to implement and close to NPD. This paper focuses on a modified method of the generation and application process of the mouse artificial decidualization model with ovariectomy to avoid ovarian effects, which can obtain highly reproducible results with small within group variances. This method provides a good and reliable animal model for the study of endometrial decidualization.

Here, we describe the method of generating an artificial decidualization model using the ovariectomized mouse, a classic endometrial decidualization experiment in the research field of endometrial decidualization.

Generierung eines künstlichen Dezidualisierungsmodells der Maus mit Ovariektomie für die Endometrium-Dezidualisierungsforschung

Endometrial decidualization is a unique differentiation process of the endometrium, closely related to menstruation and pregnancy. Impairment of ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of luminal and glandular epithelium, a stromal compartment, a vascular network, and a complex immune cell population. Mouse models have been a powerful tool to study the endometrium, revealing critical mechanisms that control implantation, placentation, and cancer. The recent development of 3D endometrial organoid cultures presents a state-of-the-art model to dissect the signaling pathways that underlie endometrial biology. Establishing endometrial organoids from genetically engineered mouse models, analyzing their transcriptomes, and visualizing their morphology at a single-cell resolution are crucial tools for the study of endometrial diseases. This paper outlines methods to establish 3D cultures of endometrial epithelium from mice and describes techniques to quantify gene expression and analyze the histology of the organoids. The goal is to provide a resource that can be used to establish, culture, and study the gene expression and morphological characteristics of endometrial epithelial organoids.

This protocol describes methodologies to establish mouse endometrial epithelial organoids for gene expression and histological analyses.

Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>3D-gedrucktes Gerüstmodell zur Untersuchung der Einnistungsmechanismen von Embryonen

Co-culture Model Using Two Types of Adherent Cell Lines

Embryo implantation is affected by the interactions among different cell types in the mother-embryo interface. The direct and indirect communications between various cell types within the decidua are crucial for regulating endometrial receptivity; however, the molecular mechanisms mediating this interaction are still unclear. In this regard, a model to study the implantation process is needed to establish a comprehensive in vitro model that can recapitulate the biology of endometrial epithelium-stroma interaction. This model is composed of regular cell-culture plates and a matching scaffold, which is generated by three-dimensional (3D) printing from low-cost materials. Here, we detail a set of protocols for model construction, cell preparation, cell seeding, cell culture, observation, and evaluation. Furthermore, we have included representative results with cells exhibiting good growth conditions under the microscope. This study aimed to develop in vitro models that would mimic the interaction between endometrial stromal cells and epithelial cells, as well as between trophoblast cells and endometrial cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: In vitro Endometriummodelle zur Untersuchung von Epithel-Stroma- und Embryo-Interaktionen

The protocol shows a novel in vitro experimental model that can recapitulate the biology of two kinds of adherent cell lines with a three-dimensional (3D)-printed scaffold. The construction of this model and operating procedures, from cell preparation and cell culture to analysis and evaluation, are described.

Co-Kulturmodell mit zwei Arten von adhärenten Zelllinien

Embryo implantation is affected by the interactions among different cell types in the mother-embryo interface. The direct and indirect communications ...