Name: using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Forschungsstipendium von der American Society for Reproductive Medicine und von der Karl und Johanna Busch Memorial Fund an der Rutgers, The State University von NJ, k.s. A.L.N. wurde durch einen Zuschuss aus dem N.I.H. (F31 HD0989597) unterstützt.

(1) molecular Cloning
<ol><li>Full-Length kodierende Sequenz des Gens von Interesse erhalten und die Plasmid in Vitro Transkription (pIVT) Vektor-11. Hinweis: In voller Länge cDNA Clones sind von verschiedenen Herstellern im Handel erhältlich oder können über reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) generiert werden. Das National Center for Biotechnology Information (NCBI) Online-Ressource bietet Transkript Sequenzen für Gene aus der Nucleotide und ausgedrückt Sequenz markiert (EST) Datenbanken. Zur Erleichterung des Proteins können Visualisierung und Analyse von Ausdruck Niveaus, Fusion, grün fluoreszierendes Protein (Gfp) oder eine andere geeignete fluoreszierende Tag in der Klonen Strategie erwünscht sein.</li>
	<li>Mittels einer validierten Klonen Strategie legen Sie die kodierende Sequenz des Gens von Interesse in mehreren Klonen und Umgebung pIVT. Eine detaillierte Beschreibung der molekularen Klonen und die erforderlichen Schritte wurden zuvor beschriebenen 12. Hinweis: Wenn ein Gen-Fusion Produkt generiert werden, sicher sein, dass das Klonen ist in den richtigen Leseraster.</li>
	<li>Sequenz das Konstrukt mit Globin Primer um sicherzustellen korrekte gen einsetzen, richtige in-Frame Fusion und keine Polymerase-induzierte Punktmutationen entstanden. Hinweis: Wenn DNA Sanger-Sequenzierung Ausrüstung nicht verfügbar ist, bieten viele Unternehmen kostengünstige Optionen der DNA-Sequenzierung.</li>
	<li>Mutagenize DNA, wenn Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder Einfügungen/Löschungen (INDELS) zu generieren. DNA-Mutagenese wird in Schritte 1.5-1.7 unten beschrieben. Wildtyp Konstrukte fahren Sie fort mit der Linearisierung Schritt 1,7.</li>
	<li>Design-Mutagenese Primer und vervollständigen die Mutagenese-PCR-Reaktion um mutierte Konstrukt pro des Herstellers Protokoll zu generieren. PCR-vermittelten Site-verwiesene Mutagenese wurde zuvor beschriebenen 13. Darüber hinaus bieten viele Unternehmen Site-verwiesene Mutagenese-Kits die Protokolle enthalten.</li>
	<li>Verwandeln Sie mutagenisierter DNA in bakterielle Host. Isolieren und Plasmid zu reinigen. Hinweis: Viele Unternehmen stellen Kits, die lässt sich leicht isolieren und reinigen Plasmid DNA. Folgen Sie Hersteller-Protokoll entsprechend. Wenn ein gramnegatives Bakterienstamm wie E. Coliverwenden, empfiehlt es sich, ein Kit zu verwenden, die Endotoxine entfernt.</li>
	<li>Die isolierte DNA aus bakteriellen transformanten verwenden standard Sanger-Sequenzierung zur Bestätigung der Einführung des gewünschten SNP oder INDEL-Sequenz.</li>
	<li>Linearisieren Sie Endprodukte mit einzelnen Beschränkung Enzym Verdauung der gereinigte DNA. Hinweis: Der pIVT Vektor enthält mehrere Single-Enzym schneiden in der Plasmid-Karte auf Addgene 14aufgeführten Websites.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Produkt linear über Agarose-Gelelektrophorese. Die Methodik für die Agarose-Gelelektrophorese wurde zuvor definierten 14. Hinweis: Für alle verbleibenden Schritte verwenden Sie Barriere (Filter) pipettieren Tipps und RNase-freie Materialien zur Herstellung von stabilen, hochwertigen RNA zu gewährleisten.</li>
	<li>Reinigen Sie das verdaute Produkt mit einem validierten DNA-Aufräum Protokoll oder Kit und eluieren in 30 µL RNase/DNase-freies Wasser. Hinweis: Silica-Matrix Spin spaltenbasierten Kits sind empfehlenswert für qualitativ hochwertige, gereinigte DNA. Folgen Sie Hersteller-Protokoll entsprechend.</li>
	<li>
In-vitro- Transkription DNA mit Hilfe T7-Polymerase nach Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Reinigen Sie und eluieren Sie RNA in 30 µL RNase/DNase freies Wasser mit einem Silica-Matrix Spin spaltenbasierten Nukleinsäure Reinigung Kit nach der Hersteller-Protokolls.</li>
	<li>Führen Sie denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese mit Formaldehyd, um die endgültige Größe der RNA-Produkt zu bestätigen. Finden Sie unter Schritte 1.13-1.22 unter 14. (Abbildung 1).</li>
	<li>Bereiten Sie Gel durch Erhitzen 1 g Agarose in 72 mL Wasser aufgelöst, dann auf 60 ° c abkühlen lassen</li>
	<li>Bereiten Sie 10 X MOPS laufen Puffer durch Zugabe von 0,4 M MOPS (pH 7,0), 0,1 M Natriumacetat und 0,01 M EDTA vor.</li>
	<li>Zugeben Sie 10 mL 10 X MOPS laufen Puffer und 18 mL 37 % Formaldehyd (12,3 M) bis zur gekühlten Agarose-Lösung.</li>
	<li>Kaste das Gel durch die Agarose-Lösung in einem gelbildenden Behälter gießen. Verwenden Sie einen Kamm groß genug für 10 µL. Nachdem Gel gesetzt hat und fest im Griff ist haben, entfernen Sie vorsichtig den Kamm.</li>
	<li>Montieren Sie das Gel in der Elektrophorese-Tank, und fügen Sie genug 1 X MOPS laufen Puffer, sicherzustellen, dass das Gel vollständig bedeckt ist.</li>
	<li>Bereiten Sie RNA-Probe durch Zugabe von 1 µg RNA bis 0,5 X Datenmengen formaldehydhaltigen laden Farbstoff vor.</li>
	<li>RNA-Lösung mit einer Konzentration von 10 µg/mL Interkalation Bromid hinzufügen.</li>
	<li>Denaturieren Sie RNA Beispiellösung bei 70 ° C für 5 Minuten.</li>
	<li>Verwendung von sterilen, 10 µL Filterspitzen, laden 5 µL Molekulargewicht Marker und 5 µL RNA Probe(n) in separaten Vertiefungen des Gels und electrophorese mit 5 V/cm, bis der Farbstoff mindestens zwei Drittel der Länge des Gels migriert hat.</li>
	<li>Visualisieren Sie die RNA in das Gel auf eine UV-Trans-Hilfslicht. Sicherstellen Sie, dass die RNA die richtige Größe hat, durch den Vergleich mit dem Molekulargewicht Marker.</li>
	<li>Zur Messung der Konzentration und Reinheit der RNA übertragen Sie 1,2 µL gereinigten RNA mit sterilen 10 µL-Filter-Tips auf einem UV-Spektrophotometer. Beachten Sie, dass hochwertige RNA Extinktion Verhältnisse der A260/280 (1,8-2,2) und 260/230 haben sollte (> 1,7) beziehungsweise.</li>
	<li>Verwenden 10 µL Filterspitzen, aliquoten die restlichen gereinigte RNA in sterile 0,5 µL Zentrifuge Röhren (3-5 µL/Rohr). Röhren bei-80 ° C bis bereit für die Mikroinjektion zu speichern. Hinweis: Eine Konzentration der letzten Injektion von 500 ng/µL ist ein optimaler Ausgangspunkt. Es wird empfohlen, die RNA verdünnen 1:2 in RNase H20 vor der Mikroinjektion zu verringern Klebrigkeit der RNA in Mikroinjektion Pipette frei.</li>
</ol>(2) Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Assay
<ol><li>Unterteilen Sie Eizellen in gleich große Gruppen für die Mikroinjektion. Hinweis: Eizellenentnahme, Transfer, Mikroinjektion und meiotischen Reifung hat in Jupiter ausführlich beschrieben wurden bisher 15.</li>
	<li>Microinject, eine Gruppe mit experimentellen mRNA und die anderen Gruppen mit dem WT-Kontrolle und PBS oder Gfp mRNA. Hinweis: 500 ng/µL ist die empfohlene Injektion Konzentration mit 10beginnen. Ein Picoinjector kann zur Injektion Beträge zu kontrollieren. Ein Injektionsvolumen von 5-10 pL wird 15empfohlen.</li>
	<li>Mit einer Hand oder Mund betriebenen pipettieren Apparat, wo das Glas pipette Öffnung, leicht ist im Embryo Qualität Mineralöl größer als der Durchmesser einer Eizelle (100-150 µm), Transfer Eizellen zu einem 100 µL Tropfen Milrinone-freien Kulturmedium in einer Petrischale abgedeckt und inkubieren Sie Eizellen für 7 h bei 37 ° C in 5 % C02 ermöglichen ausreichende Reifung zur Metaphase der Meiose ich (ich traf) 15.</li>
	<li>Nach der Inkubation mit derselben Pipette Apparatur wie oben beschrieben, Eizellen in der Mitte gut Orgel Kulturschale mit 700 µL vorgekühlt minimale wesentlichen Medien (MEM) Sammlung Medium in der Mitte gut und 500 µL H20 in den äußeren Ring zu übertragen und Legen Sie Gericht für 7 min auf Eis. Hinweis: Es wird empfohlen, vorab chill MEM Media und Mitte gut Orgel Kultur Gerichte bei-20 ° C für mindestens 20 Minuten vor der Behandlung der Eizellen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Eizellen übertragen sie mit Hilfe der Pipette Apparat in einen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL 2 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Mit gleichen pipette Apparat, übertragen die Eizellen in einem anderen Brunnen auf einem Fleck Teller mit 400 µL blocking Lösung (PBS + 0,3 % BSA + 0,01 % Tween-20 + 0,02 % NaN3) und Store bei 4 ° C bis bereit für Immunostaining verarbeiten. Hinweis: zum Speichern von Eizellen bei 4 ° C, Deckel Glasplatte vor Ort mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Mit derselben Pipette Apparatur, Transfer Eizellen zu einem neuen Brunnen an einem Ort Platte mit 400 µL Permeabilisierung Lösung (PBS + 0,3 % BSA + 0,1 % TritonX-100 + 0,02 % NaN3) und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Transfer Eizellen schnell durch drei 400 µL Tropfen blockiert Lösung um jede verbleibende Reinigungsmittel zu entfernen. Hinweis: Eine 9-gut klare Glasplatte vor Ort eignet sich gut für Gruppen durch mehrere Behandlungen auf ein einziges Gericht (Schritte 2,4-2,5) verschoben.</li>
	<li>Führen Sie die verbleibenden Immunocytochemistry Verfahren in eine Feuchte Kammer, lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Verwendung einer mittelständischen Kunststoff-Behälter gefüttert mit feuchten Papiertüchern und mit Alufolie abdecken.</li>
	<li>Mit der Pipette Apparat übertragen Eizellen zu 30 µL Lösung auf dem Deckel einer 96-Well-Platte und Ort innerhalb der Feuchte Kammer für 10 Minuten blockiert. Hinweis: In den runden Einkerbungen auf der Platte befinden sich Tropfen.</li>
	<li>Beschriften Sie Zentromere und Spindel, mit Hilfe der Pipette Apparat, transfer Eizellen zu 30 µL blockiert Lösung mit Anti-Zentromer Antigen (ACA, Crest) (01:30) und Anti-acetyliert Tubulin (1: 1000) und inkubieren Sie für mindestens 1 h.</li>
	<li>Spülen Sie Eizellen durch die Übertragung durch drei 30 µL Tropfen Lösung für 10 min zu blockieren.</li>
	<li>Mit Hilfe der Pipette Apparat, Transfer Eizellen zu 30 µL drop von blockierenden Lösung, komplementär zu den Antikörpern verwendet oben (Anti-Human IgG 1: 200, Anti-Maus IgG 1: 200) sekundäre Antikörper enthält und 1 h inkubieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die 3, 10 min spülen Schritte in 30 µL Lösung blockiert, wie in Schritt 2.11 beschrieben.</li>
	<li>Transfer die Eizellen, die mit der Pipette Apparat in 3-5 µL Montage mittlerer mit DAPI (5,9 µg/µL) auf einen Glas-Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie 4 kleine Tropfen (groß wie ein Stecknadelkopf) Vaseline an den Ecken des Deckglases, Zerkleinerung von Eizellen zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie sanft die Deckglas Vaseline Seite nach unten auf die Folie.</li>
	<li>Versiegeln Sie Deckglas Kanten mit klaren Nagellack und 5 Minuten trocknen lassen.</li>
	<li>Bewahren Sie Folien bei 4 ° C bis zur Verarbeitung über konfokalen Mikroskopie lichtgeschützt auf. Hinweis: Sicherstellen der Brechungsindex des Eindeckmittel und Deckglas, Spiele die Mikroskop-Ziele genutzt. Empfohlene Montage, die Materialien bisher beschriebenen 15.</li>
	<li>Bild von Eizellen mit einer 40-63 X Objektiv auf einem confocal Mikroskop, kleine Schritte zu erfassen (≤ 1 µm) in der Z-Ebene, für die Arbeiten Ziel, und das Image der gesamten Region der Metaphase Spindel optimiert. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle 3 Kanäle, basierend auf spezifischen Sekundärantikörper verwendet im Schritt 2.11 Bild. Bild von durchschnittlich ≥ 4 und ein Zoom von 3 sind ideal für ausreichende Auflösung. Eine 1 µm Schrittgröße bietet übersichtliche Visualisierung von Mikrotubuli und Kinetochore in Maus Eizellen. Das Verfahren für die Bilderfassung variiert von Mikroskop, Mikroskop. Entnehmen Sie bitte der Hersteller konfokale Benutzerhandbuch für konkrete Schritte zum Mikroskop-Einstellungen konfigurieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Status mithilfe von imaging-Software folgende Schritte 2.21-2.23. Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben dieses Verfahren mit Bild J (NIH) kostenlos downloadbare Software, jedoch Alternativen imaging-Software genutzt werden. Anlage-Status, die Arten bisher definiert 16 .</li>
	<li>Bild öffnen, indem Sie die Datei in Bild J-Tool-Leiste ziehen.</li>
	<li>Machen Sie in der geöffneten Z-Serie alle Kanäle sichtbar (DNA, Kinetochor und Spindel) durch Klicken auf "Kanäle zusammenfügen", erhältlich im Dropdown-Menü "Bild" unter der Registerkarte "Farbe" Sub.</li>
	<li>Verwenden den Schalter am unteren Rand des Bildes, bewegen Sie sich durch jede Z-Scheibe und bestimmen Sie Kinetochor-Mikrotubuli-Anlage zu. Detaillierte Anlage, die Beschreibungen bisher beschriebenen 16
</li>
</ol>(3) Chromosom Ausrichtung Herausforderung Assay
<ol><li>Verwenden die Pipette-Apparat, wie unter Punkt 2.3 beschrieben, Eizellen zu einem 100 µL Tropfen Milrinone-freien Kulturmedium unter Öl zu übertragen und inkubieren Sie Eizellen für 7 h ermöglichen ausreichende Reifung zur Metaphase der Meiose ich (ich traf) wie oben beschrieben im Schritt 2.3 17 . Hinweis: Verfahren zur Eizelle Sammlung, Mikroinjektion und Reifung umrissen wurden bisher 15. Beziehen sich auf die Anlage Assay Protokoll in Schritte 2.1-2.2 für Steuerelemente und RNA Mikroinjektion Konzentrationen.</li>
	<li>Mit derselben Pipette Apparatur, Transfer Eizellen zu einer Kultur Zentrum gut Orgel Schale mit 700 µL Kulturmedium mit Monastrol [100 µM] im Zentrum gut und 400 µL H20 in das umgebende Ring und Inkubation bei 37 ° C für 2 h.</li>
	<li>Monastrol durch die Übertragung von Eizellen, mit Hilfe der Pipette Apparat als oben durch drei Tropfen 100 µL CZB Kulturmedium, ausspülen und übertragen dann die Eizellen für eine neue Mitte-gut Orgel Kulturschale mit 700 µL Kulturmedium + MG132 [5 µM] für 3 h in der Mitte Ring. Den äußeren Ring 400 µL H20 hinzufügen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Eizellen durch Übertragung, mit der Pipette Apparat in einen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL 2 % Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Nach der Fixierung, die Eizellen zu übertragen, mit Hilfe der Pipette Apparat in einen neuen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL blockierende Lösung und Store bei 4 ° C bis für Immunostaining verarbeitet. Hinweis: zum Speichern von Eizellen bei 4 ° C, Deckel Glasplatte vor Ort mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Permeabilize und Eizellen über Immunocytochemistry zu kennzeichnen, wie 2,6-2.16 beschrieben.</li>
	<li>Eizellen mit einer 40-63 X Objektiv auf einem confocal Mikroskop, Erfassung Bild < 1 µm Schritte in der Z-Ebene und achten Sie auf die gesamte Region der Metaphase Spindel Bild.</li>
	<li>Ermittlung von Chromosom Ausrichtung Status offen über imaging-Software-Image-Dateien. Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben dieses Verfahren mit Bild J (NIH) kostenlos downloadbare Software, jedoch Alternativen imaging-Software genutzt werden.</li>
	<li>Ziehen Sie Bild in Bild J Bedienfeld.</li>
	<li>In der geöffneten Z-Serie, verwenden Sie das punktwerkzeug (verfügbar durch Klicken auf das Werkzeugsymbol Punkt auf der Bedienleiste Bild J), Punkte am Ende jeder Spindel Stange in ihre jeweiligen Z-Scheibe zu markieren, indem das Tool über die Spindel Pol im Bild und Klick auf das Bild. Fügen Sie diese Punkte auf die Region of Interest (ROI) Manager Command + t auf der Tastatur drücken.</li>
	<li>Bestimmen Sie die spezifischen Koordinaten für jede der Positionen durch Hervorhebung des spezifischen Punktes im ROI-Manager und klicken Sie auf die Schaltfläche Measure in Schritt 3.10 gesetzt. Dies wird ein Ergebnis liefern Tisch-haltigen x- und y-Koordinaten für jeden Punkt. Diese werden die Punkte X1, Y1, und X1, Y2, beziehungsweise.</li>
	<li>Bestimmen Sie als nächstes die wahre Z-Koordinate. Dies geschieht durch Multiplikation der Slice-Nummer des bestimmten Z-Segments im Z-Stapel in der Spindel Pol identifiziert wurde (d. h. Scheibe #2 von 6), die jeder einzelner Punkt ist durch die Dicke Stapel (d. h. 1 µm) (Beispiel: Schneiden Sie 2 x 1 µm = 2). Diese werden jeweils die Z1 und Z2 Punkte.</li>
	<li>Spindellänge unter Verwendung der Satz des Pythagoras-Gleichung zu bestimmen (eine2 + b2 = C2) unter Verwendung der zuvor definierten x-, y- und Z-Koordinaten von Schritten 3.11-3.13. Für jede Spindel ist die endgültige Länge gleich: √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>Bestimmen Sie die Spindel Midzone. Dies errechnet sich die Hälfte der Länge der Spindel. Mit dem Linienwerkzeug in Bild J, indem Sie auf die Zeile-Symbol in der Symbolleiste Bild J zeichnen Sie eine Linie, die von einem Pol der Spindel zu Spindel Midzone ist. Die Länge wird auf der Symbolleiste Bild J angezeigt.</li>
	<li>Bestimmen Sie Chromosom Ausrichtung Status durch die Bewertung Chromosom Abstand von der Spindel Midzone mit dem Linienwerkzeug Messung. Verwenden das Linien-Werkzeug durch Klicken auf die Zeile-Symbol in der Symbolleiste Bild J, zeichnen Sie eine Linie von der Spindel Midzone auf dem Chromosom. Die Länge wird auf der Symbolleiste Bild J angezeigt. Chromosomen, die größer als 4 µm aus der Spindel Midzone gelten nicht ausgerichtete 18.</li>
</ol>

<ol>
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J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes.">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li><li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells.">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li><li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes,+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase.">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wegen der raschen und zunehmende Identifizierung des menschlichen genetischen Varianten mit Krankheit verbunden ist es unerlässlich, dass Systeme entstehen, um deren biologische Bedeutung zu bewerten. Funktion des Proteins in menschlichen Meiose stellt besondere Herausforderungen zu verstehen, weil menschliche Eizellen kostbar sind und seltene und menschliche Spermien nicht zugänglich, Genmanipulation sind. Maus Eizellen sind Säugetiere Modellsystem wertvoll für die Bewertung der menschlichen meiotische Gene Funktion...

Unfruchtbarkeit ist eine Erkrankung, die 10-15 % der menschlichen Bevölkerung der gebärfähigen Alter 1, betroffen, von denen fast die Hälfte medizinische Behandlung 2suchen. Obwohl die Ätiologie der Unfruchtbarkeit vielfältig ist und in vielen Fällen multifaktoriell, die häufigste genetische Anomalie beim Menschen embryonale Aneuploidie 3 ist. Aneuploidie ist definiert als die Abweichung (Gewinn oder Verlust) der die richtige Anzahl an Chromosomen in einer Zelle. Das Phänomen der Aneuploidie in menschlicher Embryonen ist verbreitet und steigt mit dem mütterlichen Alter 4,5. Vier randomisierte kontrollierte Studien haben deutlich gemacht, dass den nutzen nur chromosomal normale (euploide) Embryonen für uterine Übertragung zu wählen, weil diese Strategie führte zu erhöhten Implantation Raten, niedrigere fehl- und eine kürzere Zeit für Schwangerschaft- 6,7,8,9zu erreichen. Daher haben Verständnis der Ätiologie der menschlichen Aneuploidie wichtige Implikationen in der assistierten Reproduktion.
Obwohl vor der Implantation Gentests für Aneuploidien bei unfruchtbarkeitbehandlungen vorteilhaft ist, fehlt noch ein gründliches Verständnis der wie Aneuploidien stammen. Es ist weithin anerkannt, dass es eine positive Korrelation von meiotischen Aneuploidien (entstanden während der Produktion von Gameten) und Alter der Mutter, aber einige Frauen anwesend embryonalen Aneuploidie-Preise, die von den Mittelkurs für ihre bestimmten Alter 4abweichen. Diese Fälle zeigen, dass Alter allein nicht immer prädiktiv für das Risiko eines aneuploiden Embryonen zu erzeugen. Andere Faktoren können eine Rolle bei der Erhöhung des embryonalen Aneuploidie, z. B. Genvarianten spielen.
Ein wesentlicher Aspekt den möglichen Beitrag der eine Genvariante, Aneuploidie während der Eizelle Meiose zu untersuchen ist, ein System für meiotische Genfunktion schnell bewerten zu entwerfen. Aufgrund der ethischen Einschränkungen und begrenzten Zugang ist es unpraktisch, diese Experimente mit menschlichen Eizellen. Diese Probleme können mithilfe der Maus Eizellen umgangen werden, und hier eine Reihe von Tests zu menschlichen Gens Funktion während der Meiose zu beurteilen sind ich beschrieben. Von microinjecting, die Boten-RNA (mRNA) Kodierung für die Genvariante von Interesse, die Lokalisierung des menschlichen Proteins in der Maus Ei visualisiert und verwendet, um festzustellen, ob die ektopische Expression des Wildtyp und mutierten menschlichen Proteins ergibt sich eine phänotypischen Veränderungen, die Aneuploidie führen könnte. Diese Phänotypen gehören eine Erhöhung der Mikrotubuli, die an die falsche Schwester Kinetochor und die Unfähigkeit, Chromosom Ausrichtung auf Metaphase der Meiose I. vor allem zu unterstützen, dieses Protokoll kann verwendet werden, um Gewinn und Verlust der Funktion untersuchen genetische Varianten durch die Festlegung von bestimmter experimenteller Bedingungen wie herausfordern Schlüsselereignisse in Eizelle Meiose Spindel Gebäude und Chromosom Ausrichtung 10.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass spot plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration table</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Anti-Acetylated Tubulin antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 diution</td></tr><tr><td>Anti-centromeric (CREST) antibody</td><td>Antibodies Incorportated</td><td>15-234</td><td>1:30 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well organ culture dish</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td>For incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Centrifuge (With cooling ability)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>any standard model&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cover Glass 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>thickness will vary for particular microscopes</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A high fidelity cloning enzyme</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>For DNA cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Enzymes for linearizing pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI or KasI can be used</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Any Fluorescent microscope may be used</td></tr><tr><td>Formaldehyde (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde RNA loading dye</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Full Length cDNA Clones</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3&#039;.&amp;nbsp; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3&#039; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Holding pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Humidified Chamber</td><td></td><td></td><td>Tupperware can be used</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>any standard model with CO2 and water jacketed technology</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Any Standard model</td></tr><tr><td>Image J (NIH) Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Analysis software</td></tr><tr><td>Lid of 96 well plate</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&amp;nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Sequence analysis software</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millenium RNA Markers-Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspend in DMSO at 2.5mM</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Only used embryo-tested, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspend in DMSO at 100 mM</td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 tank</td><td></td><td></td><td>for antivibration table</td></tr><tr><td>Nail Polish; Clear</td><td></td><td></td><td>Any clear nailpolish can be used</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Organ Culture Dish 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>577773</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjector</td><td>XenoWorks Digital Microinjector</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Flaming-Brown Micropipette puller</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT plasmid</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Empty vector suitable for oocyte expression.</td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purification of up to 20 uL of plasmid DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>200523</td><td>mutagenesis kit for insertions and deletions</td></tr><tr><td>Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>210512</td><td>mutagenesis kit for single site changes</td></tr><tr><td>Scissors (Fine point)</td><td>Fine science tools</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (Medium point)</td><td>Fine science tools</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Bioscienes</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer (Fine point- Size 5)</td><td>Fine science tools</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i

Embryonalen Aneuploidie ist die große genetische Ursache der Unfruchtbarkeit beim Menschen. Stammen die meisten dieser Ereignisse während der weibliche Meiose, und wenn auch positiv korreliert mit dem mütterlichen Alter, Alter allein ist nicht immer prädiktiv für das Risiko eines aneuploiden Embryonen zu erzeugen. Daher könnten falsche Chromosom Abtrennung während Oogenese Genvarianten entfallen. Angesichts der Tatsache, dass Zugang zu menschlichen Eizellen für Forschungszwecke beschränkt ist, eine Reihe von Tests wurden entwickelt, um menschliche Gen-Funktion während der Meiose ich benutze Maus Eizellen untersuchen. Erstens sind Boten-RNA (mRNA) des Gens und Genvariante des Interesses in Prophase-verhaftet Maus Eizellen mikroinjiziert. Nachdem Sie Zeit für Ausdruck, Eizellen sind synchron freigesetzt meiotische Reifung Meiose abgeschlossen ich. Durch die Kennzeichnung der mRNA mit einer Abfolge von fluoreszierenden Reporter, wie grün fluoreszierendes Protein (Gfp), kann die Lokalisierung des menschlichen Proteins neben der phänotypischen Veränderungen beurteilt werden. Z. B. Gewinn oder Verlust der Funktion durch die Gründung der experimenteller Bedingungen, die das Genprodukt meiotischen Fehler beheben Herausforderung untersucht werden kann. Obwohl dieses System bei der Untersuchung von menschlichen Proteinfunktion während Oogenese vorteilhaft ist, sollten angemessene Interpretation der Ergebnisse durchgeführt werden, da die Proteinexpression auf endogene Ebenen nicht ist und, sofern nicht für (d.h. klopfte gesteuert heraus oder unten) sind murinen homologe auch im System vorhanden.

Nach in-vitro- haben Transkription hochwertige RNA eine A260/A280 Verhältnis (1,8-2,2) eine A260/A230 Verhältnis ≥1.7, wenn mit einem Spektralphotometer gemessen. Das Bild in Abbildung 1 zeigt die Migration von in-Vitro-RNA auf einem denaturierenden Agarosegel nach Elektrophorese hergestellt. Eine Band, die verschmiert ist, Muster oder ein Beispiel, das hat mehrere große Bänder kann Verunreinigung oder Zerstörung der Probe angeben. Al...

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Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Wie die genetischen Varianten, verbunden mit der menschlichen Krankheit beginnen, aufgedeckt zu werden, ist es immer wichtiger, Systeme, um schnell die biologische Bedeutung dieser identifizierten Varianten bewerten zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der menschlichen Genfunktion während weibliche Meiose ich benutze Maus Eizellen.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

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8.8K Aufrufe.  IVI-RMA New Jersey. Wie die genetischen Varianten, verbunden mit der menschlichen Krankheit beginnen, aufgedeckt zu werden, ist es immer wichtiger, Systeme, um schnell die biologische Bedeutung dieser identifizierten Varianten bewerten zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der menschlichen Genfunktion während weibliche Meiose ich benutze Maus Eizellen.

Serie: Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Forschung

Genetik

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Entwicklungsbiologie

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Identifizierung von DNA-Schäden in prophase-arrestierten Eizellen von Mäusen

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor im Rampenlicht: Verständnis der DNA-Schadensreaktion in Säugetier-Eizellen und Präimplantationsembryonen 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Biologie

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester