Name: constructing thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides via photo-induced thiol-ene/yne hydrothiolation
Uploaded: 2018-08-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation at JoVE.com

Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung durch die Natural Science Foundation von China Grants (Nr. 21372023, 21778009 und 81701818); Das Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China (Nr. 2015DFA31590); die Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (No. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 und GJHS20170310093122365); und die China Postdoc Wissenschaftsstiftung (Nr. 2017 M 610704).

1. Ausrüstung Vorbereitung
<ol><li>Legen Sie für die manuelle Peptid-Synthese-Apparat einen Vakuum-Verteiler (Table of Materials) in einen effizienten Abzug. Als nächstes legen Sie drei-Wege-Hähne auf Vakuum Krümmer und verbinden Sie diese mit Stickstoff oder Argon Gas-Linie. Verschließen Sie alle unbenutzten Eingänge mit Kautschuk Septen.</li>
	<li>Schließen Sie Harz gefüllten Spalten (0,8 x 4 cm, 10-mL-Behälter, siehe Tabelle der Materialien) an die monteurhilfe mit der drei-Wege-Hähne (Abbildung 1). Verwenden Sie eine Pumpe ein Vakuum-System als Vakuumfiltration oder einer Pipette Gummiball durch Extrudieren verbunden, um das Lösungsmittel in den Spalten zu entfernen.</li>
	<li>Verwendung eines Photoreactor (Abbildung 2), ausgestattet mit zehn 350 nm-Lampen (Table of Materials) für UV-Bestrahlung. Schließen Sie diese an einem Argon-Gas-Tank über der Photoreactor Lufteinlass um sicherzustellen, dass die Photoreactor mit Argon-Gas vor und während der lichtreaktionen gefüllt ist.</li>
	<li>Sicherstellen Sie vor der Inbetriebnahme der UV Lampe von der Photoreactor, dass das Photoreactor geschlossen ist, für den Fall, dass es gibt Einstrahlung von UV-Licht.</li>
</ol>(2) Harz-Vorbereitung
Hinweis: In der Regel der Bau von Peptid Substrate erfolgt mit Fmoc-basierte Festphasen-Peptid-Synthese-Protokolle. Diese werden mit der Eisbahn Amid Harz, das Blätter eine C-terminalen Amid verbleibenden folgende Peptid Spaltung durchgeführt. Dieses Protokoll wird in dem Papier verwendet.
Achtung: N, N- Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan (DCM), 4-Methylmorpholine (NMM) und N, N- Diisoproylethylamine (DIPEA) sind giftig und schädlich durch Einatmen, Verschlucken oder Hautkontakt. Diethylether ist Hochentzündlich. Trifluoroacetic Säure (TFA) ist ätzend. 1,2-Ethanedithiol (EDT) ist sehr übelriechend. Daher sollten alle organischen Lösungsmitteln und Chemikalien mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Nitril-Handschuhe, Kittel und schützende Brillen) behandelt und innerhalb einer chemischen Dampfhaube behandelt werden.
<ol><li>Berechnen Sie die Menge des Harzes erforderlich, mithilfe der folgenden Formel: Skalieren (Mmol) / (Harz Ladekapazität (Mmol/g) (mg/g) 1.000) = Masse des Harzes (mg) Z.B., die Höhe der Eisbahn Amid MBHA Harz (0,5 Mmol/g) für 25 µmol = 0,025 Mmol / (0,5 Mmol/g 1.000 mg/g) = 50 mg. Als nächstes wiegen Sie 50 mg des Harzes in einer Spalte und legen Sie es auf dem Vakuum Verteiler mit drei-Wege-Hähne.</li>
	<li>Das Harz in einer Spalte (0,8 x 4 cm, 10-mL-Reservoir) 1-2 mL von DCM hinzufügen. Um das Harz zu Schwellen, schütteln Sie sanft ihn mit Stickstoff oder Argon Stream für 10 Minuten. Als nächstes Entfernen des Lösungsmittels mit Vakuumfiltration.</li>
</ol>(3) N-terminale Fmoc Deprotection und waschen
<ol><li>Bereiten Sie die N-terminale Fmoc deprotecting Lösung: bereiten Sie eine angemessene Lautstärke (200 mL) von 50 % (V/V) Morpholine in DMF in einer Glasflasche.</li>
	<li>Das Harz 1-2 mL der Lösung Deprotection hinzu, schütteln Sie sanft es 10 min und dann abgießen Sie die Lösung mit Vakuum. Mit DMF (1-2 mL) und DCM (1-2 mL) in dieser Reihenfolge, das Harz und den Reaktionsbehälter gründlich für eine Gesamtmenge von 3 X waschen. Anschließend wiederholen Sie die Deprotection und Wash Verfahren 1 X.</li>
</ol>(4) Fmoc-geschützten Aminosäure-Kupplung
<ol><li>Mit der Kopplung von Alanin Rückstände als beispielsweise im Falle von 25 µmol-Skala manuelle Synthese, wiegen Fmoc-Ala-OH (5 Äquiv, 41,4 mg), 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium Hexafluorophosphate (HCTU; 4,9 Äquiv, 50,5 mg) in einer Polypropylen-Container und in DMF (0,5 mL) auflösen.</li>
	<li>Fügen Sie DIPEA (10 Äquiv, 43,5 µl) um 0,25-m generieren aktiviert Aminosäurelösung (Tabelle 1). Nach einer ca. 1 min vor Aktivierung des Harzes die Lösung hinzu, und dann Blase es mit N2 für ca. 1-2 h.</li>
	<li>Von diesem Schritt auf jede Aminosäure in der Peptid-Kette zu integrieren, als eine Abfolge von Schritten: zuerst die Deprotection von der N-terminalen Fmoc-Gruppe, und dann waschen, gefolgt durch die Kopplung der Aminosäure über Aktivierung unter Verwendung des HCTU. Hinweis: Kupplung länger (zB., 2 h) wird empfohlen, wenn nach einem sterisch gehinderten Aminosäurerest Kupplung [zB., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-HSI (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. Die Alken/Alkinen mit unnatürlichen Aminosäuren werden in 3 Äquivalente statt 5 verwendet und sind um 3 h einwirken gelassen.</li>
	<li>Der Peptid-Synthese Arbeitsfortschritt durch Kaiser oder Chloranil Tests wie von Arora Et Al. beschrieben 36 diese Tests liefern qualitative Bewertungen der Anwesenheit oder Abwesenheit von freien primären und sekundären Aminen. Alternativ können ca. 2-3 mg des Peptids abgespalten aus dem Harz und von LC-MS analysiert.</li>
</ol>5. Thiol-ene Hydrothiolation und Thiol-Yne Biosyntheseschritt
<ol><li>Konstrukt Thioether Linker durch auf-Harz biosyntheseschritt (Abbildung 3).<ol>
<li>Ca. 50 mL der Trt Deprotection Lösung (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0) vorzubereiten. Behandeln der Cys und mS5-Lager Harz [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-Harz, 50 mg] mit 1-2 mL der Trt Deprotection Lösung in einer 10-mL-Spalte. Schütteln Sie sanft die Lösung für 10 min mit N2. Schließlich waschen Sie ihn mit DCM (1-2 mL) für eine Gesamtmenge von 3 X. Hinweis: MS5 stellt der Alkylenoxide(s)-Lager-Baustein (siehe die Struktur in Abbildung 6dargestellt) für Peptid Kupplung und Thio-ene biosyntheseschritt38verwendet.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für eine Gesamtmenge von ca. 6 X um die Trityl-Schutz-Gruppe von Cystein, zu entfernen, bis die Farbe der Lösung nicht mehr gelb ist oben beschrieben.</li>
		<li>Sprudelte mit N2, waschen Sie die R-mS5- A-A-A-Cys(-SH)-R'-Harz [Cystein mit kostenlosen Thio (-SH)] mit DMF (1-2 mL) und DCM (1-2 mL) in dieser Reihenfolge. Schrumpfen Sie des Harzes unter Verwendung von Methanol (1-2 mL) für 2 min und dann entfernen Sie des Lösungsmittels mit Filtration. Als nächstes nacheinander trocknen Sie das Harz unter Dampf von N2 Gas für ca. 5 min in der Spalte.</li>
		<li>Bereiten Sie entgast DMF vorher innerhalb einer Mund-Kolben, durch sprudelnden Stickstoffgas für ca. 1 h durch eine lange Nadel, die in dem Lösungsmittel gestreckt wurde.</li>
		<li>Übertragen Sie das Harz in einem 10 mL Runde Talsohle Kolben durch wiegen Papier. Das Harz in 2 mL der entgast DMF, gefolgt durch die Zugabe von 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Photoinitiator auszusetzen (MMP; 1 Äquiv, 5,6 mg), 4-Methoxyacetophenone (Karte; 1 Äquiv, 3,8 mg).</li>
		<li>Fügen Sie Aufsehen bar (0,3 cm) in den Kolben und den Kolben mit einer geeigneten Gummistopfen verschließen, dann verdrängen die Luft in die Flasche mit Stickstoffgas mit einer Ölpumpe. Hinweis: Der inerte Atmosphäre ist nicht unbedingt erforderlich für die effektive Thio-ene Photoreaktion auf einer festen Phase. Allerdings ist es sehr notwendig für Thio-Yne Photoreaktion in der Lösungsphase in Abbildung 5. Andernfalls wird Schwefel während der UV-Bestrahlung oxidieren.</li>
		<li>Die Photoreactor eingelassen Sie der Reaktionskolben und rühren Sie das Harz für 1 h unter UV-Bestrahlung bei Raumtemperatur (Abbildung 2). Achtung: Vor dem Einschalten der Photoreactor UV-Lampe sicherstellen Sie, dass das Photoreactor geschlossen ist, für den Fall, dass gibt es schädliche Einstrahlung von UV-Licht. Hinweis: Häufig Probenahme des Reaktionsgemisches während der lichtreaktionen ist für neue Sequenzen empfohlen, da der linearen Peptid-Vorläufer der identische Molekulargewicht des Produktes hat. Im Allgemeinen zeigen lineare und zyklische Peptide deutlich unterschiedliche Hydrophilie. Dies könnte leicht mittels HPLC zu unterscheiden. Alternativ die 5, 5' - Dithiobis-(2-Nitrobenzoic Säure) (DTNB) Reagenz könnte auch verwendet werden, um das Vorhandensein von freien Thiol37zu studieren.</li>
		<li>Übertragen Sie das Harz aus der Flasche in der Spalte und entfernen Sie der Vakuumfiltration mit Lösungsmittel. Waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Bereiten Sie etwa 10 mL der Spaltung cocktail (TFA/Tipps/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) in der Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Übertragen das Harz in einer 2-mL Polypropylen Behälter füllen 1 mL der Spaltung cocktail (TFA/Tipps/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) in den Behälter und verschließen der Behälter dicht mit einem Schraubverschluss. Dann schütteln Sie sanft den Container auf einem Orbitalschüttler mit einer Rate von 60 u/min in der Dunstabzugshaube für 1,5-2 h. Achtung: TFA ist stark ätzend. Tragen Sie Schutzkleidung und arbeiten in einer effizienten Abzug. EDT ist eine stark riechende Substanz und muss in einen effizienten Abzug gehandhabt werden.</li>
		<li>Entfernen Sie die TFA-Cocktail durch Verdampfung unter einer N-2 -Gasstrom in der Dunstabzugshaube. Als nächstes Niederschlag den Rückstand mit kaltem Diethylether (1 mL) für 30 s und isolieren es durch Zentrifugation bei 12.000 x g 2 min. lang. Nach der Zentrifugation sanft Ausgießen der Äther-Komponente. Wiederholen Sie der Niederschlag und Zentrifugation Schritte für 2 X. Verdunsten Sie den Rückstand auf Trockenheit.</li>
		<li>Schließlich lösen sich die Rückstände in 1 mL H2O/Acetonitril (2:1) und reinigen durch HPLC mit einer C18 analytische Säule (4,6 x 250 mm, Durchfluss 1,0 mL/min). Verwendung H2O (mit 0,1 % TFA) und reinem Acetonitril als Lösungsmittel bei einem linearen Farbverlauf 2%/min von 20 % bis 70 % Acetonitril über 25 min. Monitor HPLC Spektren mit UV-280 nm und 220 nm Wellenlängen (Tabelle 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Konstruieren Sie den Thioether Linker durch intermolekulare Thio-ene Reaktion und dann Cyclize das Peptid von Macrolactamization (Abbildung 4).<ol>
<li>Die Alkylenoxide(s) Rückstände mit linearen Peptid H2N-A-A-A-mS5zu synthetisieren (2-R'')-R'-Harz (50 mg) mit standard Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) im beschriebenen Schritte 2 bis 4. Anschließend waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Unterbrechen Sie das Harz in einem 10 mL Runde Talsohle Kolben, 2 mL entgast DMF enthalten, wie in Schritt 5.1.4 beschrieben.</li>
		<li>Fügen Sie den Photoinitiator MMP und Karte (MMP: 1 Äquiv, 5,6 mg; Karte: 1 Äquiv, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 Äquiv, 25,7 mg) und einen Stir bar (0,3 cm) in den Kolben. Verschließen Sie den Kolben mit einer geeigneten Gummistopfen und verwenden Sie die Öl-Pumpe, um die Luft in der Flasche mit Stickstoff zu ersetzen.</li>
		<li>Die Photoreactor der Reaktionskolben eingelassen. Rühren Sie für 1-2 h unter UV-Bestrahlung bei Raumtemperatur (Abbildung 2).</li>
		<li>Überwachen Sie die Reaktion unter eine LC-MS-Analyse: 2-3 mg des Harzes mit der Spaltung Cocktail zu Spalten. Dann überstürzen sich die Rückstände mit kalten Diethylether (300 µL), isolieren Sie die Rückstände durch Zentrifugation und verdunsten des Rückstands zu Trockenheit, wie in Schritt 5.1.11 beschrieben. Danach lösen sich die Rückstände in 100 µL H2O/Acetonitril (2:1). Die peptidlösung unter Verwendung eines 0,22 µm mikroporösen Films filtrierbar und analysieren sie mit LC-MS mit der Verbindung in der Elektrospray-Ionisation (ESI) ionisiert und in positive Modus betrieben.</li>
		<li>Wenn nötig, wiederholen Sie 5.2.2 Schritte - erfolgt bis zur Fertigstellung 5.2.4 um die Reaktion zu gewährleisten.</li>
		<li>Übertragen Sie nach dem Abschluss der Foto-Reaktion das Harz aus der Flasche in die Spalte zu, und entfernen Sie des Lösungsmittels mit Vakuumfiltration. Waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Fügen Sie die DMF-Lösung von benzotriazol-1-Yl-Oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (PyBob; 2,4 Äquiv, 31,2 mg), 1-Hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4 Äquiv, 8,1 mg), und NMM (4 Äquiv, 11 µL) in das Harz in der Spalte für die Macrolactamization. Diese Lösung mit N2 2 h-Blase.<ol>
<li>Darüber hinaus überwachen Sie diese Koppelung Reaktion mit LC-MS, wie unter Punkt 5.2.3 beschrieben. Falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Schritt, um die Reaktion zu gewährleisten bis zur Fertigstellung durchgeführt wird.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verlängern Sie das Peptid mit standard Fmoc-basierte SPPS, wie in den Schritten 3 und 4 beschrieben.</li>
		<li>Spalten Sie bei der Montage von allen Aminosäurereste das Peptid aus dem Harz zu, wie in den Schritten 5.1.10 und 5.1.11 beschrieben und reinigen Sie es zu, wie im Schritt 5.1.12. beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>Konstruieren Sie Vinyl-sulfid-Linker in der Lösungsphase (Abbildung 5).<ol>
<li>Synthetisieren Sie die Alkinen Rückstände mit linearen Peptid mit standard Fmoc-basierte SPPS, wie in den Schritten 2 bis 4 beschrieben. Synthetisieren Sie die Alkinen mit Aminosäure nach einem etablierten Protokoll, wie in einer früheren Studie20beschrieben.</li>
		<li>Spalten Sie das Peptid aus dem Harz zu und überstürzen Sie es mit kalten Diethylether wie 5.1.9 - 5.1.11 beschrieben. Nach der Spaltung und Niederschlag des Harzes sammeln Sie das Peptid über 2 min Zentrifugation bei 12.000 x g.</li>
		<li>Trocknen Sie den daraus resultierende Rückstand in einem Vakuum. Auflösen den Rückstand im entgast DMF (50 mL) in einem 100 mL Runde Talsohle Kolben um eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erreichen (basierend auf das Laden des Harzes, 0,025 Mmol (1000 mL/L / 0,5 Mmol/L) = 50 mL).<ol>
<li>Hinzufügen der Photoinitiator DMPA (0,5 Äquiv, 3,2 mg) und dann Entgasen der Reaktionslösung für 10 min mit N2 durch eine lange Nadel dehnte sich in der Lösung. Als nächstes bestrahlen Sie die Probe unter UV-Licht bei Raumtemperatur für 0,5 - 1 h ohne Aufregung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Entfernen Sie das ZMS im Hochvakuum und überstürzen Sie sich die grobe Rückstände durch Zugabe von Diethylether um seine organische Nebenprodukte aufzulösen. Dann, Isolieren des Zentrifugation mit 12.000 x g für 2 min Rückstands. Nach der Zentrifugation sanft Ausgießen der Äther-Komponente. Verdunsten Sie den Rückstand auf Trockenheit. Schließlich lösen sich die Rückstände in 1 mL H2O/Acetonitril (2:1) und mittels HPLC wie in Schritt 5.1.7 beschrieben reinigen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In der am Harz Intramolekulare Thio-ene biosyntheseschritt in Abbildung 3beschrieben die Beseitigung der Trityl Gruppe von Cystein-Rückstand erwies sich ein entscheidender Schritt für die anschließende Photoreaktion. Darüber hinaus dargestellt das Peptid Molekulargewicht vor und im Anschluss an die Reaktion erwies sich als identisch in Abbildung 6 b. Daher ist die Verwendung einer HPLC-Identifikation oder ein DTNB Assay erforderlich, um die Reaktion zu über...

Die Entwicklung des Liganden zu modulieren, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) bietet ein attraktives Konzept für die moderne Arzneimittelforschung. So wurde viel Aufwand in Studium neuartige chemische Modalitäten investiert, die effizient ppi1,2,3modulieren kann. Ppi in der Regel bestehen aus flachen, großen und/oder aufgegebenen wechselwirkenden Oberflächen und kleine Moleküle sind in der Regel als ungeeignet Liganden für die Modulation des ppi4,5. Mit einer geeigneten exponierten interagierende Fläche stellen kurze Peptide, die die strukturellen Merkmale des Proteins Schnittstellen imitieren ideale Kandidaten für dieses Problem6,7Adresse dar. Kurze Peptide sind jedoch in der Regel unstrukturiert in einer wässrigen Lösung. Dies ist die Wassermoleküle, die mit dem Intramolekulare Wasserstoff Verklebung Netzwerk der Peptidrückgrat und klar definierte Konformationen konkurrieren im Wasser8entropically ungünstig sind. Darüber hinaus die Peptide von Natur aus geringe Stabilität und Durchlässigkeit Zelleneigenschaften weitgehend beschränken ihre Verwendung in Anwendungen in der Biologie9,10. Nach der Protein Data Bank (PDB) Analyse > 50 % der PPI beinhalten kurze α-Helix-Wechselwirkungen-11. So wurden verschiedene chemische Methoden in Bezug auf Helix Stabilisierung entwickelt. Dazu gehören Disulfid/Thioether Anleihe Bildung12,13,14, Ring-Schließung Metathese15, Lactam-Ring Bildung16, "klicken" Chemie17, Zugabe von Perfluoroarenes18,19und Vinyl-sulfid Bildung20.
Stabilisierte spiralförmige Peptide werden weithin genutzt, für verschiedene intrazelluläre Ziele, einschließlich p53, Östrogen-Rezeptoren, Ras, BCL-2 Familie Proteine und andere21,22,23,24. ALRN-6924, eine All-Kohlenwasserstoff Peptid duale Inhibitor von MDM2 und MDMX geheftet, ist derzeit für klinische Untersuchung25verwendet wird. In den letzten Jahren konzentriert sich unsere Gruppe auf die Entwicklung von neuartigen Peptid-Stabilisierung-Methoden mit Thiol-ene und Thiol-Yne Reaktionen26,27,28. Im Allgemeinen haben wir gezeigt, dass diese Foto-initiierten Reaktionen sind effizient unter milden Bedingungen, wenn natürlich reichlich Cystein verwendet wird. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Reaktionen eine ausgezeichnete funktionelle Gruppe Toleranz haben, sind Bio-orthogonal und erwiesen sich als für Peptid und Protein Änderungen29anwendbar. Die daraus resultierende Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide weitgehend verbessern den chemischen Raum Einschränkung Peptide, bieten eine labile-Tether Modification Centers und erweist sich für den Einsatz in zahlreichen Anwendungen in der Biologie30 ,31,32. Bisher wurden nur begrenzte Berichte über Thiol-ene/Thiol-Yne Peptid biosyntheseschritt beschrieben. In einer Studie von Anseth Et Al. im Jahr 2009 war eine Reaktion auf Harz Intramolekulare Thiol-ene für Peptid-biosyntheseschritt zwischen aktivierten Alkenen mit Cystein demonstriert33. Im Jahr 2015 Chou Et Al. eine Zweikomponenten-radikale initiiert Thiol-ene Reaktion für Peptid Heften34 und eine anschließende, sequentielle Thiol-Yne/ene Kupplung Reaktion35beschrieben. Vor kurzem haben wir eine Reihe von arbeiten, die basierend auf Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide20,26,27beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Synthese der oben genannten Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide in der Hoffnung, dass es für die Allgemeinheit Forschung nützlich sind.

<table><tbody><tr><td>Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g)</td><td>HECHENG</td><td>GRM50407</td><td></td></tr><tr><td>Standard Fmoc-protected amino acids</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-2-pyrrolidinone</td><td>Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.</td><td>3230</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>N,N-Dimethyl formamide</td><td>Energy</td><td>B020051</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Energy</td><td>W330229</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>N,N-Diisoproylethylamine</td><td>Aldrich</td><td>9578</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>J&amp;amp;K</td><td>101398</td><td>corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>J&amp;amp;K</td><td>973821</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>J&amp;amp;K</td><td>248897</td><td>Stench</td></tr><tr><td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate&amp;nbsp;</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>851012</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>flammable</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicity</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicity</td></tr><tr><td>2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone</td><td>Energy</td><td>A050035</td><td></td></tr><tr><td>4-methoxyacetophenone</td><td>Energy</td><td>A050098</td><td></td></tr><tr><td>2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone</td><td>Energy</td><td>D070132</td><td></td></tr><tr><td>5,5&#039;-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)</td><td>J&amp;amp;K</td><td>281281</td><td></td></tr><tr><td>Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate</td><td>Energy</td><td>E020172</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazole</td><td>Energy</td><td>D050256</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylmorpholine</td><td>Energy</td><td>W320038</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Liquid Chromatography</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-30AD</td><td></td></tr><tr><td>Electrospray Ionization Mass</td><td>SHIMADZU</td><td>LCMS-8030</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>FreeZone</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentration system</td><td>Thermo</td><td>Savant</td><td></td></tr><tr><td>vacuum manifold</td><td>promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>three-way stopcocks</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>poly-prep chromatography columns&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr></tbody></table>

constructing thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides via photo-induced thiol-ene/yne hydrothiolation

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung der Thioether angebunden Peptide mit am Harz Intramolekulare/intermolekulare Thiol-ene Hydrothiolation. Dieses Protokoll beschreibt darüber hinaus die Vorbereitung der Vinyl-sulfid-angebunden Peptide mit in Lösung Intramolekulare Thiol-Yne Hydrothiolation zwischen Amino acids, die Alken/Alkinen Seitenketten besitzen und Cystein Rückstände am ich, ich + 4 Positionen. Mit einem standard Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) lineare Peptide synthetisiert. Thiol-ene Hydrothiolation erfolgt über eine Intramolekulare Thio-ene Reaktion oder eine intermolekulare Thio-ene Reaktion abhängig von der Peptid-Länge. In dieser Studie erfolgt eine Intramolekulare Thio-ene Reaktion bei kürzeren Peptiden mit auf Harz-Deprotection der Trityl Gruppen von Cystein-Rückstände, die nach der vollständigen Synthese von linearen Peptid. Das Harz wird dann auf UV-Bestrahlung mit Photoinitiator 4-Methoxyacetophenone (MAP) und 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP) festgelegt. Die intermolekularen Thiol-ene Reaktion erfolgt durch Fmoc-Cys-OH in einem N, N- Dimethylformamid (DMF) Lösungsmittel auflösen. Dies wird dann mit dem Peptid mit der Alken-Lager Rückstand auf Harz reagiert. Danach die Macrolactamization erfolgt mit benzotriazol-1-Yl-Oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (PyBop), 1-Hydroxybenzotriazole (HoBt) und 4-Methylmorpholine (NMM) als Aktivierung Reagenzien auf das Harz. Im Anschluss an die Macrolactamization die Peptidsynthese wird fortgesetzt mit standard SPPS. Im Falle der Thio-Yne Hydrothiolation der linearen Peptid gespalten aus dem Harz, getrocknet und anschließend in entgastem DMF gelöst. Dies wird dann bestrahlt, mit UV-Licht mit Photoinitiator 2,2-Dimethoxy-2-Phenylacetophenone (DMPA). Nach der Reaktion DMF wird verdampft und die grobe Rückstände wird ausgefällt und gereinigt mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Diese Methoden könnte funktionieren, um die Generation der Thioether angebunden zyklische Peptide durch den Einsatz von Thio-ene/Yne Click-Chemie zu vereinfachen, die überlegene funktionelle Gruppe Toleranz und guten Ertrag besitzt. Die Einführung von Thioether Anleihen in Peptide nutzt der nukleophilen Natur von Cystein-Rückständen und Redox-inert gegenüber Disulfid-Bindungen.

Die HPLC und MS Spektren von Peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 und deren cyclisiert Produkt Ac - Y-(Cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 , die erstellt wurden mit der am Harz Intramolekulare Thiol-ene Photoreaktion in Abbildung dargestellt 6 b. das zyklische Peptid wurde festgestellt, dass eine identische Molekulargewicht im Verhältnis zu seinem linearen Vorläufer haben. Die HPLC-Verweilzeit wurde allerdings beobachtet, ca. 2 min frü...

Watch this Scientific Journal Video about Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation at JoVE.com

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Wir präsentieren ein Protokoll für den Bau von Thioether/Vinyl sulfid angebunden spiralförmige Peptide mit Foto-induzierte Thiol-ene/Thiol-Yne Hydrothiolation.

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

constructing-thioethervinyl-sulfide-tethered-helical-peptides-via

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.7K Aufrufe.  Peking University Shenzhen Graduate School. Wir präsentieren ein Protokoll für den Bau von Thioether/Vinyl sulfid angebunden spiralförmige Peptide mit Foto-induzierte Thiol-ene/Thiol-Yne Hydrothiolation.

Serie: Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Forschung

Biochemie

Synthesis of Programmable Main-chain Liquid-crystalline Elastomers Using a Two-stage Thiol-acrylate Reaction

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline elastomers (LCEs) with facile control over network structure and programming of an aligned monodomain. Tailored LCE networks were synthesized using routine mixing of commercially available starting materials and pouring monomer solutions into molds to cure. An initial polydomain LCE network is formed via a self-limiting thiol-acrylate Michael-addition reaction. Strain-to-failure and glass transition behavior were investigated as a function of crosslinking monomer, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (PETMP). An example non-stoichiometric system of 15 mol% PETMP thiol groups and an excess of 15 mol% acrylate groups was used to demonstrate the robust nature of the material. The LCE formed an aligned and transparent monodomain when stretched, with a maximum failure strain over 600%. Stretched LCE samples were able to demonstrate both stress-driven thermal actuation when held under a constant bias stress or the shape-memory effect when stretched and unloaded. A permanently programmed monodomain was achieved via a second-stage photopolymerization reaction of the excess acrylate groups when the sample was in the stretched state. LCE samples were photo-cured and programmed at 100%, 200%, 300%, and 400% strain, with all samples demonstrating over 90% shape fixity when unloaded. The magnitude of total stress-free actuation increased from 35% to 115% with increased programming strain. Overall, the two-stage TAMAP methodology is presented as a powerful tool to prepare main-chain LCE systems and explore structure-property-performance relationships in these fascinating stimuli-sensitive materials.

A novel methodology is presented to synthesize and program main-chain liquid-crystalline elastomers using commercially available starting monomers. A wide range of thermomechanical properties was tailored by adjusting the amount of crosslinker, while the actuation performance was dependent on the amount of applied strain during programming.

Synthese von Programmierbare Hauptkettenflüssigkristalline Elastomere unter Verwendung eines Zwei-Stufen-Thiol-Acrylat-Reaktions

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline ...

Chemie

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Biotechnik

Self-assembling Morphologies Obtained from Helical Polycarbodiimide Copolymers and Their Triazole Derivatives

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous networks, ribbons, worm-like aggregates, toroidal structures, and spherical particles) is described. These aggregates are morphologically influenced by extensive hydrophobic side chain-side chain interactions of the singular polycarbodiimide strands, as inferred by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) techniques. Polycarbodiimide-g-polystyrene copolymers (PS-PCDs) were prepared by a combination of synthetic methods, including coordination-insertion polymerization, copper(I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC) &#34;click&#34; chemistry, and atom transfer radical polymerization (ATRP). PS-PCDs were found to form specific toroidal architectures at low concentrations in CHCl3. To determine the influence of a more polar solvent medium (i.e., THF and THF/EtOH) on polymer aggregation behavior, a number of representative PS-PCD composites have been tested to show discrete concentration-dependent spherical particles. These fundamental studies are of practical interest to the development of experimental procedures for desirable architectures by directed self-assembly in thin film. These architectures may be exploited as drug carriers, whereas other morphological findings represent certain interest in the area of novel functional materials.

Here, we present a protocol to prepare and visualize secondary structures (e.g., fibers, toroidal architectures, and nano-spheres) derived from helical polycarbodiimides. The morphology characterized by both atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) was shown to depend on molecular structure, concentration, and the solvent of choice.

Selbstaufbau Morphologien Gewonnen aus Helical Polycarbodiimid-Copolymere und deren Triazolderivate

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and porous metal-dithiolene network in the highly ordered single crystalline state. Unlike the highly reactive free-standing thiols, which tend to decompose and complicate the crystallization of metal-thiolate open frameworks, the thioester reacts in situ to provide the thiol species, serving to mitigate the reaction between the mercaptan units and the metal centers, and to improve crystallization consequently. Specifically, the thioester was synthesized in a one-pot procedure: an aromatic bromide (hexabromotriphenylene) reacted with excess sodium thiomethoxide under vigorous conditions to first form the thioether intermediate product. The thioether was then demethylated by the excess thiomethoxide to provide the thiolate anion that was acylated to form the thioester product. The thioester was conveniently purified by standard column chromatography, and then used directly in the framework synthesis, wherein NaOH and ethylenediamine serve to revert in situ the thioester to the thiol linker for assembling the single-crystalline Pb(II)-dithiolene network. Compared with other methods for thiol synthesis (e.g., by cleaving alkyl thioether using sodium metal and liquid ammonia), the thioester synthesis here uses simple conditions and economical reagents. Moreover, the thioester product is stable and can be conveniently handled and stored. More importantly, in contrast to the generic difficulty in accessing crystalline metal-thiolate open frameworks, we demonstrate that using the thioester for in situ formation of the thiol linker greatly improves the crystallinity of the solid-state product. We intend to encourage broader research efforts on the technologically important metal-sulfur frameworks by disclosing the synthetic protocol for the thioester as well as the crystalline framework solid.

Here, we present a one-pot, transition-metal-free synthesis of thiols and thioesters from aromatic halides and sodium thiomethoxide, followed by the preparation of single crystals of a metal-dithiolene network using thiol species generated in situ from the more stable and tractable thioester.

Synthese von Thiol Baustein für die Kristallisation eines halbleitenden Gyroidal Metall-Schwefel-Rahmens

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Synthese von informationstragenden Peptoiden und deren sequenzgesteuerter dynamischer kovalenter Selbstmontage

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

Konstruktion zyklischer Peptide mit einem On-Tether-Sulfoniumzentrum

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...