Name: characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry
Uploaded: 2018-03-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
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Wir möchten danken J. van de Steuervermeidung und M. Vroomen (Universität Maastricht, Niederlande), für die technische Unterstützung. Darüber hinaus möchten wir K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, danken und E. Blaak für die Bereitstellung von Blut und Gewebe-Biopsien zum Einrichten dieses Protokolls und der nachfolgenden Experimente verwendet.

Themen, die in die Studie genehmigt von der medizinischen Ethik Komitee Jessa Krankenhaus, Hasselt und Universität Hasselt, Belgien in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki aufgenommen wurden viszeralen und subkutanen Proben entnommen.
1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Kollagenase-Lösung<ol>
<li>Lösen Sie 1 g der Kollagenbildung zwischengespeichert ich in 10 mL von Phosphat Kochsalzlösung (PBS, ohne Calcium und Magnesium) um eine 100 mg/mL Stammlösung zu machen. 200 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Lösen Sie 1 g von Kollagenase XI in 10 mL PBS eine 100 mg/mL Stammlösung zu machen. 200 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Auflösen von 10 mg der DNase I 10 mL PBS eine 10 mg/mL Stammlösung zu machen. Bereiten Sie 180 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Hinzufügen von 100 µL Collagenase I (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) und 90 µL DNase I (10 mg/mL) bis 10 mL DMEM Schinken F12. Machen Sie Kollagenase-Lösung für jede Isolierung frisch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erythrozyten-Lyse-Puffer<ol>
<li>0,84 g NH4Cl in 100 mL hochreines Wasser auflösen.</li>
		<li>Den pH auf 7,4 vor Gebrauch festgelegt. In einem Glaskolben bei 4 ° c lagern</li>
		<li>Ort der Erythrozyten Lyse Puffer auf dem Eis vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS-Puffer<ol>
<li>Auflösen von 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 100 mL PBS, 0,5 % BSA PBS zu erhalten.</li>
		<li>Auflösen von 65 mg NaN3 in 100 mL 0,5 % BSA PBS 10 mM NaN3 0,5 % BSA PBS zu erhalten. Store-Lösung in einem Glaskolben bei 4 ° C.</li>
		<li>Ort FACS-Puffer auf dem Eis vor Gebrauch. Achtung: NaN3 ist hochgiftig. Arbeiten in einer Dampfhaube und Schutzbrille und Handschuhe zum Schutz beim Umgang mit NaN3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menschliche IgG-block<ol>
<li>Lösen Sie 10 mg von menschlichen IgG in 10 mL PBS, 1 mg/mL zu erhalten. 100 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Platzieren Sie den menschliche IgG-Block auf dem Eis vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung des SVF von AT
<ol><li>Kleinschneiden Sie 1 g bei Biopsie (± 2 mm2) mit einem Skalpell und Transfer in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen (z.B. Falcon-Röhrchen). 10 mL Kollagenase Lösung zu jedem Beispiel zugeben. Hinweis: Schließen Sie den Deckel des Rohres vollständig und drehen Sie den Deckel ¼ Umdrehung zurück.</li>
	<li>Inkubation für 60 min bei 37 ° C in einem Wasserbad unter sanft schütteln (60 Zyklen/Min.).</li>
	<li>Filtern Sie die entstandene Suspension mit einem 200 µM-Filter und sammeln Sie die Probe in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 7 mL PBS auf den Filter zu spülen den Filter alle Zellen hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie die schwimmenden Adipocyte Bruchteil durch pipettieren. Die Zelle-Kugel ist der SVF. Hinweis: Entfernen Sie den Adipocyte Bruchteil um SVF zu erhalten. Vermeiden Sie die gesamte Spitze der Stichprobe untertauchen, weil dadurch nur der PBS und nicht die schwimmenden Fettzellen entfernt werden.</li>
	<li>Aufschwemmen der SVF in 5 mL PBS Kollagenase zu entfernen, die Aufhängung mit einem 70 µM-Filter filtern, spülen den Filter mit 5 mL PBS und Zentrifugieren der Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und das Pellet in 3 mL Erythrozyten Lyse Puffer Aufschwemmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 5 min auf Eis. 7 mL PBS nach Inkubation hinzugeben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
</ol>3. Färbung des SVF für Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Auflösen der Zelle Pellet in 90 µL 4 ° C FACS Puffer und 10 µL 1 mg/mL menschliche IgG-Block hinzufügen. Teilen Sie die Zellsuspension in 2 Brunnen eine V-Form 96-well-Platte. Die Platte auf dem Eis und lassen Sie die menschliche IgG-Block für 15 min inkubieren.</li>
	<li>Jede Probe zu waschen und die Platte für 5 min bei 280 X g bei 4 ° c zentrifugiert fügen Sie 100 µL FACS Puffer hinzu Den Überstand durch Kippen der Plattenrandes auf dem Kopf stehend in einer fließenden Bewegung ohne Tippen auf die Platte zu entfernen. Hinweis: Stellen Sie sicher, jede restliche Flüssigkeit von der Oberseite der Platte mit einem Taschentuch zu entfernen, während die Platte auf dem Kopf stehend zu halten.</li>
	<li>Bereiten Sie Antikörper Cocktails für Makrophagen und DC Teilmengen (FACS-Panel 1) und T - und B-Zell-Subsets (FACS-Panel 2) wie in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben. Die Bände, die in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschrieben werden ausgewählt nach der Optimierung der Antikörper-Konzentrationen und sind ausreichend für eine Mehrwertsteuer oder sAT Probe. Hinweis: Im Bedienfeld "FACS" 1, verwenden die Marker CD303 und CD141 um zu bestätigen, dass CD11C+ CD11Bniedrigen Zellen sind DCs. Es wird jedoch empfohlen, diese Marker aus dem Panel auf einen lebenden/Toten Färbung auszuschließen. Beide FACS-Panel 1 und 2 sind kombinierbar mit der LIVE/DEAD fixierbar Red Dead Cell Fleck Kit Lebensfähigkeit Färbung wenn ausgenommen CD303 in Panel 1 als PE-Kanal unbenutzt sein wird. Durchführen Sie Lebensfähigkeit Färbung nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Das Pellet in 29,5 µL Antikörper cocktail für FACS Panel 1 und 23 µL Antikörper cocktail für FACS-Panel 2 aufzuwirbeln. Inkubieren Sie für 30 Minuten im Dunkeln auf dem Eis.</li>
	<li>Jedes gut 150 µL FACS Puffer hinzu und Aufschwemmen der Zelle Pellet um einen zweiten Waschschritt durchzuführen. Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 280 x g und 4 ° C. Den Überstand durch Kippen der Plattenrandes auf den Kopf zu entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 150 µL 1 % Formaldehyd-Lösung in jeder der Zellen zu beheben. Übertragen Sie die Zellsuspension aus jedem Brunnen mit dem entsprechenden FACS-Rohr durch Pipettieren mit einer Pipette P200. FACS-Rohre bei 4 ° C in den dunklen bis zu 7 Tage aufbewahren. Hinweis: Direkte Messung ist auch möglich. Fügen Sie 150 µL FACS Puffer in jede Vertiefung statt 1 % Formaldehyd hinzu, übertragen Sie die Zellen durch Pipettieren mit einer P200-Pipette auf die entsprechenden FACS-Rohre und analysieren Sie die Zellen zu. Achtung: Formaldehyd ist sehr giftig. Bereiten Sie Formaldehyd-Lösungen während der Arbeit in einer Dampfhaube nicht einatmen und tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille zum Schutz vor.</li>
</ol>(4) Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Vor der ersten Messung mithilfe eines ungefärbten Negativkontrolle forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) festlegen. Passen Sie die Spannungen der Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers, sodass alle Populationen von Interesse im FSC und SSC Diagramm sichtbar sind und eine zwischen Schutt und lebenden Zellen Unterscheidung.</li>
	<li>Durchführen Sie Multi-Color Compensation Analyse mit Antikörper erfassen Perlen nach Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Bereiten Sie Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrollen durch Herstellung der Antikörper-Mischung aber schließen Sie einen Antikörper aus dem Mix aus. Dies gilt für jeden Antikörper, Schaffung von 8 Antikörper-Mischungen für FACS Panel 1 und 6 Antikörper-Mischungen für FACS-Panel 2. Diese FMO Antikörper Mischungen dienen, SVF, wie zuvor beschrieben in diesem Protokoll zu beflecken.</li>
	<li>Messen Sie alle FMO Steuerelemente und der gating-Strategie basierend auf FMO-Steuerelemente. Verwenden Sie die FMO-Steuerelemente möglich Auto-Fluoreszenz der Zellen zu erkennen. Hinweis: Entfernen Sie einen Antikörper aus dem Mix, Fluoreszenz-Ebene erkannt in diesem Kanal ist ein Hintergrund/Autofluorescent Signal. Daher, durch den Vergleich der verschiedenen FMO Kontrollergebnisse FACS, Tore auf bestimmte Bevölkerungsgruppen, um sicherzustellen, dass die Gatings auf positive Zellen basieren und nicht auf Auto-Fluoreszenz basiert gezogen werden können.</li>
	<li>Wirbel der FACS-Rohre bei 800 u/min vor der Einlagerung in das Durchflusszytometer und die Messung starten. Hinweis: Mindestens 50.000 Veranstaltungen im live Tor wird empfohlen, um sicherzustellen, dass genügend Zellen von jeder Subpopulation gemessen werden.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Diese Methoden beschreiben, wie die SVF von der Mehrwertsteuer zu isolieren und saß und die relativen Mengen von Immunzellen in diesen Geweben zu quantifizieren. Darüber hinaus geben die Methoden wie die Expression von Markern auf bestimmte Zelltypen zu bestimmen.
Durchflusszytometrie von Immunzellen Gewebe ist eine leistungsfähige Technik für Phänotyp der immunologischen Zustand der Gewebe. Die Quantifizierung der Gewebe Immunzellen kann viele Anwendungen haben. Wie in den Ergebnissen beschrieben, ist es möglich, das Vorhandensein von bestimmten Immunzellen zwischen Gruppen von Patienten (z.B.mageres vs. fettleibig) zu vergleichen. Darüber hinaus können indem auch die Durchflusszytometrie auf Blut von den gleichen Patienten, Assoziationen zwischen zirkulierenden Zellen und Gewebe untersucht werden. Mit dieser Anwendung konnten wir feststellen, dass eine bestimmte Teilmenge der zirkulierenden Monozyten mit Pro-inflammatorischen CD11C verbunden ist+ Fettgewebe Makrophagen16.
Anpassungen des beschriebenen Protokolls werden ihre Anwendungen erweitern, wie zahlreiche verfügbare fluoreszierende Antikörper Durchflusszytometrie sehr vielseitig machen. Mit verschiedenen Antikörpern lassen sich fast alle Zelltypen unterscheiden und der Ausdruck der vielen Marker detektiert werden. Darüber hinaus ist es möglich, Marker intrazellulär zu beflecken, durch permeabilizing der Zellmembran intrazelluläre Bindung von fluoreszierenden Antikörpern zu ermöglichen. Diese Eigenschaften erlauben Unterscheidung der unterschiedlichsten Makrophagen Bevölkerungen über die übermäßig vereinfachten M1 und M2-Makrophagen-Subtypen. Neben der Messung der Oberfläche Marker Ausdruck können Proteine (z.B. Zytokine) intrazellulär mit Informationen über Makrophagen Funktionalität befleckt werden. Darüber hinaus werden Proliferationsmarker wie Ki67 zur Verbreitung Preise zu quantifizieren. Wie beschrieben, basierte Unterscheidung zwischen Makrophagen und DCs auf MFI Ebenen der DC-Marker. Ein allgemeine Makrophagen Marker, wie CD68 kann die Makrophagen-Panel (FACS-Panel 1) integriert werden. CD68 muss jedoch intrazellulär erfordern Permeabilisierung der Zellmembran befleckt werden, das ist nicht besser und das Protokoll erweitern würde. Weitere Makrophagen-Marker sind Teilmenge Markierungen wie CD163 und CD206 oder CD11c, letztere in der hier vorgestellten Makrophagen-Panel integriert.
In unseren FACS-Panels, ein Marker, lebende und tote Zellen zu unterscheiden wurde nicht aufgenommen, was wäre vorzuziehen, weil es einen genauere Ausschluss von abgestorbenen Zellen als die Verwendung von FSC und SSC ermöglicht. Häufig sind die DNA Färbung, Lebensfähigkeit Farbstoffe Propidium Jodid (PI) oder 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) sowie freie Amin reagiert Farbstoffe wie die LIVE/DEAD fixierbar tote Zelle färben Kit, die in verschiedenen Dye Farben erhältlich. Jedoch kann nicht PI und DAPI verwendet werden, wenn die Zellen zu fixieren. Wie im Protokoll beschrieben, die LIVE/DEAD fixierbar Red Dead Cell Lebensfähigkeit Färbung in beide Platten integrierbar ohne Auswirkungen auf die gesamte FACS Anspritzung Strategie.
Darüber hinaus werden die Daten ausgedrückt als Prozentsatz der lebenden Zellen, was bedeutet, dass alle Daten sind relativ. Nur durch Eingabe einer genauen, wäre bekannt, Anzahl der Zellen in das Durchflusszytometer es möglich die genauen Zahlen der einzelnen Zelle bestimmen. Eine ungefähre Anzahl von Zellen konnte nach dem zählen der Zellen in der SVF-Fraktion mithilfe einer Zählkammer berechnet werden. Diese Zahl müsste für die Höhe der Biopsie Gewebe verwendet, um die SVF isolieren angepasst werden, aber dies hat Einschränkungen beim lehnen zu fettleibig zu vergleichen. Eine ähnliche Masse von adipösen AT besteht aus weniger Fettzellen, wie sie mit Lipiden gefüllt sind und stark erweitert haben. Dies führe zu einer Unterschätzung der Immunzelle Zahl wenn als Anzahl der Immunzellen pro Gramm bei oder Adipocyte dargestellt.
In Humanstudien erfolgt Einbeziehung von Patienten in der Regel über einen längeren Zeitraum hinweg machen Standardisierung von experimentellen Verfahren von großer Bedeutung. Für den Vergleich von Flow Cytometry Daten zwischen Patienten gibt es mehrere Möglichkeiten. Wie in diesem Protokoll beschrieben, können Zellen vor der Messung erlaubt die Analyse von mehreren Proben am gleichen Tag behoben werden. Dies kann auch erreicht werden, durch das Einfrieren der SVF, bevor sie beflecken, wodurch das Färbeverfahren zwischen allen Proben gleich sein, aber die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt werden könnte. Zu guter Letzt auch in dieser Studie beschäftigt, fluoreszierende Perlen Vergütungsstufen zu installieren sind und Cytometer Tracking Perlen wurden zweimal wöchentlich verwendet, um tägliche Messungen der Cytometer standardisieren. Diese letzte Option ist die effizienteste beim Ausmessen von Proben aus einer Studie, die über einen langen Zeitraum hinweg.
Ein limitierender Faktor für Durchflusszytometrie ist im Allgemeinen die Verwendung der Fluoreszenz. Die Anzahl der Fluoreszenzmarkierungen, die gleichzeitig erkannt werden können ist begrenzt durch Überlappung in Emissionsspektren. Jedoch kann mit smart FACS-Panel-Entwicklung und den Einsatz von mehrere Antikörper Cocktails pro MwSt oder sAT Probe, dieses Problem überwinden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Ein wichtiger Aspekt der FACS-Panel-Entwicklung ist FMO Kontrollen. Mithilfe des Fensters mit einer Ausnahme alle Antikörper können potenzielle Autofluoreszenz Ebenen beim Vergleich der FMO mit Vollelement geschätzt werden. Dies ermöglicht genaue Anspritzung von Populationen und diese Verfahren durchgeführt werden, wenn Sie ein neues FACS-Panel einrichten. Darüber hinaus können neue Generationen von FACS-Geräte bis zu 50 Parameter ermöglicht simultane Detektion von vielen Merkmalen pro Zelle erkennen. Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Fluoreszenz-Aspekt ist die Autofluoreszenz der Zellen, insbesondere Makrophagen. Nach Anregung der Zellen mit dem FACS-Laser (vor allem mit 488 nm Wellenlänge Anregung), diese Zellen emittieren ein Fluoreszenzsignal (hauptsächlich < 640 nm), dass können Überschneidungen mit den Emissions-Spektren des Antikörpers Etiketten17,18. Um dies zu berücksichtigen, sollte ungefärbte Zellen gemessen werden, um festzustellen, die Autofluoreszenz in jedem Kanal. Mit diesem wissen sollten Fluorochromes ausgewählt werden, in denen eine Signalstärke angezeigt, die das Autofluorescent Signal. Diese Autofluorescent Hintergrundsignal sollte bei der Festlegung die gating-Strategie der Bevölkerung berücksichtigt werden. Durch Anwendung dieses Protokolls und intelligente FACS-Panel-Design ist es deshalb möglich, in Tiefe Phänotyp Makrophagen Subtypen. Neue eindeutige AT Makrophagen und deren Funktion charakterisiert werden können.

Adipositas ist gekennzeichnet mit Low-Grade AT Entzündung1 und Infiltration von Pro-inflammatorischen Immunzellen im viszeralen und subkutanen an (MwSt., saß). Ansammlung von Pro-inflammatorischen Immunzellen in den Bottich führt zu einer Insulinresistenz ist ein primärer Risikofaktor für die Entwicklung von Typ-2-Diabetes-2. Immunzellen der angeborenen und der adaptiven Immunsystems befinden sich in der übergewichtige, wie Makrophagen, Mastzellen, Neutrophile, CD4+ und CD8+ T-Zellen und B-Zellen3,4,5,6 ,7. Diese Immunzellen zusammen mit Endothelzellen, stromale Zellen Adipocyte Stammväter, Fibroblasten und Perizyten, bilden die SVF-8 und sind die wichtigste Quelle von Pro-inflammatorischen Substanzen im AT9.
Der Entzündungsstatus AT wird häufig durch Techniken einschließlich Western-Blot10, qPCR11und Immunohistochemistry11untersucht. Jedoch ist bei der Verwendung dieser Techniken, die gesamte AT, Adipozyten und SVF verwendet. Dies macht es schwierig zu bestimmen, die Menge und Teilmengen von Immunzellen in der AT vorhanden. Immunzellen haben verschiedene Zelle Marker zu definieren und zu kategorisieren, wie z. B. Makrophagen. Makrophagen zeigen erhebliche Heterogenität in Funktion und Zelle Oberfläche Marker Ausdruck12. Daher sind sie oft in zwei Populationen von Makrophagen kategorisiert: M1 und M2. M2-Makrophagen nennt man in der Regel Alternativ aktivierten Makrophagen12,13 und befinden sich in der schlanken, metabolisch normale Menschen14. Tritt jedoch bei Übergewicht, ein phänotypische Schalter von M2-Makrophagen, M1 Makrophagen. Diese aktiviert klassisch M1 Makrophagen express CD11C12 und reichern sich um tote Adipozyten, Krone-artige Strukturen13zu bilden. Es hat sich gezeigt, dass CD11C+ Makrophagen in der Insulinwirkung beeinträchtigen und Insulinresistenz bei adipösen Menschen15zugeordnet sind. Immunohistochemistry ist zur Erkennung von M1 und M2-Makrophagen im AT eine Option. Diese Technik bietet Informationen über den Standort von den Makrophagen im Gewebe. Allerdings schränkt es die Anzahl der Markierungen, die in einer Färbung verwendet werden können. Darüber hinaus ist es auch schwierig zu quantifizieren. Um die verschiedenen Immunzellen Teilmengen in der Mehrwertsteuer und sAT Einlagen zu untersuchen, haben wir daher einen Flow Cytometry Ansatz entwickelt. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, mehrere Markierungen pro Zelle mit einem Flow-Zytometrie-Analyse zu Zelle Teilmengen zu definieren und zählen die Anzahl der einzelnen Untergruppen in den AT-Ablagerungen vorhanden.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>5660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)-Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657-1g</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-100</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.06688.0100</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;M syringe Filcons</td><td>BD Biosciences</td><td>340613</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;M filter</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Fc block / human IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14506</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Merck</td><td>1.04003.2500</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV421</td><td>Biolegend</td><td>301324</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>561807</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>CD56-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>562794</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>337218</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>CD19-BV421</td><td>Biolegend</td><td>302234</td><td></td></tr><tr><td>CD3-V500</td><td>BD Biosciences</td><td>561416</td><td></td></tr><tr><td>CD56-APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>641400</td><td></td></tr><tr><td>CD303-PE</td><td>Biolegend</td><td>354204</td><td></td></tr><tr><td>CD141-APC</td><td>Biolegend</td><td>344106</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 v-shape well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>PBS PH 7.4</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>IgG from human serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rat Ig, &amp;kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552844</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ig, &amp;kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>L23102</td><td></td></tr><tr><td>IKA&amp;nbsp;MS 3 basic shaker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z645028-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry

Infiltration von Immunzellen in das subkutane und viszeralen Fettgewebe (AT) Ablagerungen führt zu einer minderwertigen Entzündung einen Beitrag zur Entwicklung der Adipositas-assoziierten Komplikationen wie Typ-2-Diabetes. Um quantitativ und qualitativ die Immunzelle Teilmengen in menschlichen auf Einlagen zu untersuchen, haben wir einen Flow Cytometry Ansatz entwickelt. Die stromale vaskuläre Fraktion (SVF), mit der Immunzellen ist von subkutanem und viszeralem bei Biopsien von Kollagenase Verdauung isoliert. Fettzellen werden nach der Zentrifugierung entfernt. Die SVF-Zellen sind für mehrere Membrane-springen-Marker zur Unterscheidung zwischen Immunzellen Teilmengen ausgewählt und mittels Durchflusszytometrie analysiert gefärbt. Als Ergebnis dieses Ansatzes pro- und antiinflammatorische Makrophagen Teilmengen, dendritische Zellen (DCs), B-Zellen, CD4+ und CD8+ T-Zellen und NK-Zellen erkannt und quantifiziert werden können. Diese Methode gibt detaillierte Informationen über Immunzellen im AT und die Höhe der jeweils spezifischen Teilmenge. Da gibt es zahlreiche fluoreszierende Antikörper zur Verfügung, kann unser Flow Cytometry Ansatz zur Messung der verschiedenen anderen zellulären und intrazellulären Marker von Interesse eingestellt werden.

Die SVF isoliert von der Mehrwertsteuer und saß wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Flow Cytometry Messungen erzeugen Grundstücke zeigen unterschiedliche Zellpopulationen basierend auf zellulärer Marker (Abbildung 1A und 1 b). Zunächst durch Auftragen der Stürmer streuen Breite (FSC-W) und forward Scatter Bereich (FSC-A), Zelle, die Aggregate von weiteren Analyse ausgeschlossen werden können, durch Anspritzung Einzelzellen als niedrige FSC-W. Nächste, live Zellen ausgewählt sind, und Zelltrümmer ist ausgeschlossen durch Anspritzung der Zellen die richtige Größe und Komplexität mit FSC-A und der Seite streuen Bereich (SSC-A), beziehungsweise. Abgestorbenen Zellen sind klein und daher als eine verschiedene Bevölkerung sichtbar mit einem kleinen FSC-A. Nächste, immune Zellen wurden durch Verwendung von Pan-Leukozyten-Marker CD45 (Panel 1 und 2, Abb. 1A) ausgewählt. Um Makrophagen zu analysieren, andere Immunzellen wie die T-Zellen (CD3), B-Zellen (CD19), Neutrophile (CD66b+ CD11b+), und NK-Zellen (CD56) wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen, über verschiedene Antikörper, die gezielt diese Zellen, sondern mit der gleichen Fluorochrom. Weitere Unterteilung der verbleibenden Zellen basierte auf CD11b, CD11c Ausdruck. Dies führte in den folgenden Populationen: CD11b+ CD11c+ Makrophagen, CD11b+ CD11c– Makrophagen und CD11bniedrig /- CD11c+ DCs (FACS Panel 1, Abbildung 1 b). Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) erlaubt die Quantifizierung des Ausdrucks von CD303 (plasmazytoide DC Markierung) und CD141 (DC-Marker), auf CD11b+ CD11c+ Makrophagen und CD11bniedrig /- CD11c+ DCs. Ausdruck dieser beiden Marker waren höher bei CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen bestätigt, dass CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen wurden DCs (Abbildung 1).
Das CD45+ Zellen (Abbildung 1A) wurden in T-Zellen und B-Zellen unterteilt mit CD3 und CD19, beziehungsweise. T-Zellen wurden unterteilt in T-Helferzellen (CD4+) und zytotoxischen T-Zellen (CD8+). Zu guter Letzt CD3–CD19–-Zellen, NK-Zellen mit dem Marker CD56 zu quantifizieren gezeichnet wurden (FACS-Panel 2, Abbildung 1). Die Anzahl der Zellen in jedem Tor wird quantifiziert und kann zur Berechnung des Anteils dieser Zellentyp aller lebenden Zellen (Tabelle 3).
Der Anteil der lebenden Zellen kann berechnet werden, für jedes Fach ermöglicht die Berechnung der durchschnittlich alle Themen in einer Gruppe von zum Beispiel mageres oder übergewichtige Männer zeigt die Fülle an eine bestimmte Immunzellen, d. h., der Pro-inflammatorischen CD11b+ CD11c+ Makrophagen in viszeralen AT (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> Abbildung 1: FACS Anspritzung Strategie des viszeralen Fettgewebes. (A) FACS Handlung aller Ereignisse (schwarz) mit forward Scatter breite Intensität (FSC-W) und forward Scatter Bereich Intensität (FSC-A) mit einem Tor wählen Sie nur einzelne Zellen (rot), gefolgt von einem FACS-Grundstück basierend auf FSC-A und seitliche Streuung Bereich Intensität (SSC-A) enthält eine Auswahl von lebenden Zellen (hellgrün) Tor. Als nächstes Grundstück mit SSC-A und CD45 Fluoreszenzintensität enthält eine Auswahl aller CD45 Tor+ (immun-) Zellen (blau). (B) FACS Grundstück CD19, CD3, CD66b und CD56 Fluoreszenzintensität versus CD11b Fluoreszenzintensität und ein Tor auswählen alle Zellen, die CD19, CD3, CD66b und CD56 negativ sind (braun) für weitere Unterteilung in Populationen. Weitere Unterteilung in die nächste Handlung basierend auf CD11b und CD11c Fluoreszenz-Intensität. Tore werden angezeigt, enthält CD11b+ CD11c+ Makrophagen (dunkelgrün), CD11b+ CD11c– Makrophagen (lila) und CD11bniedrig /- CD11c+ dendritische Zellen (blau). (C) Menge von CD11b+, CD11c+, oder CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen (Y-Achse) ihre Ebenen der Fluoreszenzintensität (X-Achse) für CD303 und CD141 und die entsprechenden Quantifizierung des Mittelwerts anzeigen Fluoreszenzintensität (MFI). (D) FACS Plot zeigt die bisherigen CD45+ Bevölkerung (blau) basierend auf CD3 und CD19 Fluoreszenzintensität mit Toren, die Auswahl von T-Zellen (Magenta), B-Zellen (dunkelgrün) und nicht-Autofluorescent Zellen (grün) negativ für beide CD3 und CD19. Die folgende Handlung basiert auf CD4 und CD8 Fluoreszenz mit Toren Auswahl CD4+ (hellgrün) und CD8+ (Magenta) T-Zellen. Eine identische gating Strategie dient zur subkutanen Fettgewebe. Eine identische gating Strategie dient zur subkutanen Fettgewebe. Diese Zahl wurde von Wouters Et Al. modifiziert 16 <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> Abbildung 2: Fettleibige MwSt enthält mehr Pro-inflammatorischen Makrophagen. Die Höhe der CD11b+ CD11c+ Makrophagen als Prozentsatz aller lebenden Zellen in Bottich von mageren und fettleibigen Menschen präsentiert. Alle Daten sind Mittel ± SEM; n = 20 für Lean und n = 31 für übergewichtige. p ≤ 0,01 vs. Lean. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ziel</td>
			<td>Definition Ziel</td>
			<td>Präsentieren auf</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>myeloische Integrin-marker</td>
			<td>Granulozyten, Monozyten/Makrophagen, dendritische Zellengering und natürliche Killerzellen</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>gemeinsame B-Zell-antigen</td>
			<td>B-Zell-Entwicklung von Pro-B-Zell bis Blastoid B-Zellen und B Plasmazelle</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>gemeinsamen T-Zell-antigen</td>
			<td>Thymozyten, T-Lymphozyten und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>Mitglied der carcinoembryonales Antigen (CEA)-wie Glykoprotein-Familie</td>
			<td>Granulozyten</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>stark glykosylierten Adhäsion protein</td>
			<td>natürliche Killerzellen und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>Typ II transmembranen glycoprotein</td>
			<td>plasmazytoide dendritische Zellen</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>201A</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>thrombomodulin</td>
			<td>Monozyten/Makrophagenniedrig, Subpopulation von dendritischen Zellen</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>Typ I transmembranen Glycoprotein; Integrin αx</td>
			<td>Monozyten/Makrophagen, dendritischen Zellen, Granulozyten, natürliche Killerzellen, Teilmenge von B und T-Zellen</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>gemeinsamen Leukozyten-antigen</td>
			<td>alle menschlichen Leukozyten, Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Eosinophilen und Thymozyten einschließlich</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS-Puffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Antikörper für cocktail FACS pAnel 1, Teilmengen von Makrophagen und dendritischen Zellen Populationen zu identifizieren. Menge des Antikörpers beschrieben ist für die Analyse einer Probe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ziel</td>
			<td>Definition Ziel</td>
			<td>Präsentieren auf</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>gemeinsame B-Zell-antigen</td>
			<td>B-Zell-Entwicklung von Pro-B-Zell bis Blastoid B-Zellen und B Plasmazelle</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>gemeinsamen T-Zell-antigen</td>
			<td>Thymozyten, T-Lymphozyten und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>stark glykosylierten Adhäsion protein</td>
			<td>natürliche Killerzellen und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>IG-Superfamilie, Typ I transmembranen Glycoprotein</td>
			<td>T-Helfer-Zell, Thymozyten, Monozyten/Makrophagen, Typ II natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>RPA-T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Α-Untereinheit eines Disulfid-linked bimolekulare komplexes</td>
			<td>zytotoxischen T-Zellen, Thymozyten, Teilmenge der natürlichen Killerzellen</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>gemeinsamen Leukozyten-antigen</td>
			<td>alle menschlichen Leukozyten, Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Eosinophilen und Thymozyten einschließlich</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS-Puffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Antikörper für cocktail FACS Panel 2, T und B-Zell-Populationen zu identifizieren. Menge des Antikörpers beschrieben ist für die Analyse einer Probe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Makrophagen-panel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Angussbezeichnung</td>
			<td># Zellen</td>
			<td>% der live</td>
		</tr>
<tr>
<td>Einzelne Zellen</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Leben</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dump–
</td>
			<td>771</td>
			<td>7.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C– CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11Bniedrig /-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0,14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T-Zellen, B-Zellen, NK-Zell-panel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Angussbezeichnung</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>% der live</td>
		</tr>
<tr>
<td>Einzelne Zellen</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Leben</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK-Zellen</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25,56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>601</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0,54</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Immunzelle Fülle verschiedener Zelltypen der Mehrwertsteuer. Anzahl der Zellen in jedem Tor und der Prozentsatz der verschiedenen Zelltypen bezogen auf die Gesamtmenge von lebenden Zellen.

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Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Immunzelle Inhalt des Fettgewebes durch Isolierung der Immunzellen aus Fettgewebe und anschließende Analyse mit Durchflusszytometrie zu analysieren.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Isolation von Fettgewebe Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten<em&gt; In-vitro-</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Biotechnik

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

Durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung der angeborenen und adaptiven Immunzellen der murinen Lunge

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Medizin

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...