Name: measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts
Uploaded: 2018-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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Diese Forschung wurde von der National Science Foundation Award Anzahl 1237969, "Entwirren der Heterozygotie, allelische Zusammensetzung und Copy Number Variation der Kartoffel" finanziert und USDA spezielle Grant 2014-34141-22266 (University of Maine), RV

Hinweis: Es ist wichtig, entsprechende Kontrollen umfassen in der Regel in Form von Blattgewebe der gleichen Diploidie als experimentellen Proben. Und zwar deshalb, weil die 2C-Höhepunkt der Knolle Proben klein und schwer zu erkennen sein kann.
1. Vorbereitungen
Hinweis: Die hier aufgeführten Lösungen können vor der Zeit vorbereitet und bei 4 ° C gelagert, sondern denen, die in den nachfolgenden Schritten vorgestellt müssen frisch zubereitet werden am Tag der Nutzung.
<ol><li>Einem entsprechenden Volumen der Plasmolyse Inkubation Lösung (PIS) zu machen (15 mL/Probe): 0,55 M Mannit, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-Puffer pH 7,5 (mit HCl eingestellt).</li>
	<li>Einem entsprechenden Volumen der Plasmolyse Wash Lösung (PWS) zu machen (15 mL/Probe) identisch mit PIS mit Ausnahme der Zusatz von 0,71 M Mannit.</li>
	<li>250 mL von modifizierten Galbraith Flow Cytometry Puffer11 (FCB) zu machen: 13,6 mM Natriumcitrat (Trinatrium), 8 mM MOPS, 18 mM MgCl2, 0,4 % V/V Triton x-100. Rühren Sie für mindestens 30 min, die Triton x-100 zu verteilen.</li>
	<li>Filter zu sterilisieren PIS und PWS Lösungen mit 0,22 µm asymmetrische Polyethersulfone (Affen) Filter. Verwenden Sie Vakuumfiltration angetriebene Einheiten.</li>
	<li>
106 µm-Netz-Filter für lysierten Protoplasten vorzubereiten. Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, die direkt ins Röhrchen, verschachtelt werden können, jedoch Methode, Suspensionen durch einen 106 µm-Filter benutzt werden kann. Hinweis: Diese müssen nicht steril sein.<ol>
<li>Wenn Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL, schneiden Sie 1 cm vor der Spitze jeder Microcentrifuge Schlauch ab. Mit einer Heizplatte oder andere Wärme Quelle Wärme ein 1 cm2 Stück 106 µm Stahl Masche auf ein Stück Alufolie. Drücken Sie das abgeschnittene Ende des Rohres in das Netz, bis sie verschmolzen haben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie Kartoffeln zu untersuchenden, alle Böden und Schmutz zu entfernen. Hinweis: Knolle Größe und Alter für die Ziele des Experiments soll aber offenbar nicht auf die Qualität der Ergebnisse. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich auf Knollen angewandt im Kühlhaus (4 ° C, 95 % RH) bis zu 8 Monaten gewesen. Zwar Knollen mit defekten (z.B. Knolle Ende Rot, hohle Herz Braun nekrotischen Bereiche) reagiert werden können, sollten sie, wenn möglich vermieden werden.</li>
</ol>2. Tag 1: Plasmolyze Knolle Gewebe
Hinweis: Kontrolle Blattproben können hier aufgenommen werden, um Protoplasten zu produzieren oder im Schritt 5.2 Wenn rohe Zubereitungen bevorzugt werden. Dies muss mit sterilen Werkzeugen in eine aseptische Umgebung wie einem Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
<ol><li>Oberfläche zu sterilisieren Kartoffelknollen über eintauchen in 75 % Ethanol mindestens 5 min lang.</li>
	<li>Entfernen Sie Knollen aus Ethanol und an der Luft trocknen. Dies dauert in der Regel ca. 5 min, länger, wenn die Knolle größer als 100 g ist.</li>
	<li>Vorbereiten und Label steril 50 mL konische Röhrchen für jede Probe und aliquoten 15 mL des Filters sterilisiert PIS in jedem.</li>
	<li>
Probieren Sie etwa 1 cm3 das gewünschte Gewebe von sterilisierten Knollen mit sterilisierten Skalpell oder Kork Borer. Hinweis: Je nach Gewebe entnommen werden kann man entweder eine sterilisierte Korken Borer oder Messer/Skalpell verwenden. Zum Beispiel wenn das Mark gewünscht wird Kork Borer kann verwendet werden, um einen Kern aus der apikalen zum distalen Ende der Knolle nehmen und der zentrale Teil des Kerns abgetastet werden kann. Aufgrund der asymmetrischen internen Morphologie der Kartoffelknollen, es kann jedoch genauer, Probe Parenchym oder Kortex durch Halbierung der Knolle und das gewünschte Gewebe besteuert. Siehe Abbildung 1 für eine Darstellung der internen Knolle Morphologie.<ol>
<li>Grob hacken Sie Gewebe mit einem sterilen Skalpell in ca. 3 mm3 Stück und Transfer Gewebe, konische Rohr mit PIS. Über Nacht bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Dies ist, um die Fläche zu maximieren, um die PIS und später der Enzymlösung können vollständig durchdringen das Gewebe, was zu vollständiger Verdauung.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> Abbildung 1: interne Morphologie eine Kartoffelknolle. Die Trennung zwischen Mark (P) und Perimedullary Parenchym (PM) ist mit schwarzen Linien dargestellt. Gefäßbündelring, trennt Parenchym aus dem Kortex (C) wird mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Die Ausläufer Ende (S) und die Knolle Augen (E) sind auch gekennzeichnet. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
3. Tag 2: Kartoffel Protoplasten generieren
Hinweis: Dies muss mit sterilen Werkzeugen in eine aseptische Umgebung wie einem Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
<ol><li>Vorbereiten und Filtern (0,45 µm Affen Filter) eine entsprechende Menge des Enzyms Lösung (ES) (10 mL/Probe): 0,71 M Mannit, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 % Onozuka R-10 Cellulase, 0,8 % Macerozyme r-10, 1 % Hemicululase, 10 mM-MES-Puffer, pH 5.8. Stellen Sie sicher, dass entsprechende Filter in diesem Schritt verwendet werden; Filter mit Porengröße kleiner als 0,45 µm sind anfällig für Verstopfung während eine low-Protein Bindung Membran, wie Affen, Verlust des Enzyms während der Filtration minimiert.</li>
	<li>Aspirieren von PIS von Proben in konischen Rohren mit einer sterilen serologische Pipette.</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL ES jede Probe und umkehren 2 – 3 Mal.</li>
	<li>Inkubieren Sie Proben über Nacht bei 29 ° C mit 180 u/min horizontale schütteln. Inkubieren Sie Proben für mindestens 16 h.</li>
</ol>4. Tag 3: Ernte Protoplasten und waschen Protoplasten
Hinweis: Aseptische Bedingungen sind zu diesem Zeitpunkt nicht mehr nötig.
<ol><li>Shaker entnehmen Sie Proben und es ermöglichen Sie ihnen, für ca. 10 min zu begleichen.</li>
	<li>
Aspirieren Sie aus so viel ES Lösung wie möglich.
	<ol>
<li>So viel ES Lösung wie möglich mit einer serologischen Pipette, kümmert sich um zu vermeiden, entfernen das verdaute Gewebe entfernen.</li>
		<li>Mit einer Mikropipette entfernen vermeiden jede restliche ES Lösung wieder das verdaute Gewebe. Dies geschieht am einfachsten durch die Röhre schräg halten, so dass ES Lösung in Richtung der Deckel fließt, während die verdaute Gewebe an der Unterseite bleibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jede Probe 15 mL PWS hinzu und invertieren sanft 2 – 3 Mal. Lassen Sie Protoplasten für 10 min vereinbaren.</li>
	<li>Entfernen Sie PWS mit einer serologischen Pipette. Verwenden einer Mikropipette um jede restliche Flüssigkeit zu entfernen. Hinweis: Dieser Schritt ist absolut entscheidend für die Integrität der Probe Kerne während Durchflusszytometrie zu gewährleisten. Bei der Fehlersuche, dieser Schritt erwies sich die wahrscheinlichste Ursache des Fehlers in einer Probe.</li>
</ol>5. Tag 3: Durchflusszytometrie Proben vorbereiten.
Hinweis: Die Proben sollten auf dem Eis von hier gehalten werden auf sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>Bereiten Sie Propidium Jodid (0,4 mg Propidium Jodid/mL FCB) und RNase-Lösungen (0,8 mg RNase A / mL FCB) durch Auflösen in FCB. Achtung: Propidium Jodid ist hochgiftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut oder Augen. Tragen Sie geeignete PSA.</li>
	<li>
Fügen Sie 1,5 mL Eis kalt FCB zu jeder Probe. Kurz schütteln oder Vortex jede Probe zu brechen aggregiert Gewebe. Es ist wichtig, die Klumpen der Knolle Gewebe brechen, so dass das FCB kann vollständig die Zellen durchdringen und lassen Sie die Kerne. Verschiedene Proben erfordern mehr oder weniger Unruhe je nach Gewebe und Genotyp. Hinweis: Das FCB lyses der Protoplasten Freigabe der Kerne. Daher Proben die Notwendigkeit des Haltens auf Eis zum Abbau zu verhindern.<ol>
<li>Wenn Flow Cytometry Kontrollproben nicht Bestandteil der Protoplasten Generation Schritt waren kann sie hier enthalten. Wenn ein Steuerelement hinzugefügt werden soll, fein hacken ein kleines Blatt (~ 3 cm2) in 1,5 mL Eis kalt FCB mit einer Rasierklinge. Kontrollproben sollten die gleichen Diploidie als die experimentellen Proben, vorzugsweise die gleichen Genotyp. In-vitro- Pflänzchen sind in der Regel sauberer Gipfel als Gewächshaus oder Freiland Pflanzen geben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ein Siebfilter 106 µm durchlaufen Sie 1 mL der Suspension FCB/Gewebe. Verwenden Sie einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit der Spitze abgeschnitten und Metallgewebe geschmolzen nach unten wie in Schritt 1.5.1 beschrieben. Microcentrifuge Schlauch kann direkt in ein 2 mL Microcentrifuge Schlauch verschachtelt sein und die Probe direkt durchlaufen. Wenn Sie eine andere Methode der Filtration zu verwenden, kann das Filtrat gesammelt in eine eiskalte Petri-Platte und überspielt eine 2 mL-Tube. Hinweis: Manchmal können die restlichen Aggregate und Zelltrümmer den Siebfilter verstopfen. In diesem Fall tippen Sie einfach die zwei verschachtelte Mikrozentrifugenröhrchen ein paar Mal, die Trümmer zu verdrängen.</li>
	<li>Jede Probe 250 µL RNase-Lösung hinzufügen. Umkehren Sie und inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Hinweis: Dieser Schritt soll RNA aus Proben, was zu weniger Lärm während der Durchflusszytometrie zu entfernen. Da die Kerne nur von kurzer Dauer sind, können jedoch Forscher beschließen, verringern die Inkubationszeit oder auf Eis durchführen, wenn sie schwere Beeinträchtigung ihrer Proben erleben.</li>
	<li>Jede Probe 125 µL Propidium Jodid Lösung hinzufügen. Umkehren Sie und inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Hinweis: Proben sollte verwendet werden, für die Durchflusszytometrie so bald wie möglich, wie Abbau innerhalb von 2 h, sogar auf Eis hervorgeht.</li>
</ol>6. Tag 3: Durchflusszytometrie Kartoffel Knolle Kerne
Hinweis: Flow Cytometer-Betrieb und Software variiert je nach Gerät und Hersteller. Ausführliche Beschreibung der jeweiligen Operation das Durchflusszytometer erhalten Sie im Benutzerhandbuch des Geräts.
<ol><li>Erstellen Sie zwei Punkt plottet mit logarithmischen Skala von forward Scatter vs. Side Scatter und Propidium Jodid (PI) Vs Seite streuen. Außerdem erstellen Sie ein Histogramm mit PI auf der x-Achse. Logarithmischen Skala ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Ereignisse im Maßstab sind, da Kerne Fluoreszenz erheblich abweichen können.</li>
	<li>
Laden Sie einen bekannten Steuerelement Probenröhrchen und stellen Sie die Spannung so ein, dass alle Ereignisse im Maßstab sind. Wir verwenden in-vitro-Blattgewebe aus einer Probe-Genotyp. Wenn Proben von verschiedenen Ploidies ausgeführt werden sollen, sollten eine Kontrollprobe für jede einbezogen werden.
	<ol>
<li>Notieren Sie sich den Kanal 2C Peak in der Kontrollprobe. Die 2C-Gipfel der experimentellen Proben sollten am selben Ort fallen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden Sie eine experimentelle (Knolle) Probe zu und wieder zu gewährleisten Sie, dass alle Ereignisse im Maßstab. Wenn Anpassungen erforderlich, wiederholen Sie sind Gipfeln Schritt 6.2, den Kanal 2 c zu identifizieren.</li>
	<li>Tor, manuell die Protoplasten Kerne mit der Seite Vs PI Streudiagramm.</li>
	<li>Legen Sie das PI-Histogramm, um nur die gated Protoplasten Kerne Region zeigen.</li>
	<li>Sammeln Sie die gewünschte Anzahl der Ereignisse von jeder Probe. Häufig verwenden die Forscher 10.000 geschlossene Veranstaltungen für Durchflusszytometrie; aber wir 2.000 Veranstaltungen für Knolle Protoplasten Proben verwenden, um Platz für weitere Proben und Muster mit niedrigen Konzentrationen.</li>
	<li>Berechnen Sie jede Probe EI aus den PI-Histogrammen anhand der folgenden Formel: EI =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> 4C der Prozentsatz der Kerne ist die 4 C (entspricht einer Runde Endoreduplikation), ist 8 C der Prozentsatz die 8C, und so weiter. Siehe Abbildung 4 Beispiele für Histogramme und C-Werte der Gipfel.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Das Protokoll enthaltenen sieht, dass Forscher mit einem Mittel zur Beurteilung Endoreduplikation innerhalb von Kartoffelknollen, deren modifizierte Mobilfunk Inhalte und erhöhte Zellengröße scheinbar anderen Flow Cytometry Präparaten entgegen. Das Protokoll stützt sich auf Protoplasten Generation als ein Mittel zur Reduzierung von Lärm und Schmutz, wobei nuklearen Integrität. Zuvor, Forscher haben ähnliche Vorbereitungen für besonders widerspenstigen Flow Cytometry Proben beschrieben sowie Knolle Protoplasten zur Untersuchung einer Vielzahl von Themen wie Pathogenese19,20genutzt. Nach unserem Kenntnisstand haben keine jedoch die Verwendung von solchen Knolle Protoplasten mit Durchflusszytometrie zum Zweck des Studiums Endoreduplikation kombiniert. Darüber hinaus fanden wir die Verwendung von Protoplasten zuverlässiger als typische grobe Vorbereitungen sowie die Technik in den beiden nur andere Studien zur Beurteilung der Knolle Endoreduplikation6,7genutzt werden. Hier besprechen wir die Mängel des Protokolls, potenzielle Fallstricke in seiner Ausführung und Probe Vorbereitung und Ergebnisse von einem typischen Experiment, das sie beschäftigt.
Trotz der Dienstprogramm und Wiederholbarkeit des Protokolls Knolle Flow Cytometry hat es ein paar Schwächen, die diskutiert werden sollte. Um zu beginnen, ist das Protokoll zeitintensiv, zwei Übernachtungen Inkubationen erfordern. Darüber hinaus erfordert das Protokoll einige teuren Reagenzien, insbesondere die Cellulasen und Macerozyme. Darüber hinaus sind die Vorbereitungen sehr zeitkritische, erniedrigende innerhalb weniger Stunden, die wodurch Durchsatz innerhalb eines einzigen Tages eingeschränkt werden kann, vor allem, wenn viele Veranstaltungen gewünscht werden. Zu guter Letzt ist das Protokoll, während zuverlässig, empfindlich auf Fehler im Rahmen der Probenvorbereitung, die alle scheinen die Kerne und niedriger Qualitätsergebnisse zu Schäden führen. Beispielsweise kann mikrobieller Kontamination während der Plasmolyse und Protoplasten Generation Schritte (1 – 3,4) durch unsachgemäße aseptische Technik auftreten. Probe Verunreinigungen, während den Erfolg einer Probe nicht immer auszuschließen scheint, Qualität der erhaltenen Histogramme, wieder wahrscheinlich wegen Schäden an den Kernen drastisch zu verringern.
Wie bereits erwähnt sind die größten Nachteile des Protokolls Kosten, Zeit und Empfindlichkeit zu Fehlern. Forscher sollten Maßnahmen ergreifen, um diese zu mildern. Da Kosten Forscher, die beabsichtigen, die Anwendung des Protokolls zu viele Proben können prüfen, ändern die Enzymkonzentrationen und/oder die Dauer der Verdauung Schritt als verschiedene Gewebe und Genotypen variieren in Reaktionsfähigkeit. Dies beinhaltet die Möglichkeit der Filterung und recycling der ES die bisher aber nicht nachgewiesen wurde hier21eingesetzt. Für die Zeit, in unserer Beobachtung ist es möglich, mit der ersten Inkubation (Plasmolyse Schritt) zu verzichten und noch extrahieren Protoplasten; jedoch werden ihre Integrität und Fülle leiden, das wirkt sich negativ auf Ergebnisse. Um die Verschlechterung der Proben zu verringern sollten Forscher, dass einige Flow Cytometry Ansätze die Verwendung von Fixiermittel (z.B. Formaldehyd beinhalten), Probe Integrität22zu bewahren. Dies ist möglicherweise ein nützliches Mittel sowohl Verschlechterung zu verhindern und eine Probe Speicher anstatt Protoplasten Eintreibungskosten und Flow Cytometry Auftritt am selben Tag wie präsentiert erlauben. Ein weiteres Mittel zur Verhinderung der Abrieb der Kerne möglicherweise einen Nuklease-Hemmer ES und/oder FBC gehören; während 2-Mercaptoethanol keine spürbaren Veränderungen während der Entwicklung erfolgen, haben andere Inhibitoren hierin nicht getestet.
In unserer Beobachtung ist der kritischste Schritt Schritt 4.4, die Entfernung von allen Plasmolyse Waschlösung vor der Zugabe des Puffers Flow Cytometry (FCB). Wenn auch ein kleines Volumen (< 10 µL) bleibt, die Proben sind viel eher abgebaut werden, die auf eine schlechte oder sogar fehlerhafte Stichprobe führen können. Dies ist wahrscheinlich auf Verunreinigungen innerhalb der Enzymlösung (z.B. Nukleasen, Proteasen)23,24 , die schnell die Kerne während der Inkubationszeit und Zeit zwischen Probe läuft, auch bei geringen Konzentrationen beeinträchtigen. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Dauer der Inkubation PI und RNase Schritte. Wie im Protokoll erwähnt, bleiben die Proben nicht stabil für mehr als ein paar Stunden nach Zugabe der FCB so Forscher entscheiden können, die diese Schritte, um Platz für weitere Proben oder langwierige Durchflusszytometrie kürzen läuft aus niedrigen Kerne Konzentrationen. Dies erfordert auch den Forscher zu prüfen, einen Kompromiss zwischen der Anzahl der Ereignisse pro Probe und Gesamtzahl der Proben ausgeführt werden oder die Verwendung von Fixiermittel wie bereits erwähnt in Betracht ziehen.
Unterschiede zwischen Gewebe und Genotypen
Um Ergebnisse Vertreter des Protokolls zu bieten haben wir zwei einfache Experimente bestätigen bereits berichtet Variation von Gewebe und untersuchen den Einfluss der Diploidie und Genotyp entwickelt. Die Ergebnisse des Experiments Gewebe zeigen, dass das Protokoll reproduzierbare Ergebnisse liefert, wie Mark Gewebe wieder gefunden wurde, um die höchste EI zu haben. Etwas überraschend Parenchym Gewebe, das nicht zuvor bewertet hatte einen EI-Wert vergleichbar mit kortikalen Gewebe und deutlich niedriger als Mark. Dies war unerwartet, wie Parenchymzellen zumindest am Ende der Laufzeit in der Regel größer als entweder Mark oder kortikale Zellen sind. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Knollen (90-130 g) zu unreif für die Parenchymzellen, die am Ende der Laufzeit voll ausgebaut und erreicht ihre maximale C-Werte25haben die Mehrheit der Knolle Volumen umfassen. Dies könnte auch erklären, warum die Dihaploid (VT_SUP_19) und die doppelte Dihaploid (VT_SUP_19 4 X) zeigte deutlich mehr EI als CV Superior Knollen; Während jeder Genotyp Knollen etwa gleichgroßen entnommen wurden, ist die maximale Größe der Knollen von VT_SUP_19 oder der isogenen tetraploiden viel kleiner als der der Stammvater. So kann es sein, dass sie größere EI einfach angezeigt weil sie größer im Vergleich zu ihrer Maximalgröße erreichbar waren. Alternativ kann der Unterschied eine Folge der genetischen Ergänzung sein erhielt VT_SUP_19 von seiner tetraploiden Stammvater. Eine andere Möglichkeit ist, dass die genomische Reduktion, die Gewinnung von der Dihaploid aus der tetraploiden aufgetreten entlarvt schädlichen Allele was anlagenweite Stress, das auch gezeigt worden kann, hat um zu erhöhten EI26beitragen. Allerdings zeigt dies, dass die sorgfältige Prüfung Forscher beschäftigen müssen, bei der Auswahl der Knollen und Gewebe für den Vergleich von EI-Werte, vor allem zwischen Genotypen verwendet werden.
Zukünftige Anwendungen
Das Protokoll in diesem Artikel beschriebenen bietet Forschern ein wichtiges Instrument für Verständnis Endoreduplikation in Kartoffel. Es kann für Studien in der genetischen und ökologischen Komponenten der Endoreduplikation, den zeitlichen Verlauf der Entwicklung über Knolle Gewebe und Bewertung der natürlichen Variation erlauben. Letztlich kann Endoreduplikation ein viel versprechendes Ziel zur Verbesserung der Kartoffel, ein Unternehmen machen, erfordern eine zuverlässige Mittel zur Bewertung.

Endoreduplikation ist der Prozess, durch den eine Zelle verzichtet auf die typischen Zellzyklus und stattdessen einen alternativen Verlauf der Entwicklung bestehend aus wiederholten Runden der DNA-Replikation ohne Zellteilung erfährt. Die daraus resultierenden Zelle DNA erhöht haben Inhalte und nukleare Größe, die vermutlich eine Rolle bei der zellulären Verordnung, Expansion und Spezialisierung. In der Regel ist eine Runde Endoreduplikation (genannt einen Endocycle) und der entsprechende Anstieg der DNA-Gehalt größer Zellvolumen zugeordnet sind, eine Beobachtung, die die "karyoplasmic Theorie", die DNA-Gehalt erhöht ausgefällt, ordnungsgemäß erforderlich eine größere, vielleicht mehr komplex, Zelle1zu regulieren. Dieses Phänomen ist häufig in höheren Pflanzen, die in einer Reihe von Geweben, einschließlich derjenigen mit Struktur-/defensives (Trichomen)2,3, beobachtet nutritive (Mais Endosperm)4,5, und Spüle/Lagerung ( Tomaten Perikarp; Kartoffelknolle)6,7,8 Funktionen. In Obst wurde vermutet, dass diese Endoreduplikation spielt eine Rolle in die rasche Expansion der Samenschale zu erleichtern, wie die negative Beziehung zwischen Endoreduplikation und Obst Entwicklungs-Periode9belegt. Zum Beispiel Zellen mit DNA Inhalt bis zu 512C (512 Mal die haploiden Genom) in der Tomate Perikarp8eingehalten worden. Im übrigen Chevalier Et Al. (2014) gezeigt, dass Veränderungen in der Expression von Genen Zellzyklus zu einem Anstieg der Endoreduplikation Ebenen innerhalb der Samenschale wodurch dann größere Früchte10führen können. Veränderung der Gene, die Förderung der Endoreduplikation bietet somit, ein potenzielles Ziel für die Verbesserung der Biomasse oder Ertrag durch Pflanzenzucht oder Genmanipulation. Eine solche Verbesserung ist jedoch abhängig von der besseren Verständnis der Ursachen und folgen der Endoreduplikation.
Endoreduplikation ist in den meisten Fällen über Durchflusszytometrie gemessen wobei Kerne, veröffentlicht in grobe Gewebe Vorbereitungen11, mit einem DNA-Bindung Fluorophor, z. B. Propidium Jodid12 (PI) inkubiert werden. Die gefilterten Proben werden dann durch den Laser ein Durchflusszytometer übergeben, wo Emission Wellenlängen spezifisch für das Fluorophor beobachtet werden können. Die Intensität der Fluoreszenz in jedem Ereignis (z.B. Zellkern) korreliert direkt mit der DNA-Gehalt des Teilchens. So kann durch den Vergleich zu einem bekannten Standard, der relativen und absoluten DNA-Gehalt der Zellen in einer Probe berechnet werden. Endoreduplikation Indizes (EI) werden bestimmt durch die Gründung der durchschnittlichen Anzahl der Endocycles pro Zelle innerhalb einer Probe durch die Beobachtung der zellulären DNA-Gehalt (C-Wert) wo befindet sich 1 C der DNA-Gehalt einer haploiden Zelle (Formel in Schritt 6,7 des Protokolls). Zum Beispiel ist der Basis DNA-Gehalt der somatischen Zellen in einem diploiden Organismus 2 C. Wenn eine Probe einige Zellen mit 4 C hat, entsprechend einer Runde Endoreduplikation oder größer ein EI in der Nähe von 0 müsste; Allerdings sind fast alle Zellen 4 C wäre die EI etwa 1. Als mehrfache Umläufe der Endoreduplikation in höheren Pflanzen Beobachtungswerte EI häufig können jedoch viel größer sein. Bei der Berechnung der Endoreduplikation Indizes kann relativ einfach, es erfordert, dass die relativen Häufigkeiten der Kerne werden C-Werte zuverlässig festgestellt werden, die unter bestimmten Arten und Geweben (einschließlich Kartoffelknollen) ausgeschlossen ist. Es ist wahrscheinlich, dass Unterschiede in zelluläre Anatomie, Chemie oder Zellwand Zusammensetzung13 verursachen diese Proben werden widerspenstigen zu den typischen Vorbereitungen mit einer Rasierklinge, die Kerne direkt in entsprechende Puffer freizugeben, die häufig verwendet werden ein Modell für Endoreduplikation Studien mit Geweben wie Tomate Perikarp8.
In der Kartoffel bleibt die Prüfung der Endoreduplikation innerhalb der Knolle beschränkt sich auf nur ein paar Studien, vielleicht zum Teil auf einen Mangel an ein zuverlässiges Protokoll, wie die oben genannten rohen Vorbereitungen inkonsistente Ergebnissen führen. Während solche Ansätze auch für Blätter die Knolle Proben erleben Sie schwere Abbau und eine Fülle von Lärm in Form von Schutt arbeiten, Differenzierung der Gipfel bestehend aus Kernen mit unterschiedlichen C-Werte fast unmöglich machen. Dies ist möglicherweise aufgrund von Unterschieden in zelluläre Zusammensetzung und eine Fülle von Zelltrümmer in Knolle Zellen (zB. Stärke speichern Amyloplasten). Um diese Hürde zu überwinden, haben wir vor kurzem ein zuverlässiger Protokoll für den Erwerb der unterscheidbaren Gipfel Durchflusszytometrie der Kartoffelknollen entwickelt. Die Frequenz der Zellen innerhalb jeder Gipfel kann dann verwendet werden, für die Berechnung der genauen Endoreduplikation gestaffelt nach verschiedenen Genotypen oder verschiedene Gewebe, aus die eine Knolle besteht. Das Protokoll, das eine modifizierte Protoplasten Extraktion Methode14,15 Antezedens beschäftigt beschriebenen Flow Cytometry11, zeigte erhebliche Unterschiede innerhalb der Kartoffel Verwandten, Sorten und Gewebe16 . Hier stellen wir das Protokoll im Detail durch die Auswertung EI im Kontext der Diploidie, Gewebe und Knolle Größe.

<table><tbody><tr><td>Serological pipette</td><td>Fisher</td><td>13-676-10k</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP (autopipettor)</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes (50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td><td>Globe Scientific</td><td>111558</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td><td>Globe Scientific</td><td>111552</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filtration unit (0.22 &amp;micro;m)(aPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>564-0020</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>Vacuum filtration unit (0.45 &amp;micro;m)(aPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>Cellulase &quot;Onozuka R-10&quot;</td><td>Yakult</td><td></td><td>contact company</td></tr><tr><td>Macerozyme &quot;Onozuka R-10&quot;</td><td>Yakult</td><td></td><td>contact company</td></tr><tr><td>Hemicellulase</td><td>Sigma</td><td>H2125</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>Acros Organics</td><td>172590250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biochemicals</td><td>194854</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (hexahydrate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M35-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (dihydrate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Acros Organics</td><td>423922500</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Acros Organics</td><td>17263-0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>For flow cytometry preparations</td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td>For flow cytometry preparations</td></tr><tr><td>Cork borers with punch</td><td>American Scientific</td><td>2093-02</td><td>For sampling desired tissue</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16-31</td><td>For smapling desired tissue</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-920B</td><td>For smapling desired tissue</td></tr><tr><td>106 &amp;micro;m stainless steel mesh or other seive of same pore size</td><td>New Jersey Wire Mesh Co.</td><td></td><td>contact company</td></tr></tbody></table>

measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts

Endoreduplikation, die Replikation von einer Zelle Kerngenom ohne anschließende Zytokinese ergibt Zellen mit erhöhten DNA-Gehalt und ist verbunden mit Spezialisierung, Entwicklung und Steigerung in zellulären Größe. In Pflanzen scheint Endoreduplikation das Wachstum und die Expansion von bestimmten Geweben und Organen zu erleichtern. Unter ihnen ist die Knolle der Kartoffel (Solanum Tuberosum), die erhebliche zellulären Erweiterung bei der Erfüllung ihrer Funktion der Kohlenhydratspeicher erfährt. So kann Endoreduplikation spielen eine wichtige Rolle in wie Knollen in der Lage sind, diese Fülle von Kohlenstoff aufnehmen. Jedoch schließt die Zelltrümmer aus Rohöl nuklearen Isolationsmethoden Knollen, Methoden, die mit Blättern, effektiv genutzt werden können die Schätzung der Knolle Endoreduplikation Index (EI). Dieser Artikel stellt eine Technik für die Beurteilung der Knolle Endoreduplikation durch die Isolation von Protoplasten während zeigen repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen Genotypen und Knolle Gewebe unterteilte. Die wesentlichen Einschränkungen des Protokolls sind die Zeit und Reagenz für die Probenvorbereitung sowie relativ kurze Lebensdauer von Proben nach lyse der Protoplasten erforderlich. Während das Protokoll für technische Variation empfindlich ist, stellt eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden der nuklearen losgelöst von diesen großen spezialisierten Zellen dar. Möglichkeiten für Verbesserungen des Protokolls wie recycling-Enzym, die Verwendung von Fixiermittel und andere Veränderungen werden vorgeschlagen.

Produktion von Protoplasten
Die Erzeugung von Protoplasten ist für wiederholbare Flow Cytometry Ergebnis von Kartoffelknollen, erforderlich die allgemeine Morphologie der in Abbildung 1angezeigt wird. Forscher können um sicherzustellen, dass hochwertige Protoplasten vor der Zugabe von FCP, produziert worden sind, vor allem die Problembehandlung erforderlich ist. Der Großteil der Protoplasten soll kugelförmig mit minimalen Vorsprünge (Abbildung 2) und kann sehr unterschiedlich in Größe, die vielleicht reflektierende Unterschiede im EI ist.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> Abbildung 2: repräsentative Blatt und Knolle Protoplasten erworbene Schritt 4.4 des Protokolls. Isolierte Protoplasten sein sphärische und symmetrisch mit Plasmamembran intakt. Beachten Sie den Größenunterschied zwischen Blatt (A-C) und Knolle (D, E) Protoplasten sowie die Größenunterschiede innerhalb eines Gewebes, das verschiedene Ebenen der Endoreduplikation hinweisen können. Blatt-Protoplasten enthalten Chloroplasten Amyloplasten innerhalb der Knolle Protoplasten sichtbar sind. Skalieren von Balken = 1.000 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Flow Cytometry Ergebnisauswertung
Der Erfolg oder Misserfolg eines Experiments kann von der Breite des Peaks und ihrer Trennung im Flow Cytometry Histogramme gemessen werden. Da Mess Endoreduplikation Berechnung relative Häufigkeit der Kerne in jede Spitze erfordert, ist bloße Anwesenheit oder Abwesenheit von Gipfeln unzureichend, wenn es zu viel Lärm gibt, sinnvolle Grenzen zwischen ihnen zu ziehen. Abbildung 3 zeigt die Variation in den Ergebnissen, die Forscher in den Flow Cytometry Streudiagrammen und Histogramme antreffen können. Mögliche Ursachen für fehlgeschlagene Proben werden in der Diskussion vorgestellt.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> Abbildung 3: repräsentative Ergebnisse aus Durchflusszytometrie Protoplasten Kerne der intakt und Mark Proben degradiert. Intakte Kerne (A) zeigen die saubere Trennung zwischen Gipfeln, relative Häufigkeit von Zellen in jeder mit der entsprechenden Software, während Gipfeln in degradierten Proben (B) verschobene, Breite und überlappende Basen zeigen zu quantifizieren. In der Scatterplots intakt (C) und degradierten (D) Proben deuten Blackboxes nuklearen Ereignis gating für Histogramme und die Häufung von Ereignissen in der Breite der Histogramm-Gipfel reflektiert wird. Ereignisse vor den Toren geben Schutt, stark degradierten Zellkerne oder andere Aggregate. PI-H entspricht der Intensität der Fluoreszenz, die in beliebigen Einheiten gemessen wird. Methoden zur Problembehandlung zum Beispiel Abbau zu verhindern werden innerhalb des Textes besprochen. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Endoreduplikation Unterschiede zwischen Gewebe
Zuvor berichteten wir, dass die Knolle Mark Gewebe deutlich höheres Maß an Endoreduplikation als Kortex Gewebe16hat. Um zu bestätigen und erweitern auf diese schauten wir Endoreduplikation Ebenen von drei verschiedenen Geweben in CV Superior: Mark, Perimedullary Parenchym und Kortex, in dreifacher Ausfertigung mit 2.000 nichtöffentliche Veranstaltungen pro Probe repliziert. Unsere Ergebnisse bestätigen unsere frühere Beobachtung, dass Mark Gewebe wesentlich größere EI als kortikalen Gewebe mit 1,79 und 1.12 Endocycles pro Zelle, bzw. hat (p = 0,018; Studenten t-Test). Etwas überraschend das Parenchym Gewebe ein Profil ähnlich wie Cortex gezeigt und war auch signifikant verschieden von Mark Gewebe (bedeuten = 1,14; p = 0,013; Studenten t-Test). Diese Ergebnisse sind in Abbildung 4zusammengefasst.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> Abbildung 4: Endoreduplikation in drei Geweben des CV Superior. Die Histogramme der Knolle Kortex (B), Blatt (A), Parenchym (C) und Mark (D) Gewebe werden zusammen mit dem EI-Wert berechnet aus diesen Histogramme angezeigt. Relative Häufigkeit von Kernen bestehend aus jeder Gipfel unterscheiden erkennbar, vor allem zwischen Blatt und Knolle Gewebe. C-Werte für jeden Peak werden ebenfalls angezeigt. PI-H entspricht der Intensität der Fluoreszenz, die in beliebigen Einheiten gemessen wird. Meine Vergleiche von EI der Knolle Gewebe sind angezeigt, in E, wo Sternchen signifikanten Unterschied gibt (p < 0,05) und Fehlerbalken zeigen Standardabweichung. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Einfluss der Knolle Größe und Diploidie
Wir berichteten bereits, dass für einen bestimmten Genotyp Knollen von unterschiedlicher Größe, aber ähnliche Reife keinen entsprechenden Unterschied in EI16angezeigt. Wir wollten dieses Ergebnis bestätigen ebenso wie beurteilen Sie die Beziehung zwischen Diploidie und Endoreduplikation. Für dieses Experiment verwendet wir drei Wiederholungen von Parenchym Gewebe aus drei verschiedenen Genotypen: CV Superior (4 X), VT_SUP_19 (2 X) ein Dihaploid ist 4 X ist eine doppelte Dihaploid CV Superior durch Kribbeln Bestäubung17und VT_SUP_19 entnommen 18 isogenen, VT_SUP_19. Wir enthalten eine Reihe von Wiederholungen für groß (90-130 g) und kleine (< 35 g) Knollen für CV Superior während Knollen für die anderen beiden Genotypen 90 – 130 g wurden. Die Knollen waren alle geerntet aus Gewächshaus Pflanzen angebaut, bei voller Reife, d.h. die Spitzen der Pflanzen war gealtert. Wir beobachteten einen signifikanten Unterschied zwischen VT_SUP_19 und ihre Vorläuferzellen Superior (p = 0,04); Allerdings gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen VT_SUP_19 und VT_SUP_19 4 X (p = 0,69). Dies bedeutet, dass es zwar eine wahrscheinliche genetische Komponente Endoreduplikation, als durch die genomische Reduktion entlarvt es nicht von Diploidie, zumindest in diesem Hintergrund diktiert wird. Zu guter Letzt beobachteten wir wieder einmal keine signifikanten Unterschiede zwischen großen und kleinen CV Superior Knollen wie in Abbildung 5gezeigt.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> Abbildung 5: Endoreduplikation in zwei Größen der Knollen CV Superior diploiden (VT_Sup_19) und tetraploide (VT_Sup_19 4 X) Derivate. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert für kleine (< 35 g) und groß (90-130 g) CV Superior Knollen sowie groß (90-130 g) Knollen von Dihaploid VT_SUP_19 und der isogenen verdoppelt Dihaploid VT_SUP_19 4 X. Signifikante Unterschiede (p < 0,05) werden durch den verbindenden Brief-Bericht angezeigt. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Messung der Endoreduplikation durch Durchflusszytometrie von isolierten Knolle Protoplasten

Das hier beschriebene Protokoll ist eine Methode zur Messung der Endoreduplikation innerhalb Knollen der Kartoffel (Solanum Tuberosum). Freuen Sie sich auf Plasmolyse und Protoplasten Extraktion Schritte um die Lärm und Schmutz in nachgeschalteten durchflusszytometrischen Analyse verringern.

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Aufrufe.  Virginia Tech. Das hier beschriebene Protokoll ist eine Methode zur Messung der Endoreduplikation innerhalb Knollen der Kartoffel (Solanum Tuberosum). Freuen Sie sich auf Plasmolyse und Protoplasten Extraktion Schritte um die Lärm und Schmutz in nachgeschalteten durchflusszytometrischen Analyse verringern.

Serie: Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals are currently not available, methods measuring the impact of potential antiviral agents are required. Here, a dual fluorescence reporter that allows the analysis of the BKPyV non-coding control-region (NCCR) driven early and late promoter activity was constructed to quantify the impact of potential antiviral drugs on viral gene expression via tdTomato and eGFP expression. In addition, by cloning BKPyV-NCCR amplicons which in this protocol have been exemplarily obtained from the blood-derived DNA of immunocompromised renal transplanted patients, the impact of NCCR-rearrangements on viral gene expression can be determined. Following cloning of the patient derived amplicons, HEK293T cells were transfected with the reporter-plasmids, and treated with potential antiviral agents. Subsequently, cells were subjected to FACS-analysis for measuring mean fluorescence intensities 72 h post transfection. To also test the analysis of drugs that have a potential cell cycle inhibiting effect, only transfected and thus fluorescent cells are used. Since this assay is performed in large T Antigen expressing cells, the impact of early and late expression can be analyzed in a mutually independent manner.

In this manuscript, a protocol is presented to perform FACS-based measurement of BK-polyomavirus transcriptional activity by using HEK293T cells transfected with a bidirectional reporter plasmid expressing tdTomato and eGFP. This method further allows to quantitatively determine the influence of novel compounds on viral transcription.

Messung der BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Forschung

Genetik

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Verbesserung der Bacillus subtilis-Sporenzählung und Markierungsanalyse in der Durchflusszytometrie

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biochemie

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Biologie

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Hochdurchsatz-Messung von Dictyostelium Discoideum Macropinocytosis von Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Erkennung und Charakterisierung der Protein-Selbstmontage in Vivo durch Durchflusszytometrie

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Flow Cytometry Assay to Quantify Oxidative Stress: An Assay to Quantify Reactive Oxygen Species in Intestinal Organoids Using Fluorogenic Probes

Source: Stedman, A., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62880">Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a flow cytometry assay to quantify the ROS levels in 3D intestinal organoids obtained from GFP-expressing transgenic mice. This method provides an in vitro experimental model to investigate the efficacy of test compounds on ROS production.

Durchflusszytometrischer Assay zur Quantifizierung von oxidativem Stress: Ein Assay zur Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies in Darmorganoiden mit fluorogenen Sonden

Source: Stedman, A., et al., Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe.&#160;J. ...