Name: examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels at JoVE.com

Wir möchten danken Joshua Singer, Jonathan Schenk sowie durchdachte Rezensenten für Kommentare auf das Manuskript. Wir möchten auch Danke Ben White und Harold Zakon für Diskussionen über die Technik. Jonathan Schenk lieferten die Daten für die Abbildung 3A. Diese Arbeit wurde durch ein Whitehall Foundation Grant und einem NIH-R21, QG unterstützt.

1. bereiten Sie fliegen und identifizieren GAL4-Promotor-Linien
<ol><li>Wählen Sie eine GAL4-Promotor-Linie und überqueren sie mit fliegen, die Durchführung des Transgens UAS-NaChBac und ein optogenetische Transgen für die Aktivierung. Hinweis: FH-CsChrimson11 aufgrund seiner hohen Leitfähigkeit und die Leichtigkeit, mit der NaChBac-vermittelten Aktionspotentialen aktiviert, ausgewählt ist. FH-NaChBac und FH-CsChrimson sind aus dem Bloomington Bestände Repository verfügbar.</li>
	<li>Bereiten Sie All-Trans Retinal als eine Stammlösung in Ethanol (35 mM) und speichern Sie die Lösung im Gefrierschrank bei-20 ° C.</li>
	<li>Mix-28 µL von diesem Bestand in etwa 5 mL konzentrierter Kartoffel Essen blättert nicht ab und fügen Sie diese Mischung an die Spitze der ein Fläschchen mit konventionellen Drosophila -Medium.</li>
	<li>Fliegen mit dem Ausdruck CsChrimson auf Lebensmittel, die 0,2 mM All-Trans-Retinal für 1 – 3 Tage11zu erhöhen.</li>
</ol>2. bereiten Sie TTX Lager
<ol><li>Erstellen Sie eine Stammlösung 1 mm TTX in destilliertem oder entionisiertem Wasser. Diese Lösung für mehrere Monate im Labor Kühlschrank aufbewahren. Überprüfen Sie die Institutionen Richtlinien in Bezug auf die Speicherung von TTX, wie viele Institutionen TTX als gefährlich oder kontrollierte Substanz einzustufen.</li>
</ol>3. bereiten Sie fliegen für Elektrophysiologie
<ol><li>Sammeln Sie 1 – 3 Tage alten Erwachsenen fliegen, die ausgelöst werden, auf das Essen mit All-Trans-Retinal. Hinweis: Siehe Murthy und Turner im Jahr 2013 für eine detaillierte Beschreibung der Patch spannen Drosophila Neuronen12,13.</li>
	<li>Legen Sie die fliegen in eine Glasflasche funkeln. Legen Sie das Fläschchen auf Eis für 1 min um die fliegen zu immobilisieren.</li>
	<li>Verwenden Sie grobe Zange um eine Fliege in eine maßgeschneiderte Aufnahme Kammer einzufügen. Die Kammer besteht aus einem 3 ½" Kreis Laser Schnitt von 1/16" Acryl. Schnitt ein Loch ¾" ist in der Mitte, wo eine benutzerdefinierte Folie mit 2-Komponenten-Epoxy befestigt ist. Die Folie enthält eine dreieckige geformte Hoffnung, die die Fliege eingefügt ist.</li>
	<li>Wenden Sie Wachs oder UV heilbar Epoxy rund um das Tier, um es innerhalb der Aufnahme Kammer zu befestigen an.</li>
	<li>Die Vorbereitung mit einem Schwanenhals-Lichtleiter für Visualisierung unter einem Stereomikroskop zu beleuchten. Legen Sie die Schwanenhals-Fasern für Schrägbeleuchtung sie so angepasst, dass sie fliegen direkt von der Seite beleuchten.</li>
	<li>Passen Sie die Lichtintensität auf die niedrigste mögliche Einstellung, noch klare Visualisierung der Fliege ermöglicht. Diese Lichtintensität variiert in einzelnen Experimente. Hinweis: Dieses Protokoll kann angepasst werden durch eine in Situ Gehirn explant Methode14.</li>
	<li>Rufen Sie externe Aufnahme Kochsalzlösung. Die Kochsalzlösung enthält in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-Tris (Hydroxymethyl)-Methyl-2-Aminoethane-Sulfo-Säure, 8 Trehalose, 10 Glukose, 26 Nahco33, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2und 4 MgCl2 (eingestellt auf mΩ 270-275). Die Kochsalzlösung wird mit 95 % O25 % CO2 (Carbogen) übergeben und hat ein pH-Wert 7,315angepasst.</li>
	<li>Platzieren Sie 4-6 Tropfen von extrazellulären Aufnahme Kochsalzlösung über die Fliege Vorbereitung. An diesem Punkt erhöhen Sie die Beleuchtungsstärke am Dissektion Mikroskop für bessere Sichtbarkeit.</li>
	<li>Ein Wolframdraht mit Elektrolyse zu schärfen. Um den Draht zu machen, Vorbereiten einer gesättigten Lösung von KNO3 und ca. 20 V AC Strom nicht anzuwenden, wenn die Spitze des Drahtes in die Lösung 20 Mal für 100 ms eintauchen, bis die Spitze geschärft ist. Verwenden Sie die geschärften Wolframdraht, entfernen die Nagelhaut auf den Kopf der Fliege und damit das Gehirn aussetzen.</li>
	<li>Weiter aussetzen des Gehirns durch Entfernen von Luftröhre und Fett stellen, die sie umgeben. Wenn die Riechzentrum Lappen zugreifen, verwenden Sie eine gebogene Wolframdraht oder ähnliches Werkzeug, sanft tuck Antennen unter der Folie Aufnahme Kammer um die Sichtbarkeit zu erhöhen. Verwenden Sie scharfe Pinzette sanft losreißen der Glia Ummantelung mit einer Fläche von Interesse, wo Aufnahmen gemacht werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Aufnahme-Kammer auf die Elektrophysiologie-Rig. Sofort sprudelte Start Perfusion mit externen Aufnahme Kochsalzlösung mit Carbogen, das Gehirn zu bewahren. Die Kochsalzlösung Reservoir wird über den Mikroskoptisch gesetzt und ist Schwerkraft-gefütterten zur Vorbereitung. Verwenden einer Vakuumleitung und eine 2 L-Erlenmeyerkolben, um die Abfälle Kochsalzlösung zu sammeln.</li>
</ol>4. erhalten Sie Whole-Cell Aufnahme
<ol><li>Ziehen Sie Patch Pipetten auf einem kommerziellen Pipette Abzieher. Konsultieren Sie das Handbuch für Einstellungen, um einen geeigneten Pipette mit einem Tipp-Widerstand in der Nähe von 7 mΩ zu erreichen.</li>
	<li>Fügen Sie 4 µL interne Aufnahme-Lösung in einer Patch-Pipette. Die interne Kochsalzlösung besteht aus 140 Kalium Aspartat-, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA und 1 KCl in mM.</li>
	<li>Patch Clamp Verstärker für die gesamte Zelle Aufnahme eingerichtet. Des Verstärkers Offset Null und legen Sie den Verstärker Testimpulse liefern. Hier wird AM Systeme Patch Clamp Verstärkers 2.400 verwendet.</li>
	<li>Positiver Druck durch die Pipette und nähern sich die Zelle. Verwenden Sie einen Mikromanipulator leiten die Pipette und wenden Sie sich an die Zelle. Entlasten Sie positiven Druck. Satz der Holding-Potenzial der Membran zu-60 mV. Die Pipette sollte eine Gigaohm Dichtung mit der Zellmembran wie durch eine niedrige Sub-Picoamp Haltestrom zu bilden. Hinweis: Wenn mit GFP Zelle Ausrichtung geleitet, versuchen Sie, Einsatz von Epifluorescent Licht auf ChR2 Aktivierung und potenzielle synaptische Depression verhindern zu minimieren. Auch für ein paar Minuten vor dem Auftragen Schritt 5 warten.</li>
	<li>Festlegen den Verstärker liefern Testimpulse von-50 mV bis-60 mV. Diese Einstellung ist standardmäßig in Patch-Clamp-Verstärker. Prüfimpulse zeigen eine große kapazitative transiente repräsentieren die aktuellen notwendig, laden Sie die Patch-Pipette. Entfernen Sie kapazitative Transienten durch Anpassung der Kapazität Entschädigung Knöpfe auf der AM 2400 oder ähnlichen Verstärker.</li>
	<li>Wenden Sie kurze Impulse von Unterdruck, Ruptur der Zellmembran und erhalten ganz-Zell Konfiguration an. Hinweis: Eine ganze Zelle Konfiguration wird beobachtet, wenn gibt es eine große Zunahme der kapazitative Transienten zeigt die Kapazität des Neurons. Eine geringe Erhöhung der Haltestrom (Baseline) wird wahrscheinlich auch beobachtet werden. Den Verstärker zu aktuellen Klemme Modus einstellen und anpassen der Zelle Potential,-50 bis-60 mV.</li>
</ol>5. Testen Sie die synaptischen Konnektivität
<ol><li>Konfigurieren Sie das Datenerfassungssystem (DAQ) um einen LED-Treiber um die Lichtimpulse erzeugen auszulösen. Hier wird eine nationale Instrumente DAQ-System mit Matlab verwendet, um ein analoges Signal auf einen LED-Treiber liefern. Die LED-Intensität wird über das analoge Signal an den Fahrer angepasst. Die LED ist ein 620-630 nm Wellenlänge LED.</li>
	<li>Positionieren Sie die High-Power LED direkt unterhalb der Vorbereitung. Passen Sie die Intensität des Lichts, sodass 0.238 mW/mm2 im Handumdrehen erreicht.</li>
	<li>Aktivieren Sie die präsynaptischen Neuronen während der Aufnahme aus der postsynaptischen Zelle von Interesse. Zelle Aktivierung Optogenetically, Pharmacogentically, zu erreichen oder über Nervenstimulation. Hier sind CsChrimson und kurze Impulse von rotem Licht angewendet. Hinweis: Synaptische Verbindungen können entweder in Stromzange als EPSPs oder Spannung Klemme als EPSCs überwacht werden. Eine synaptische Verbindung sollte sichtbar sein, bevor Sie in Reaktion auf einen Lichtpuls 40 ms TTX anwenden. Wenn keine Verbindung zu beobachten ist, ist es unwahrscheinlich, dass die Nervenzellen synaptisch verbunden entweder Mono- oder polysynaptically. Im Betrieb möglichen kann angepasst werden, um erregenden oder hemmenden Anschlüsse entsprechend zu betonen.</li>
	<li>Wenn eine Verbindung in normalen Kochsalzlösung beobachtet wird die Perfusion System, eine Endkonzentration von 1 zu erreichen TTX hinzufügen verwenden µM eine Umwälzpumpe zu erfassen und Wiederverwenden von Kochsalzlösung um TTX zu sparen. Die peristaltische Pumpe wird Salzlösung aus dem Bad zu ziehen und an der saline Reservoir zurück.</li>
	<li>Passen Sie die Pumpe Geschwindigkeit um ein starkes Vakuum konstant bereitzustellen, das nicht, dass Kochsalzlösung Ebene in der Badewanne zulässt zu steigen und fallen. Hinweis: Die Anwendung der TTX sollte die Einstellung der Spick Aktivität in der Nervenzelle, die ganze Zelle überwacht wird führen. Dies bestätigt, dass die Kochsalzlösung genug TTX hinzugefügt wurde.</li>
	<li>Kurze Impulse von rotem Licht (40 ms bei jedem Impuls) erneut anwenden. An dieser Stelle synaptische Verbindung, die bleibt ist wahrscheinlich monosynaptischen. Die umlaufenden Kochsalzlösung testen die chemische Natur der synaptischen Verbindungen, die bleiben in TTX fügen Sie pharmakologische Antagonisten hinzu. Hinweis: Bei der Kombination von Optogenetik und fluoreszierende Ausrichtung der Neuronen kann es wichtig, nicht zu anhaltend aktivieren die präsynaptischen Bevölkerung der Neuronen bei dem Versuch, eine Aufnahme zu erhalten sein. Dies kann zu synaptische Depression führen und erschwert es, Verbindungen zu sehen. Da CsChrimson eine lange Erregung Band, die weitgehend in den Bereich des grün fluoreszierenden Proteins erstreckt hat, kann eine rote Fluorophor verwendet werden, um Neuronen und channel2rhodopsin visualisieren (Ch2R) kann verwendet werden, um Zellpopulationen zu begeistern. Dies erfordert spezielle Genetik und einen benutzerdefinierten Filter-Cube. Um geeignete fliegen zu erzeugen, machen Sie fliegen, die die rote Fluorophor (RFP oder mCherry) ausdrücken unter die LexA oder Q-System binärer Ausdruck Systeme. Diese müssen mit der Fliege Gal4 Förderer und FH-Ch2R und FH-NaChBac-Effektor-Gene auszudrücken überquert werden. Der optimale Filter-Cube für Epifluoreszenz haben eine Reihe von schmalen Erregung zu begeistern die rote Fluorophor, aber nicht begeistern Ch2R. zusätzlich, die Filter-Set sollte einen langen Pass Emission Filter, um möglichst viel emittierte Licht zu sammeln. Wir verwendeten einen benutzerdefinierten Filter set von Chroma, die Teil-Nummern et580/25 X und t600lpxr (aus dem 49306 Satz), enthalten aber mit einem et610lp Barriere/Emission Filter.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li><li>Doyle, M. W., Andresen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+monosynaptic+sensory+transmission+in+brain+stem+neurons+in+vitro.">Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro.</a> J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).</li><li>Nicholls, J. G., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+chemical+and+electrical+connexions+between+sensory+and+motor+cells+in+the+central+nervous+system+of+the+leech.">Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech.</a> J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).</li><li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).</li><li>Liao, X., Walters, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+elevated+divalent+cation+solutions+to+isolate+monosynaptic+components+of+sensorimotor+connections+in+Aplysia.">The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia.</a> J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).</li><li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+(GRASP)+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems.">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57, 353-363 (2008).</li><li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+labelling+of+neural+connections+in+multiple+colours+by+trans-synaptic+fluorescence+complementation.">Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation.</a> Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).</li><li>Zhang, X., Gaudry, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+integration+of+a+serotonergic+neuron+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+olfactory+processing+in+Drosophila:+mechanisms+and+principles.">Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain.">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).</li><li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+head+cuticle+and+sheath+of+living+flies+for+whole-cell+patch-clamp+recordings+in+the+brain.">Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila.">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li><li>Kazama, H., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Matching+and+Nonlinear+Amplification+at+Identified+Central+Synapses.">Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses.</a> Neuron. 58, 401-413 (2008).</li><li>Becnel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+in+Drosophila:+a+pharmacogenetic+approach+for+controlling+behavior,+neuronal+signaling,+and+physiology+in+the+fly.">DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly.</a> Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).</li><li>Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laserspritzer:+A+Simple+Method+for+Optogenetic+Investigation+with+Subcellular+Resolutions.">Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions.</a> PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).</li><li>Holloway, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Glutamatergic+Activation+of+Locus+Coeruleus+and+Other+Lower+Brainstem+Noradrenergic+Neurons+by+the+C1+Cells+in+Mice.">Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice.</a> J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta.">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li><li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap.">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Terpen Analyse ergänzt aktuelle Techniken zur Schaltung Rissbildung durch ermöglicht die Erkennung von Synapsen zwischen bestimmten Nervenzellen verwendet. Insbesondere offenbart der Ansatz monosynaptische Verbindungen im großen und ganzen Aktionspotentiale mit TTX-Stummschaltung während der Wiederherstellung Erregbarkeit in einer ausgewählten Population von Neuronen mit dem TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac. Synaptischen Freisetzung wird durch optogenetische Stimulation ausgelöst, während postsynaptischen Veranstaltungen mit Aufnahmen der gesamten Zelle überwacht werden. WARFTEN unterscheidet sich von anderen Ansätzen wie Griff durch sensibel Bulk oder Volumen Getriebe löste bei längeren Strecken und die Fähigkeit, pharmakologische Manipulationen durchführen. Die Technik ist relativ einfach zu verwenden und erfordert nur eine Aufzeichnung Elektrode und einer Lichtquelle für optogenetische Stimulation, die mehr als den Erhalt dual ganze Zelle Aufnahmen auf Prä- und postsynaptischen Teil der Synapse machbar ist. Eine grundlegende Anforderung der WARFTEN ist, dass Aktionspotentiale leicht in das zu untersuchende System durch TTX blockiert werden. Aber weil TTX einem breiten Spektrum von taxonomischen Stämme auf Nervenzellen wirkt, ist es wahrscheinlich, dass WARFTEN im großen und ganzen auf beiden Säugetieren und Wirbellosen Modellsysteme angewandt werden könnte.
WARFTEN können einfach in einer Reihe von Sitten, entweder zu erleichtern die Stimulation der vermeintlichen präsynaptischen Bevölkerung oder für die Aufnahme von postsynaptischen Ziele angepasst werden. Hier wurde ein optogenetische Werkzeug verwendet, um die Zielgruppen zu stimulieren obwohl Aktivierung durch eine Vielzahl von Mechanismen möglich ist. Nervenstimulation von sensorischen Axonen, z. B. ist Routine in Studien der Übertragung vom Riechzentrum Nerv in Drosophila16 und eignet sich in anderen sensorischen Systemen, einschließlich der periphere Nerven, die Mechanosensory Neuronen enthalten. Ein ähnlicher Ansatz zu testen funktionelle Verknüpfung in Drosophila ausgedrückt GCaMP Kalzium Indikatoren in einer Population von Neuronen während der Fahrt Tätigkeit in anderen Bevölkerung über die Ionotropic Purinoceptor P2X2 und ATP Anwendung2. Dieser Ansatz sollte einfach gemeinsam zum Ausdruck bringen das Transgen NaChBac mit den P2X2-Rezeptor in einem Neuron und GCaMP in anderen Bevölkerung nach einer Methode, völlig frei von Patch kompatibel mit WARFTEN. Jedoch sollte Vorsicht mit Ansätzen verursacht langsamere Depolarizations, wie z. B. die Muskarin-basierten Designer Rezeptoren aktiviert ausschließlich durch eine Designerdroge (DREADDs)17,18genommen werden. Langsame Depolarisation könnte zu NaChBac Inaktivierung vor Aktionspotential Generation führen.
Ähnliche Methoden auf WARFTEN sind in Säugetier-Systemen eingesetzt worden. Solche Techniken kombinieren TTX und Channelrhodopsin Verbindungen zwischen den Neuronen zu kartieren. Channelrhodopsin Aktivierung allein in der Regel nicht depolarisieren Neuronen ausreichend, und somit ist die Kalium Kanal Blocker 4-AP mit TTX Release19,20,21zu entlocken angewendet werden. Während dies bei vielen Synapsen funktioniert, kann es nicht an einige metabotropen Synapsen funktionieren, wenn das nachgeschaltete Ziel des Rezeptors ein 4-AP sensible Kaliumkanal ist. Zum Beispiel setzt serotonergen Modulation der olfaktorischen Antwort in Motten direkt zur Modulation von solch eine 4-AP empfindliche K+ Strom (IA)22. Dieser Ansatz funktionierte auch nicht an die CSDn, LN Synapse (Daten nicht gezeigt). So WARFTEN hat noch einen Vorteil des Erforderns weniger pharmakologische Intervention im Vergleich zu anderen gängigen Methoden und breiteres Spektrum oder Synapsen arbeiten können.
Es gibt ein paar Einschränkungen auf WARFTEN, die berücksichtigt werden sollten. Erstens kann mögliche Nebenwirkungen von chronischen Ausdruck des NaChBac Kanals während der Entwicklung sein. Ordnungsgemäße Schaltung Montage und Funktion können durch den Vergleich bestätigt werden, die Aktivität der Neuronen zwischen Kontrolle fehlt das NaChBac Konstrukt fliegt und fliegt mit dem Konstrukt der mangelnden TTX. Um solche Probleme zu vermeiden, konnte Expression des Transgens NaChBac per Ausdruck von temperaturempfindlichen GAL4 Repressor, GAL8023zeitlich gesteuert werden. Darüber hinaus, wenn eine Synapse nur in einem Staat-abhängigen Weise beobachtet wird, ist es denkbar, dass Netzwerk-Aktivität mit TTX unterdrücken solche Verbindung verbergen könnte. Es ist wichtig zu betonen, dass eine formschlüssige Verbindung mit WARFTEN wahrscheinlich beobachtet eine echte Mono-synaptische Verbindung darstellt, während ein negatives Ergebnis nicht Beweis für das Fehlen einer Verbindung ist.
Während WARFTEN die Fähigkeit des Senders offenbaren loslassen von einem Neuron postsynaptischen Partner natürlich beeinflussen die langsame Kanal Dynamik des NaChBac und die Plateau-Potenziale verbunden mit seiner Aktivierung machen es weniger für das Studium der klassischen Neurotransmission. Ein Ansatz, die WARFTEN für schneller verändern, werden mehr natürliche Sender Freisetzung eine modifizierte TTX-unempfindliche Version des endogenen Drosophila Natrium-Kanal Para im Gegensatz zu NaChBac zum Ausdruck bringen. Diese Änderung würde naturalistischen spiking Aktivität in der präsynaptischen Zelle und herkömmlicheren Analyse der synaptischen Übertragung in Ermangelung der Netzwerk-Aktivität zu ermöglichen. Dies hätte großes Potential für Studien der Rate-Codierung Synapsen, an denen entlocken eine Vielzahl von präsynaptischen Aktivität ohne recruiting polysynaptische Netzwerke wünschenswert wäre.

Ein wesentliches Ziel der Neurowissenschaften ist, ordnen Sie die Verbindungen zwischen den Neuronen zu verstehen, wie Informationen über Schaltkreise fließt. Zahlreiche Ansätze und Ressourcen haben, um funktionelle Verknüpfung zwischen den Neuronen in einer Reihe von Modell-Systeme1,2Testen verfügbar. Um die genauesten Schaltpläne mit Elektrophysiologie zu erzeugen, ist es wichtig, zu lösen, ob beobachtete Verbindungen zwischen zwei Zellen direkt und monosynaptischen versus indirekte und polysynaptische sind. Ein Gold-Standard für die Herstellung dieser Unterscheidung in Säugetier-Neuronen ist die Wartezeit zwischen den einzelnen Action potentials in den präsynaptischen Zellen und dem Beginn der exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in der zweiten Nervenzelle messen. Monosynaptische Verbindungen sollten kurze Wartezeiten von ein paar Millisekunden und geringe Variabilität3haben. Dieser Ansatz kann in Wirbellosen Neuronen kompliziert sein, denn Synapsen in ihre Dendriten weit von der somatische Aufnahme Website, was zu Verzögerungen in der Erkennung durch lange electrotonic Abstände zwischen postsynaptischen maßgearbeitet und der Aufnahme auftreten können Elektrode. Solche Verzögerungen können Unklarheiten bezüglich Poly-im Vergleich zu monosynaptischen Beiträge vorstellen. Darüber hinaus kleine synaptische Ereignisse kann vor Erreichen der somatischen Aufnahmen Website zerfallen, und fahren stärker präsynaptischen Aktivität wird voraussichtlich polysynaptische Veranstaltungen zu rekrutieren.
Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um für monosynaptischen Verbindungen bei Wirbellosen zu testen. Ein Ansatz setzt hohe zweiwertigen kationen (Hi-Di) mit überschüssigem Mg++ und Ca++. Diese Lösung blockiert polysynaptische Verbindungen durch reduzierende Release Wahrscheinlichkeit und zunehmende Aktionspotential Schwelle, Erkennung von monosynaptischen Eingang4,5zu bevorzugen. Bestimmung der genauen Verhältnis von Mg++ bis ca.++ erforderlich, jedoch ist nicht trivial und polysynaptische Beiträge können selbst bescheidene Stimulation6anhalten. Ein alternativer Ansatz namens GFP Rekonstitution über Synaptic Partner (GRASP) nutzt die Nähe zwischen Prä- und postsynaptischen Membranen gefunden an den Synapsen, einem monosynaptischen Verbindung 7abzuleiten. Hier eine Komponente des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) äußert sich in einer Nervenzelle und der ergänzenden Fragment des Moleküls drückt sich in einem vermeintlichen postsynaptischen Partner. Das Vorhandensein der Fluoreszenz zeigt, dass die zwei Neuronen sind in der Nähe genug, Rekonstitution des GFP-Moleküls zu gestatten und setzt die Existenz einer Synapse. Griff kann Synapsen falsch, jedoch melden, wenn zwei Zellen eng Membranen, wie in einem Nerv oder Faszikel apposed haben. Varianten von GRASP beseitigen solche Fehlalarme durch begrenzen der präsynaptischen Fragments der GLP direkt an Synaptobrevin, wodurch Rekonstitution nur bei aktiven Synapsen8. Während Griff und seine Varianten Bestimmung funktionelle Verknüpfung bei der Drosophila CNS beigetragen haben, können einige Verbindungen nicht sichtbar gemacht werden durch Verständnis wenn die Abstände zwischen Prä- und postsynaptischen Partner ist relativ groß. Dies ist besonders relevant bei der Bewertung der Lautstärke Übertragung Neuromodulation9 oder GABAergen Hemmung10zugeordnet.
Hier zeigt sich eine ergänzende und neuartige Technik zum Testen monosynaptischen Direktverbindungen in Drosophila CNS. Diese Methode, genannt Tetrodotoxin entwickelt Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN), funktioniert durch Co Ausdruck von Tetrodotoxin (TTX)-resistenten Natrium-Kanal, NaChBac und Aktivator optogenetische in einer präsynaptischen Zelle während der Aufnahme von vermeintlichen postsynaptischen Partner9. In Anwesenheit von TTX wird alle Aktionspotential-vermittelte Aktivität in den Zellen als die mit dem Ausdruck NaChBac unterdrückt. Der NaChBac-Kanal wird selektiv Erregbarkeit in die gezielte präsynaptischen Zellen bei schönem Licht-evozierten synaptische Übertragung wiederhergestellt. Diese Methode ermöglicht starke Aktivierung der präsynaptischen Neuronen, so dass Verbindungen postsynaptically durch somatische Aufnahme und reduziert die Wahrscheinlichkeit von recruiting polysynaptische Schaltungen gelöst werden können. Wichtig ist, diese Technik erlaubt die Untersuchung der Volumen-Übertragung und zeigt die Verbreitung des Senders aus ein einzelnes Neuron in einer Schaltung entlassen. Darüber hinaus können Terpen die chemische Natur der Verbindung durch konventionelle Pharmakologie offenbaren. Terpen eignet sich für den Einsatz in jedem Modellsystem, das die transgenen Ausdruck der TTX-unempfindliche Natriumkanäle ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Used as a neural activator</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores excitibility in cells in TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance</td></tr><tr><td>all trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Require co-factor for channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Weldable 321 Stainless Steel&amp;nbsp;Sheet,&amp;nbsp;0.002&quot;&amp;nbsp;Thick,&amp;nbsp;10&quot;&amp;nbsp;Wide</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Used for dissection of preparation</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Used during dissection to secure fly in foil</td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Used with waxer</td></tr><tr><td>Number 5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5CO</td><td>Used for dissection and desheathing</td></tr><tr><td>Dissection Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>Used to remove parts of the cuticle during dissection</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection</td></tr><tr><td>Reciculating Peristaltic Pump</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>for recirculating TTX</td></tr><tr><td>Speed Controller for peristaltic pump</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&amp;nbsp;Precision Compressed Air Regulator</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>For applying positive pressure during patching</td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>For patch pipettes</td></tr><tr><td>Multipurpose Gauge</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Gauge for pressure regulator</td></tr><tr><td>Electrophysiology Camera</td><td>Dage MTI&amp;nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>M850F2</td><td>For oblique illumination</td></tr><tr><td>fiber optic for IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Couples to IR LED</td></tr><tr><td>Objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>For visualizing RFP and mCherry</td></tr><tr><td>Blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>&lt;strong&gt;M470L3&lt;/strong&gt;&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt;</td><td>For visualizing GFP</td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Chroma</td><td>&lt;strong&gt;49011&lt;/strong&gt;</td><td>For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Custom mCherry Filter Set</td><td>Chroma</td><td>&amp;nbsp;et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic</td><td>Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic to combine Amber and blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.</td></tr><tr><td>Red LED</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Used to drive csChrimson</td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Used to drive LEDs for optogenetic stimulation</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Used to position pipette during recordings</td></tr><tr><td>Patchclamp Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2400</td><td>An equivalent amplifier is suitable</td></tr><tr><td>Bessel Filter</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.</td></tr><tr><td>Data Acquisition System&amp;nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 781044-01</td><td>Used to record data from amplifier to computer</td></tr><tr><td>Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Used to connect amplifier to DAQ card.</td></tr><tr><td>Steel Foil&amp;nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Steel foil for custom recording chamber</td></tr><tr><td>Magnets</td><td>K&amp;amp;J Magnetics</td><td>D42</td><td>To secure recording chamber to ring stand</td></tr><tr><td>1/16&quot; Cell Cast Acrylic Clear</td><td>Pololu</td><td></td><td>Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr></tbody></table>

examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels

Hier ist eine neue Technik, genannt Tetrotoxin (TTX) Engineered Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN) angewendet, um monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen Ziel zu testen. Die Methode beruht auf Co Ausdruck einer transgenen Aktivator mit dem Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac, in ein bestimmtes präsynaptischen Neuron. Verbindungen mit vermeintlichen postsynaptischen Partner richten sich nach ganzen Zelle Aufnahmen im Beisein von TTX, die elektrischen Aktivität in Nervenzellen blockiert, die nicht NaChBac ausdrücken. Dieser Ansatz kann geändert werden, um mit Aktivator oder Kalzium Imaging als Reporter der Verbindungen arbeiten. Terpen verleiht den wachsenden Satz von Werkzeugen für die Bestimmung der Konnektivität innerhalb von Netzwerken zur Verfügung. WARFTEN ist jedoch eindeutig, dass es auch zuverlässig Masse oder Volumen Übertragung und Spillover Übertragung meldet.

Terpen dient zur Unterscheidung zwischen Mono- und polysynaptische Beiträge in synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen. Während schwache Stimulation einer Zelle verwendet werden, um direkte Verbindungen zu testen, Rekruten fahren größeren präsynaptischen Aktivität oft polysynaptische Verbindungen (Abbildung 1A). Terpen funktioniert durch die TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac und Aktivator optogenetische Co zum Ausdruck zu bringen, und testen Verbindungen in Gegenwart von TTX polysynaptische Verbindungen (Abbildung 1 b) zu beseitigen. TTX blockiert effektiv Aktionspotentiale in Drosophila Gehirn, so dass es eine geeignete Vorbereitung auf WARFTEN (Abbildung 2A). Transgene Ausdruck des Natrium-Kanals NaChBac rettet Erregbarkeit in Neuronen und Ergebnisse in einem großen Plateau-Potential (Abb. 2 b).
Lokalen Interneuronen (LN) in das Riechzentrum Lappen zeigen robuste Antworten auf olfaktorische Reize (Abb. 3A). Da einzelne EPSPs nicht leicht bei der LN-Soma gelöst sind, bleibt jedoch unklar, ob solche Reaktionen ergeben sich direkt aus olfaktorischen Rezeptor Neuron Eingang (ORN) oder indirekt über Projektion Neuronen (PN) (Abb. 3 b) Eingang. Mithilfe von WARFTEN machen ORNs abgebildet, in der Tat direkte synaptische Verbindungen mit LNs (Abbildung 3).
Eine Besonderheit der WARFTEN ist seine Fähigkeit, speziell Volumen extra synaptische Übertragung zu lösen, die mit GABA oder Neuromodulatoren wie Serotonin auftreten können. Stimulation von einer serotonergen Neuron (CSDn) in der Drosophila Riechzentrum Lappen resultiert in einer Mischung aus Erregung und Hemmung in ein lokales Interneuron (Abbildung 4A und Abbildung 4 b). Die Erregung wird durch die exzitatorischen Transmitter Acetylcholin meditierte und die Hemmung wird durch Serotonin (Abbildung 4 und Abbildung 4). Terpen können verwendet werden, um festzustellen, ob die Verbindungen monosynaptischen sind durch den Wegfall von polysynaptischer Verbindungen (Abb. 4E). In TTX ist eine starke Hemmung noch beobachtet, in der LN, was darauf hindeutet, dass es aus direkt durch die Aktivierung eines bestimmten serotonergen Neurons (Abbildung 4F und Abbildung 4) ankommt. Diese Verbindung wird durch die Serotonin-Antagonist Methysergid blockiert. Die erregenden Synapse vermittelt durch Acetylcholin schied in TTX, was darauf hindeutet, dass es aus polysynaptische Quellen entstanden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig1.jpg"> Abbildung 1 : Terpen beseitigt polysynaptische Verbindungen und isoliert monosynaptischen Eingänge. (A). ein schematisches Diagramm zeigt, dass die Erhöhung der präsynaptischen Aktivität polysynaptische Verbindungen rekrutieren kann. (B). ein Diagramm zur Veranschaulichung, wie Terpen polysynaptische Beiträge entfernen können, mithilfe von TTX spiking Aktivität in Nervenzellen zu beseitigen. Erregbarkeit ist ausschließlich in einer Population von Neuronen wiederhergestellt, die dann aufgeregt Optogenetically sein kann. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/57052fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig2.jpg"> Abbildung 2 : NaChBac stellt neuronale Erregbarkeit in Drosophila Neuronen. (A) die Anwendung von 1 µm TTX abschafft Spick in Drosophila Neuronen. Spontane Aktivität und Geruch-evozierten Hemmung werden in TTX eliminiert. (B) NaChBac und CsChrimson sind in der CSDn ausgedrückt und das Gehirn TTX ausgesetzt ist. CsChrimson Stimulation erschüttert die CSDn und nachdem ein Schwellenwert überschritten wird, gibt es große nicht-linearen Anstieg der CSDn Membran Spannung. Diese schnelle Depolarisation bildet eine Hochebene Potenzial (Einschub). Jede Farbe über Simulation Intensitäten entspricht der gleichen Farbe im Spannung-Einschub. Diese Zahl wurde von Zhang und Gaudry 20169geändert. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/57052fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig3.jpg"> Abbildung 3 : Terpen enthüllt monosynaptische Verbindungen zwischen ORNs und LNs. (A) A Aufnahme zeigt eine Geruch Antwort in eine LN Diese Antwort kann Mono- oder polysynaptische in der Natur. (B) WARFTEN können bei der ORN, LN Synapse getestet werden. TTX wird verwendet, um Aktionspotentiale und Erregbarkeit in allen Zellen bei der Vorbereitung zu blockieren. Erregbarkeit ist ausschließlich in der ORNs über den NaChBac-Natrium-Kanal wiederhergestellt. Die ORNs können dann mit Channelrhodopsin angeregt werden, synaptischen Freisetzung zu entlocken. Synaptische Ereignisse sind post-synaptically mit Aufnahmen der gesamten Zelle gemessen. (C) WARFTEN zeigt, dass die ORN, LN Synapse monosynaptischen. Terpen kombinierbar auch mit Pharmakologie zu zeigen, dass die Synapse cholinerge und durch das Nikotin-Rezeptor-Antagonist Mecamylamin (200 µM) blockiert ist. Der graue Balken zeigt das Timing der ORN Stimulation. Diese Zahl wurde von Zhang und Gaudry in 20169geändert. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/57052fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig4.jpg"> Abbildung 4 : Terpen ist empfindlich gegen Masse oder Volumen Übertragung Entlassung aus modulierende Neuronen. (A) die Stimulation des CSDn entsteht ein Aktionspotential aus einer aufgezeichneten LN in der Drosophila Riechzentrum Lappen. (B) der LN ist hyperpolarisierten damit CSDn Stimulation eine Eingangssignale Aktivität führt. Die LN-Antwort besteht aus eine schnelle Depolarisation, gefolgt von einem langsameren Hyperpolarisation. Der graue Balken gibt die Zeit der CSDn Stimulation. Methysergid (50 µM), einem breiten 5-HT-Rezeptor-Antagonisten blockiert die langsame Hyperpolarisation aber hat keinen Einfluss auf die Depolarisation. Mecamylamin blockiert die schnelle Depolarisation, die darauf hindeutet, dass es in der Natur cholinerge. (C) WARFTEN können verwendet werden, um zu beheben, welche chemischen Komponenten des CSDn, LN Synapse Mono-und polysynaptische sind. (D) der CSDn wird im Beisein von TTX stimuliert und postsynaptischen LN-Antworten werden im gesamten Zelle Aufnahmen gemessen. Die Hyperpolarisation weiterhin TTX, was darauf hindeutet, dass es in der Natur monosynaptischen ist. Diese Hyperpolarisation wird auch von Methysergid, Einklang mit serotonerge Übertragung blockiert. Die kurze Depolarisation, die in TTX bleibt ist wahrscheinlich durch elektrische Kupplung, da sie nicht durch Nikotinsäure Antagonisten blockiert Lücke vermittelt. Diese Zahl wurde von Zhang und Gaudry in 20169geändert. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/57052fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1: Drosophila Folie. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/DrosophilaFoil.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Physiologie Kammer. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/PhysiologyChamber.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels at JoVE.com

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.

Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

9.9K Aufrufe.  University of Maryland. Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.

Serie: Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Forschung

Neurowissenschaften

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Biologie

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Entwicklungsbiologie

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Betrachtung von Mikrotubuli-Netzwerken in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mikrotubuli-Netzwerks in neuromuskulären Verbindungen von Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video