Name: observation and analysis of blinking surface-enhanced raman scattering
Uploaded: 2018-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering at JoVE.com

Der Autor dankt Prof. Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) und Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) für ihre fruchtbare Diskussionen dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (Nr. 16 K 05671) von KAKENHI (Beihilfe für wissenschaftliche Forschung C) unterstützt.

1. die Probenvorbereitung
<ol><li>
Vorbereitung von kolloidalem Silber-Nanopartikeln 20<ol>
<li>Um kolloidales Silber-Nanopartikeln zu fabrizieren, lösen Sie 0,030 g Silbernitrat und 0,030 g Trinatrium Citrat Dihydrat in 150 mL Wasser in einen 200-mL Rundboden-Kolben.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Flasche mit einem Reflux (Dimroth) Kondensator.</li>
		<li>Rühren Sie die Lösung in die Flasche mit einem magnetischen Rührer und rühren. Dann Hitze rühren Lösung in die Küvette in einem Ölbad bei 150 ° C für 60 min. Hinweis: Die Lösung leuchtet gelb, dann milchig grau.</li>
		<li>Kühlen Sie die Federung bei Raumtemperatur ab, und halten Sie die Aufhängung in die Küvette mit Alu-Folie im Kühlschrank abgedeckt. Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Verwenden Sie die kolloidale Nanopartikel nach Lagerung im Kühlschrank, innerhalb eines Monats.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Probe für mehrfarbige blinkende emission 11<ol>
<li>Um einen Objektträger bereit, eine Glasplatte mit Seife per hand waschen und mit Wasser abspülen.</li>
		<li>Die Glasplatte 0,1 % Poly-L-Lysin wässriger Lösung hinzu, und entfernen Sie die Lösung mit einem Gebläse.</li>
		<li>Die Glasplatte Silber kolloidalen Suspension hinzu, und entfernen Sie die Aufhängung mit einem Gebläse.</li>
		<li>Fügen Sie einen Dropdown-Bereich auf der Glasplatte mit einem flüssigen Blocker Stift.</li>
		<li>Tropfen Sie destilliertes Wasser auf der Glasplatte, und bedecken Sie es mit einem anderen Glasplatte auf einen Objektträger zu schaffen und verhindern, dass Wasser verdunstet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Probe für monotone farbigen blinkenden SERS 7 , 8 , 9 , 10<ol>
<li>Um einen Objektträger bereit, eine Glasplatte mit Seife per hand waschen und mit Wasser abspülen.</li>
		<li>Mischen Sie silberne kolloidale Suspension mit Thiacyanine oder Thiacarbocyanine Farbstoff (25 oder 4 µM, beziehungsweise) und eine wässrige Lösung von NaCl (10 mM) in einem Volumenverhältnis von 2:1:1.</li>
		<li>Fallen Sie die Probe-Suspension auf der Glasplatte, und entfernen Sie die Aufhängung mit einem Gebläse.</li>
		<li>Fügen Sie einen Dropdown-Bereich auf der Glasplatte mit einem flüssigen Blocker Stift.</li>
		<li>Legen Sie eine wässrige Lösung von NaCl (1 M) auf der Glasplatte, die Silber-Nanopartikel zu immobilisieren, und bedecken Sie es mit einem anderen Glasplatte zum Erstellen einer Mikroskop-Gleitplatte und verhindern, dass die Lösung verdunstet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beobachtung von Silber-Nanopartikeln zu blinken
<ol><li>
Beleuchtung der Probe
	<ol>
<li>Legen Sie die Probe Glasplatte mit Protokoll 1,2 oder 1,3 auf der Bühne von einem inversen Mikroskop zubereitet.</li>
		<li>Beleuchten Sie die Probe Glasplatte mit weißem Licht durch ein Dunkelfeld Kondensor und Fokus auf verschiedenen farbigen Flecken (blau, grün, gelb und rot) auf der Glasplatte mit einem Objektiv (60 X).</li>
		<li>Beleuchten Sie die Probe Glasplatte mit eine abgeschwächte Strahl, geliefert in einem Winkel von 30° im Verhältnis zu der Oberfläche der Probe aus einem Diodenlaser gepumpten Festkörperlaser (DPSS) Dauerstrich-(cw) durch ein Interferenzfilter.</li>
		<li>Laser-Beleuchtung verwenden, um die silberne Nanoaggregates als eintönig farbige Flecken in einer gleichfarbigen Umgebung zu beobachten, verschieben Sie der Laserbereich Beleuchtung in den Mittelpunkt der Ansicht, und konzentrieren Sie sich auf die Flecken auf der Glasplatte durch Anpassen der Bühne in Z-Richtung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beobachtung von blinken
	<ol>
<li>Fügen Sie einen lang-Pass-Filter nach der Objektivlinse und beleuchten Sie die Probe Glasplatte mit einem DPSS cw-Laserstrahl in einem Winkel von 30° gegenüber der Probenoberfläche durch ein Interferenzfilter geliefert.</li>
		<li>Finden Sie das Blinken Flecken, wie in Abbildung 1 dargestellt (siehe auch Abbildung S1 in das ergänzende Material) von der Bühne in x- und y-Richtung verschieben.</li>
		<li>Videoaufnahme der blinkenden Spots mit der inversen Mikroskop, gekoppelt mit einer gekühlten kostenlos – Coupled Digitalgerät (CCD) Kamera, die eine zeitlichen Auflösung von 61-120 ms hat, für 20 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse der SERS blinkt
<ol><li>
Ableitung der zeitliche Verlauf von video
	<ol>
<li>In der Software steuert, dass die CCD-Kamera, die video-Datei zu öffnen.</li>
		<li>Wenn die blinkende Flecken und dunklen Bereich auswählen möchten, ziehen Sie Bereiche, die separat Regionen mit und ohne Flecken im Videobild zu decken.</li>
		<li>Um die blinkende Flecken und dunkle Bereiche im Video Signal Intensität Zeitprofile abgeleitet, wählen Sie Zeitliche Analyse Analyse, und klicken Sie auf berechnen im Fenster Zeitliche Analyse .</li>
		<li>Speichern Sie die Daten als Textdatei.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse der das Zeitprofil
	<ol>
<li>Glätten Sie einen Überblick über den zeitlichen Verlauf durch Subtraktion der zeitliche Verlauf von den dunklen Bereich und/oder Armatur mit eine Polynomfunktion, wie in den Abbildungen 2A und 2 bdargestellt.</li>
		<li>Bewerten Sie eine gemittelte Baseline-Intensität, die besteht aus ca. 2000 Punkte ichbaseund einer Standardabweichung von Baseline Intensitäten, σ, wie in den Figuren 2 und 2Ddargestellt.</li>
		<li>Dunklen Ereignissen mit größerer Intensität als ein Schwellenwert von ichbase + 3σ unterscheiden Sie hellen Ereignisse, und notieren Sie die Dauer der jeweiligen Veranstaltung. In Abbildung 3, z. B. Aufzeichnen der Veranstaltung von 0 bis 3.5476 s als das dunkle Ereignis (mit einer Laufzeit von t = 3.5476 s), und notieren Sie das Event vom 3.5476 bis 4.0981 s als helles Ereignis (mit einer Laufzeit von t = 0.5505 s). Wiederholen Sie Vorgang, wie in Tabelle 1dargestellt.</li>
		<li>Die Anzahl der hellen und dunklen Ereignisse für jede Dauer ausgedrückt in die erste und zweite Zeile der Tabelle 2.</li>
		<li>Addieren Sie die Anzahl der Ereignisse für jede Dauer, außer bei Veranstaltungen kürzer als Dauer t. Ausgedrückt in den zweiten und dritten Zeilen der Tabelle 2Summe zum Beispiel die Anzahl der Ereignisse für jede Dauer (außer bei Veranstaltungen für t = 0.0612 s) als 41 + 18 + 9 +...; Das Ergebnis ist gleich die Summe für t = 0.1223 s, d. h. 103.</li>
		<li>Unterteilen Sie die Summierungen von jeder Dauer und normalisieren sie. Wie in Tabelle 2angegeben, z. B. Teilen Sie die Summe für die Dauer t = 0.0612 s durch die Dauer 0.0612 s. Das Ergebnis ist 3,351.5791. Teilen Sie das Ergebnis dann durch die Summe der Ergebnisse in die vierte Zeile in Tabelle 2. Die Wahrscheinlichkeitsverteilung wird abgeleitet, um 0.64494 zu sein.</li>
		<li>Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen für die hellen Ereignisse Pauf(t) gegen ihre Dauer t in einem Logarithmus-Logarithmus Graphen Plotten, und Log10Ppassenauf(t) durch Log10 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg">), die Kraft Gesetz Exponent αauf für eine bestimmte Stelle blinkt abzuleiten. Wenn Pauf(t), durch ausgestattet ist <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg"> </img>, der Anpassungslinie weicht von den Parzellen bei kleinen Werten von Pauf(t), wie gezeigt durch die gestrichelte Linie in Abbildung 4A.</li>
		<li>Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen für dunklen Ereignisse Paus(t) gegen ihre Dauer t in einem Logarithmus-Logarithmus Graphen Plotten, und Log10Paus(t) von Log10(passen <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg"> , die Kraft Gesetzes Exponent αaus und die Trunkierung Zeit τ aus der gleichen blinken vor Ort abzuleiten. Wenn Paus(t), durch ausgestattet ist <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg"> </img>, die angepasste Kurve weicht von den Parzellen bei kleinen Werten von Paus(t).</li>
		<li>Wiederholen Sie 3.2.1 zu 3.2.8 für die anderen blinkende Punkte im Video.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Qian, X. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS:+from+fundamental+mechanisms+to+biomedical+applications.">Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).</li><li>Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+by+surfaced-enhanced+Raman+scattering.">Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering.</a> Chem. Soc. 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Phys. 13, 7439-7448 (2011).</li><li>Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+excitation+laser+intensity+dependence+of+blinking+SERRS+of+thiacarbocyanine+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates+by+using+a+power+law+with+an+exponential+function.">Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function.</a> Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).</li><li>Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+power+law+analysis+of+blinking+SERS+of+thiacyanine+molecules+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates+by+excitation+at+various+wavelengths.">Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths.</a> J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).</li><li>Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+behaviour+of+molecules+in+dark+SERS+state+on+colloidal+Ag+nanoparticles+estimated+by+truncated+power+law+analysis+of+blinking+SERS.">Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).</li><li>Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+blinking+from+multicoloured+SERS-active+Ag+colloidal+nanoaggregates+with+poly-L-lysine+via+truncated+power+law.">Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law.</a> J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).</li><li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Surface+Enhanced+Resonance+Raman+Spectroscopy+of+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein.">Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).</li><li>Weiss, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Dependent+Single-Molecule+Raman+Scattering+as+a+Probe+of+Surface+Dynamics.">Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics.</a> J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).</li><li>Emory, S. R., Jensen, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Chemical+Applications+of+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy:+A+Review.">Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review.</a> Biochemistry. 41, 697-705 (2002).</li></ol>

Der Autor hat nichts preisgeben.

Von der Kreuzung Silber Nanoaggregate wird SERS ausgegeben. Wir müssen also bereiten Sie Nanoaggregates anstatt kolloidale Nanopartikel, die mit Citrat Anionen bedeckt sind. Silber Aggregate werden durch das Einsalzen, Effekt, der durch die Zugabe von Poly-L-Lysin, die NH -3+ und ist der Ursprung der SERS, geformt oder Na+ Kationen aus NaCl, wie in Abbildung S2 des zusätzlichen Materials dargestellt. Darüber hinaus wird zur Beleuchtung der vielen Stellen in den weiten ...

Oberfläche-enhanced Raman-Streuung (SERS) ist hochsensiblen Raman-Spektroskopie von einer edlen Metall-Oberfläche. Da das Raman-Spektrum detaillierte Informationen über molekulare Struktur basierend auf den scharfen Peak-Positionen durch die Schwingungs-Modi von funktionellen Gruppen in den Molekülen liefert kann die Informationen eines einzelnen Moleküls auf einer Metalloberfläche untersucht werden Verwendung von SERS1,2,3. Aus einem silbernen Nanoaggregate mit einem adsorptiv Einzelmolekül-Ebene wird ein Blinksignal1,2,3,4,5,6, beobachtet. 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16und das Spektrum schwankt1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. Blinken kann durch ein einzelnes Molekül induziert werden, die nach dem Zufallsprinzip innerhalb und außerhalb eine verbesserte elektromagnetischen (EM) Feld an einer Kreuzung nanometergroßen Silber Nanoaggregate bewegt. Daher gilt das Blinken einfache Beweise für die Einzelmolekül-Erkennung, verglichen mit einer Technik, die mit einer Poisson-Verteilung von SERS Intensität und eine Bi-Analyt2,3,17. Die detaillierten Mechanismen des blinkenden und schwankenden Spektrums, das molekulare Verhalten auf der Ag-Oberfläche stark abhängen kann, sind jedoch nach wie vor umstritten.
In früheren Studien wurde blinken SERS analysiert mithilfe der Autokorrelationsfunktion, die die Diffusionskoeffizienten und Konzentration der Moleküle, die eine verbesserte EM Feld12,13,14 zunehmenden berechnen können . Darüber hinaus hat der zeitliche Verlauf der Signal-15eine normalisierte Standardabweichung Punktzahl, die Instabilität in die Gesamtintensität darstellt, abgeleitet. Jedoch können diese analytische Ansätze auf das Verhalten von wenigen Molekülen beruhen. Im Gegensatz dazu kann in eine super-Resolution Imaging blinkender SERS, Einzelmolekül-Verhalten in einem erweiterten EM-Feld identifizierten16sein. Allerdings können diese Techniken solche Parameter nur in einer erweiterten EM-Feld erhalten. Das zufällige Verhalten eines einzelnen Moleküls in einem weiten Bereich (z. B. in SERS blinkt) kann als ein Potenzgesetz, anstatt eine durchschnittliche4,5,6,7,8 dargestellt werden ,9,10,11, ähnlich wie blinkende Fluoreszenz aus einem einzigen Halbleiter Quantum Dot (QD)18,19. Durch den Einsatz einer Kraft Gesetz Analyse4,5,6,7,8,9,10,11, molekulare Verhalten kann im hellen Zustand (in der erweiterten EM-Feld) und dunklen Zustand10geschätzt werden; Das heißt, kann das Verhalten des Moleküls Silber vollflächig geschätzt werden.
Für diese Technik sind Silber kolloidales Nanoaggregates verwendeten4,5,6,7,8,9,10,11. Diese Nanoaggregates zeigen verschiedene lokalisierte Oberflächen Plasmon-Resonanz (LSPR)-Bands, die stark verbesserte elektromagnetische Felder beeinflussen, wenn sie aufgeregt bei bestimmten Wellenlängen sind. So erhalten Sie sofort SERS-Active Silber Nanopartikel in kolloidalen Suspension und einige Daten vorhanden sind. Bei einfachen Nanostrukturen, die bestimmte Größen, Formen und Arrangements haben, kann die LSPR Abhängigkeit des SERS blinken andere Abhängigkeiten7verbergen; nämlich, wenn das gut oder schlecht Nanostruktur, LSPR verwendet wird, werden die Parameter konstant, und die anderen Abhängigkeiten werden daher ausgeblendet werden. Kraft Gesetzes Analyse wurde verwendet, um verschiedene Abhängigkeiten von der blinkenden SERS aus Silber kolloidales Nanoaggregates4,5,6,7,8, zu entdecken 9 , 10 , 11.

<table><tbody><tr><td>Silver nitrate, 99.8%</td><td>Wako</td><td>194-00832</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate, 99. %</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;-disulfopropylthiacyanine triethylamine</td><td>Hayashibara Biochemical Laboratories</td><td>NK-2703</td><td>a kind of thiacyanine dyes</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diethyl-5,5&#039;-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt</td><td>Hayashibara Biochemical Laboratories</td><td>SMP-9</td><td>a kind of thiacarobocyanine dyes</td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Dimroth condenser</td><td>Iwaki</td><td>61-9722-22</td><td>perchased from AS ONE</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Corning</td><td>DC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Oil bath</td><td>Advantech</td><td>OS-220</td><td></td></tr><tr><td>Glass plate</td><td>Matsunami</td><td>S-1112</td><td>Microscope slide</td></tr><tr><td>Blower</td><td>Hozan</td><td>Z-288</td><td>Air duster</td></tr><tr><td>Liquid blocker pen</td><td>Daido Sangyo</td><td></td><td>LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-70</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Olympus</td><td>LCPlanFl 60&amp;times;</td><td>NA 0.7</td></tr><tr><td>Dark field condenser</td><td>Olympus</td><td>U-DCD</td><td>NA 0.8&amp;ndash;0.92</td></tr><tr><td>Cooled digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-AG</td><td>controlled by software Aqua Cosmos</td></tr><tr><td>Software for the cooled digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>AquaCosmos</td><td>used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Color CCD camera</td><td>ELMO</td><td>TNC-C920</td><td>not used for analysis</td></tr><tr><td>DPSS laser</td><td>RGB laser system</td><td>NovaPro532-75</td><td>&amp;lambda; = 532 nm;&lt;br/&gt; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2)</td></tr><tr><td>Interference filter</td><td>Semrock</td><td>LL01-532-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Long pass filter</td><td>Semrock</td><td>BLP01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events</td><td>home-maid</td><td></td><td>programmed by C++</td></tr><tr><td>Software for the fitting by a power law</td><td>LightStone</td><td>Origin6.1</td><td></td></tr></tbody></table>

observation and analysis of blinking surface-enhanced raman scattering

Aus einem einzigen Molekül an eine silberne Nanoaggregate-Kreuzung wird blinkend Oberfläche-enhanced Raman-Streuung (SERS) beobachtet. Hier ist ein Protokoll zum Vorbereiten der SERS-Active präsentiert Silber Nanoaggregate, eine Video von bestimmten blinkenden Stellen im mikroskopischen Bild aufzeichnen und analysieren die blinkenden Statistiken. In dieser Analyse reproduziert ein Potenzgesetz Wahrscheinlichkeitsverteilungen für helle Veranstaltungen im Verhältnis zu ihrer Dauer. Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen für dunklen Ereignisse sind durch ein Potenzgesetz mit einer Exponentialfunktion ausgestattet. Die Parameter des Kraft Gesetzes darstellen molekulare Verhalten in hellen und dunklen Staaten. Die Random-Walk-Modell und die Geschwindigkeit des Moleküls über die gesamte Silberoberfläche können geschätzt werden. Es ist schwer zu schätzen, auch bei Verwendung von Durchschnittswerten, Autokorrelation Funktionen und Höchstauflösung SERS Imaging. In Zukunft sollte Kraft Gesetz Analysen mit spectral imaging, kombiniert werden, da die Ursprünge des blinken von dieser Analysemethode allein nicht bestätigt werden können.

Aus der silbernen Nanoaggregates mit Poly-L-Lysin ausgearbeiteten Protokoll 1.2 sind mehrfarbige blinkende Spots von SERS und Oberfläche verbessert Fluoreszenz beobachtet, wie in Abbildung 111gezeigt. Im Gegensatz dazu wurden eintönige farbige blinkende Flecken von SERS mit der Farbstoffmoleküle ausgearbeiteten Protokoll 1.37,8,9,</sup...

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Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der blinkende Oberfläche-enhanced Raman Streuung durch die Irrfahrt eines einzelnen Moleküls auf einer silbernen Oberfläche mittels macht Gesetze.

Beobachtung und Analyse der Oberfläche-enhanced Raman-Streuung zu blinken

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...

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7.3K Aufrufe.  Kwansei Gakuin University. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der blinkende Oberfläche-enhanced Raman Streuung durch die Irrfahrt eines einzelnen Moleküls auf einer silbernen Oberfläche mittels macht Gesetze.

Serie: Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ultrafast pulses, a system that can temporally separate spectrally overlapping signals on a picosecond timescale can isolate promptly arriving Raman scattered light from late-arriving fluorescence light. Here we discuss the construction and operation of a complex nonlinear optical system that uses all-optical switching in the form of a low-power optical Kerr gate to isolate Raman and fluorescence signals. A single 808 nm laser with 2.4 W of average power and 80 MHz repetition rate is split, with approximately 200 mW of 808 nm light being converted to &lt; 5 mW of 404 nm light sent to the sample to excite Raman scattering. The remaining unconverted 808 nm light is then sent to a nonlinear medium where it acts as the pump for the all-optical shutter. The shutter opens and closes in 800 fs with a peak efficiency of approximately 5%. Using this system we are able to successfully separate Raman and fluorescence signals at an 80 MHz repetition rate using pulse energies and average powers that remain biologically safe. Because the system has no spare capacity in terms of optical power, we detail several design and alignment considerations that aid in maximizing the throughput of the system. We also discuss our protocol for obtaining the spatial and temporal overlap of the signal and pump beams within the Kerr medium, as well as a detailed protocol for spectral acquisition. Finally, we report a few representative results of Raman spectra obtained in the presence of strong fluorescence using our time-gating system.

We discuss the construction and operation of a complex nonlinear optical
system that uses ultrafast all-optical switching to isolate Raman from fluorescence
signals. Using this system we are able to successfully separate Raman and fluorescence
signals utilizing pulse energies and average powers that remain biologically safe.

Ablehnung des Fluorescence Resonance Hintergrund in und Spontane Raman Mikrospektroskopie

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Forschung

Biotechnik

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules is reported. The entire sequence of relevant experimental steps is described, involving the fabrication of nanostructured substrates using electron beam lithography, immobilization of biomolecules on the substrates, and their characterization utilizing surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS). Three different designs of nano-biological systems are employed, including protein A, glucose binding protein, and a dopamine binding DNA aptamer. In the latter two cases, the binding of respective ligands, D-glucose and dopamine, is also included. The three kinds of biomolecules are immobilized on nanostructured substrates by different methods, and the results of SERS imaging are reported. The capabilities of SERS to detect vibrational modes from surface-immobilized proteins, as well as to capture the protein-ligand and aptamer-ligand binding are demonstrated. The results also illustrate the influence of the surface nanostructure geometry, biomolecules immobilization strategy, Raman activity of the molecules and presence or absence of the ligand binding on the SERS spectra acquired.

We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.

Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie Detektion von Biomolekülen Mit EBL Fabricated nanostrukturierte Substrate

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

Ingenieurwesen

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as aqueous solutions and biomaterials, with fast acquisition times. Here, we discuss the assembly and operation of a Brillouin spectrometer that uses stimulated Brillouin scattering (SBS) to measure stimulated Brillouin gain (SBG) spectra of water and lipid emulsion-based tissue-like samples in transmission mode with &lt;10 MHz spectral-resolution and &lt;35 MHz Brillouin-shift measurement precision at &lt;100 ms. The spectrometer consists of two nearly counter-propagating continuous-wave (CW) narrow-linewidth lasers at 780 nm whose frequency detuning is scanned through the material Brillouin shift. By using an ultra-narrowband hot rubidium-85 vapor notch filter and a phase-sensitive detector, the signal-to-noise-ratio of the SBG signal is significantly enhanced compared to that obtained with existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables measurement of SBG spectra with up to 100-fold faster acquisition times, thereby facilitating high spectral-resolution and high-precision Brillouin analysis of soft materials at high speed.

We describe the construction of a rapid continuous-wave-stimulated-Brillouin-scattering (CW-SBS) spectrometer. The spectrometer employs single-frequency diode-lasers and an atomic vapor notch-filter to acquire transmission spectra of turbid/non-turbid samples with high spectral-resolution at speeds up to 100-fold faster than those of existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables high-speed Brillouin material analysis.

High-Speed-Dauerstrich-stimulierten Brillouin-Streuung Spektrometer für Materialanalyse

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. SRS imaging modality can be obtained using commercial laser-scanning microscopes by equipping with a non-descanned forward detector with proper bandpass filters and lock-in amplifier (LIA) detection scheme. A schematic layout of a typical SRS microscope includes the following: two pulsed laser beams, (i.e., the pump and probe directed in a scanning microscope), which must be overlapped in both space and time at the image plane, then focused by a microscope objective into the sample through two scanning mirrors (SMs), which raster the focal spot across an x-y plane. After interaction with the sample, transmitted output pulses are collected by an upper objective and measured by a forward detection system inserted in an inverted microscope. Pump pulses are removed by a stack of optical filters, whereas the probe pulses that are the result of the SRS process occurring in the focal volume of the specimen are measured by a photodiode (PD). The readout of the PD is demodulated by the LIA to extract the modulation depth. A two-dimensional (2D) image is obtained by synchronizing the forward detection unit with the microscope scanning unit. In this paper, the implementation of an SRS microscope is described and successfully demonstrated, as well as the reporting of label-free images of polystyrene beads with diameters of 3 &#181;m. It is worth noting that SRS microscopes are not commercially available, so in order to take advantage of these characteristics, the homemade construction is the only option. Since SRS microscopy is becoming popular in many fields, it is believed that this careful description of the SRS microscope implementation can be very useful for the scientific community.

In this manuscript, the implementation of a stimulated Raman scattering (SRS) microscope, obtained by the integration of an SRS experimental set-up with a laser scanning microscope, is described. The SRS microscope is based on two femtosecond (fs) laser sources, a Ti-Sapphire (Ti:Sa) and synchronized optical parametric oscillator (OPO).

Implementierung eines nichtlinearen Mikroskops auf Basis der stimulierten Raman-Streuung

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a nonlinear optical technique for label-free chemical imaging. This analytical tool delivers chemical maps at high speed, and high spatial resolution of thin samples by directly interrogating their molecular vibrations. In its standard implementation, SRS microscopy is narrowband and forms images with only a single vibrational frequency at a time. However, this approach not only hinders the chemical specificity of SRS but also neglects the wealth of information encoded within vibrational spectra. 
These limitations can be overcome by broadband SRS, an implementation capable of extracting a vibrational spectrum per pixel of the image in parallel. This delivers hyperspectral data that, when coupled with chemometric analysis, maximizes the amount of information retrieved from the specimen. Thus, broadband SRS improves the chemical specificity of the system, allowing the quantitative determination of the concentration of the different constituents of a sample. Here, we report a protocol for chemical imaging with broadband SRS microscopy, based on a home-built SRS microscope operating with a custom differential multichannel-lock-in amplifier detection. It discusses the sample preparation, alignment of the SRS apparatus, and chemometric analysis. By acquiring vibrational Raman spectra, the protocol illustrates how to identify different chemical species within a mixture, determining their relative concentrations.

We present a protocol to acquire chemical images with broadband stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. Based on an SRS microscope that operates with differential multichannel-lock-in detection, the protocol describes the sample preparation, adjustment of the SRS apparatus, and chemometrics to disentangle different constituents of chemically heterogeneous samples.

Chemische Multiplex-Bildgebung auf Basis einer breitbandstimulierten Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a nonlinear optical technique for label-free chemical imaging. This analytical tool delivers chemical maps ...

Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging technologies. Hyperspectral SRS and CARS imaging offer Raman spectral information at every pixel, which enables better separation of different chemical compositions. Although both techniques require two excitation lasers, their signal detection schemes and spectral properties are quite different. The goal of this protocol is to perform both hyperspectral SRS and CARS imaging on a single platform and compare the two microscopy techniques for imaging different biological samples. The spectral focusing method is employed to acquire spectral information using femtosecond lasers. By using standard chemical samples, the sensitivity, spatial resolution, and spectral resolution of SRS and CARS in the same excitation conditions (i.e., power at the sample, pixel dwell time, objective lens, pulse energy) are compared. The imaging contrasts of CARS and SRS for biological samples are juxtaposed and compared. The direct comparison of CARS and SRS performances would allow for optimal selection of the modality for chemical imaging.

This paper directly compares the resolution, sensitivity, and imaging contrasts of stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) integrated into the same microscope platform. The results show that CARS has a better spatial resolution, SRS gives better contrasts and spectral resolution, and both methods have similar sensitivity.

Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

Chemie

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...