Die Autoren möchte David Langenau danken für die großzügige Bereitstellung von Aquarium Raum; Eric Stone, John C. Moore und Qin Tang für Hilfe bei Zebrafisch Wartung und Reagenzien, und Anne Robertson und Elliott Hagedorn aus Leonard Zon Labor für die Beschaffung der hier verwendeten Zebrafisch-Stamm. Sie möchte auch Octavio Hurtado für Ratschläge, photolithographische Techniken zu danken. FE wurde durch Stipendien aus Shriner es Krankenhaus für Kinder und der amerikanischen Australian Association finanziert. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert GM92804 zu gewähren.

Mikroinjektion der Larven wurde von der Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care unter Protokoll 2011N000127 genehmigt.
1. Gerät Fertigung
Hinweis: Alle Computer-gestützte (CAD) Zeichnungsdateien verwendet Photolithographie-Masken, die hier beschriebenen entwerfen (Abbildung 1) sind zum Download zur Verfügung. Siehe Tabelle der Materialien für Links.
<ol><li>Den master-Form-Wafer im Reinraum Klasse 1.000 mit Standardtechniken photolithographische7zu fabrizieren. Für die Mikrostruktur Arrays und Kanäle Muster der Epoxy-basierte negativer Photoresist nacheinander in 3 Schichten mit 3 separaten Masken, gemäß den Anweisungen des Herstellers: 100 µm für die flachen Features, 200 µm für die mittlere Features und 400 µm für die Tiefe verfügt. Für das Bildverarbeitungsgerät Schichten Muster zwei mit 400 µm für die flachen Features und 600 µm für die tiefen-Features.</li>
	<li>Kleben Sie den fertige Wafer auf der Basis eines 15 cm Petrischale für das Gießen (Abbildung 2).</li>
</ol>2. Vorbereitung von mikrostrukturierten Oberflächen Arrays - PDMS
<ol><li>Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie Polydimethylsiloxan (PDMS), mit dem Meister Wafer als Form. 50 g PDMS Monomer mit 5 g des Initiators zu kombinieren und mischen in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.</li>
	<li>Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.</li>
	<li>In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.</li>
	<li>Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.</li>
	<li>Schneiden Sie vorsichtig um das Gerät auf dem master Wafer mit einem Skalpell, sicherstellen, dass den Kontakt zwischen der Spitze des Skalpells und der Wafer-Oberfläche zu behalten. Mit Pinzette, Schälen der PDMS-Replikat vom Wafer und Übertragung auf eine saubere 10 cm Petrischale, Funktion Seite nach oben (Abbildung 3).</li>
	<li>Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoffplasma mit einem Plasma-Ofen für 35 s, Hydrophobie zu reduzieren.</li>
	<li>Deckel mit Zebrafish Embryos (E3)-haltigem Medium 168 mg/L von Ethyl-3-Aminobenoate-Methanesulfonate (MS-222, pH 7,5). Entfernen Sie alle Bläschen aus tieferen Funktionen von fließenden Wasser über die Oberfläche des Gerätes mit einer Transferpipette.</li>
</ol>3. Vorbereitung der mikrostrukturierte Oberfläche Arrays - Agarose
<ol><li>Um eine Negativform PDMS zu machen, zuerst behandeln Sie eine PDMS-Gerät mit Sauerstoffplasma.</li>
	<li>
Behandeln Sie das PDMS-Gerät mit 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) Silan Dampf eine inerte Oberfläche8erstellen. Kurz:
	<ol>
<li>Ort der PDMS behandelten Feature-Seite nach oben in einer Vakuumkammer in einer Dampfhaube sein.</li>
		<li>Neben dem PDMS legen eine kleine offene Glas oder Aluminium-Schale und sorgfältig pipette 200 µL des PFDTS (98 % Silan) in die Schüssel. Achtung: PFDTS Silan ist sehr volatil, reagiert heftig mit Wasser, ist brennbar und verursacht schwere Haut- und Schäden auf Kontakt. Lesen Sie Muskel-und Skeletterkrankungen im Detail vor Gebrauch.</li>
		<li>Schließen Sie die Vakuumkammer und gelten Sie Vakuum für 15-30 Minuten, oder bis die PFDTS Silan vollständig verdunstet ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie das Gerät in einer Petrischale und als eine Form für frische PDMS, wie in Schritt 2.1-2.3 beschrieben.</li>
	<li>Backen bei 65 ° C für mindestens 3 h, dann schälen die gesamte Schicht frischen PDMS vom behandelten Gerät und in einer frischen Petrischale. Dies dann als eine Negativform einsetzbar, um Agarose zu werfen.</li>
	<li>Um die Agarose vorzubereiten, Kochen Sie eine 2 % ige Lösung von niedrigen gelierende Temperatur Agarose in E3 in der Mikrowelle bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.</li>
	<li>Die Negativform PDMS übergießen Sie heißen Agarose und entfernen Sie alle Luftblasen in der Agarose für das Gerät durch fließende heißen Agarose über die Features mit einer Transferpipette.</li>
	<li>Sobald Bläschen entfernt werden, im Kühlschrank bei 4 ° C die Agarose festlegen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Agarose-Block aus der Negativform PDMS durch Verformung der PDMS aus unterhalb von hand, übertragen Sie die Agarose-Block auf eine neue Petrischale und nass mit E3 mit MS-222.</li>
</ol>4. Vorbereitung der PDMS Imaging-Geräte
<ol><li>Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie PDMS, mit dem Meister Wafer als Form. Kombinieren Sie 50 g PDMS Monomer mit 5 g der Initiator (gleiche wie in Schritt 2.1 verwendet) und Mischung gründlich in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.</li>
	<li>Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.</li>
	<li>In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.</li>
	<li>Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Geräte aus dem Master-Wafer und Häfen mit einem 1,5 mm Schlag ausstanzen.</li>
	<li>Behandeln die Geräte und einem Glasboden 6-Well gut mit Sauerstoffplasma für 35 Platte s, wie unter Punkt 2.6 beschrieben.</li>
	<li>Verbinden Sie ein Gerät Feature-Side-Down zu jedem Glas Deckglas des 6-Well-Platte, indem es auf eine Herdplatte 85 ° C für 10 min. Hinweis: Zur Bestätigung der erfolgreichen Verklebung Druck fest auf der einen Seite des verbundenen Geräts mit Pinzette. Das Gerät sollte an den Glas-Deckglas bleiben.</li>
</ol>5. Zebrafisch-Kultur
<ol><li>Kultur-Zebrafisch-Embryonen bis 2 Dpf mit Standardtechniken3.</li>
	<li>Dechorionate Embryonen mit Zange oder 1 mg/mL Protease mischen (siehe Materialtabelle)3 mindestens 30-60 Minuten vor der Verladung auf Gerät, damit sie sich zu begradigen.</li>
	<li>Betäuben Sie Embryonen mit (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) durch Zugabe von 25 X 1 mL Stammlösung auf der E3 in der Petrischale.</li>
</ol>6. Ausrichtung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - Divot-Arrays
<ol><li>Vorbereiten des PDMS-Blocks aus Schritt 2.7 (Abbildung 3A) in der Petrischale, derart, dass sie durch eine dünne (1-2 mm) Schicht von E3, fällt die einfachere Handhabung der Embryonen erlaubt.</li>
	<li>Übertragen Sie erforderliche Anzahl von Embryonen (in der Regel 10-20 pro Zustand) auf die Oberfläche des PDMS-Blocks mit einer Transferpipette.</li>
	<li>Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), schieben Sie die Embryonen in mikrostrukturierten Divots (Abb. 3A). Verwendung von Divots eignet sich besonders für dorsalen und ventralen Orientierungen. Hinweis: Für die Divots mit einer strengeren passen (dorsale und ventrale), versuchen die Embryonen auf der Oberfläche des Blocks parallel zu den Divot zu positionieren und dann Rollen sie mit einer Haar-Schleife in Position. Schob sie tiefer in das Divot hilft um sie stabil zu halten.</li>
</ol>7. Orientierung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - mikrostrukturierten Kanäle
<ol><li>Gemustert mit mikrostrukturierten Kanäle (Abb. 3 b) mit einer Transferpipette, bis das Niveau der E3 unter den Rand des Blocks fällt, aber noch vorhanden, in das Reservoir und Kanäle und in einer dünnen Schicht auf die PDMS ist PDMS-Block ziehen Sie E3 ab.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 Embryonen aus Schritt 5.3 in das Reservoir mit einer Transferpipette, ohne dabei die Kanten zu überlaufen.</li>
	<li>Mit einer Haar-Schleife, manipulieren Sie jeder Embryo in den Trichter am Eingang des entsprechenden Kanals zu und orientieren Sie, so dass der Kopf des Embryos in Richtung des Kanals ist und der Embryo die entsprechende Ausrichtung beim Eintritt in den Kanal hat.</li>
	<li>Schieben Sie jedes Embryo ab der Kanal mit einer Haar-Schleife, bis es die orientierende Microfeatures in die Kanalwände, die helfen erreicht, um es in Position zu halten. Nutzung von mikrostrukturierten Kanälen empfiehlt sich besonders für die seitliche Ausrichtung. Hinweis: Um Embryo während Mikroinjektion zu reduzieren, versuchen Sie Anpassung der Höhe der Oberflächenspannung durch E3 aus dem Behälter ziehen.</li>
</ol>8. die Mikroinjektion Zebrafisch
<ol><li>
Mikroinjektion Nadel vorbereiten.
	<ol>
<li>Borosilikatglas Microcapillary Nadeln mit einer Mikropipette Puller als zuvor beschriebenen4zu machen. Die daraus resultierende Nadeln sollten bis zu einem Punkt an einem Ende mit einer konischen Länge von ca. 10 mm abgeschrägt werden.</li>
		<li>Bereiten Sie Lösung injiziert werden, in diesem Fall 100 nM Lockstoffgradient (N-Formylmethionine-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) oder Leukotrien B4 (LTB4)) und 100 nM 70 kDa Rhodamine Dextran Tracer mit PBS-Puffer.</li>
		<li>Laden Sie 5 µL der Lösung in die Nadel mit einer fein konische Pipette Tipp (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Montieren Sie die Nadel in einem Mikromanipulator auf magnetische Stativ montiert und angeschlossen an eine Picopump Microinjector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brechen Sie die Spitze der Nadel in einem 45 °-Winkel durch Kneifen die kegelförmige Spitze mit der Pinzette.</li>
	<li>Passen Sie Injektion Bolus Größe 1 nL durch die Einspritzzeit auf dem Picopump Controller einstellen.</li>
	<li>Stellen Sie den Winkel der Mikroinjektion Nadel. Ein Nadel-Winkel von 45° auf die Mikromanipulation Controller ist im Allgemeinen ein guter Ausgangspunkt, mit der Nadel parallel zu der Länge des Embryos. Ein steilerer Winkel kann verwendet werden, um die seitliche Bewegung des Embryos während der Mikroinjektion zu minimieren.</li>
	<li>Steuerung der Petrischale mit der linken Hand und die Nadel Mikromanipulator mit dem Recht, bringen Sie die Nadel so nah wie möglich an den vorgesehenen Ort der Mikroinjektion, in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel. Hinweis: Die Gleichheitspartei Vesikel kann als längliche Organ posterior für das Auge mit zwei kleineren ausgeprägte dunkle längliche Strukturen (Otolithen) identifiziert werden.</li>
	<li>Mit dem Mikromanipulation Controller durchdringen Sie das Zielgewebe (in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel) zu, so dass die Spitze der Nadel in die Blase und injizieren Sie die voreingestellte Lautstärke mit der Picopump-Fuß-Schalter. Hinweis: Wenn das Gewebe eindringen widersteht, möglichst leichtes Klopfen des Mikromanipulation Controller Knopfes.</li>
	<li>Um die Embryonen zu lösen, fließen Sie E3 über die Oberfläche von oben nach unten mit einer Transferpipette oder durch Schütteln das Gericht, dass die Embryonen in die umliegenden E3 freigesetzt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen ohne MS-222 mit einer Transferpipette auf eine Erholung Schüssel mit E3.</li>
</ol>9. screening von Embryonen mit dem PDMS Imaging-Gerät
<ol><li>Erstklassige Gerät aus Schritt 4.7 durch fließende E3 (+ MS-222) durch den Hafen. Dies kann mit einer 1.000 µL Pipette oder eine schmale Spitze Transferpipette.</li>
	<li>Füllen Sie den Brunnen mit E3 + MS-222, bis das Gerät bedeckt ist.</li>
	<li>Liefern Sie 4 injizierte Embryonen von 8.7 Schritt in jeder gut mit einer Transferpipette. Embryonen können vorher betäubt werden bei Bedarf durch Inkubation in E3 + MS-222 für 1 – 2 min. vor dem Laden (Schritt 5.3).</li>
	<li>Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), richten Sie die Embryonen an den Eingängen der bildgebenden Kanäle in der gewünschten Richtung (Tail-erste oder kopfüber, abhängig vom verwendeten Gerät), und schieben Sie sie teilweise in das Gerät (Abb. 4A). Damit sie gleichmäßig in das Gerät zu ziehen.</li>
	<li>Zeichnen Sie E3 durch das Gerät aus dem Hafen mit 1.000 µL Pipette oder Transferpipette, bis die Embryonen in die Kanäle in der richtigen Ausrichtung für imaging (Abbildung 4 b) gezeichnet werden. Hinweis: Achten Sie darauf, die Embryonen über den Fang Punkt zu saugen, wird die Embryonen schädigen und ihre Ausrichtung ändern.</li>
	<li>Übertragen Sie Well-Platte auf Mikroskop für imaging (Abbildung 4).</li>
	<li>
Bild mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop.
	<ol>
<li>Einstellen Sie Vergrößerung durch Auswahl der entsprechenden Objektiv. 10 X ist in der Regel eine nützliche Vergrößerung für imaging Zebrafisch Neutrophilenzahl Migration.</li>
		<li>Einstellen Sie Intensität der Lichtquelle und Belichtungszeit für jeden Kanal so, dass jedes Signal klar, aber nicht gesättigt ist.</li>
		<li>Die Aufnahmen Sie für jeden Kanal. Hier verwendeten wir grünes fluoreszierendes Protein (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) und Kanäle übertragen. Mehrkanal-Bilder können während der Post-Processing kombiniert werden (Abbildung 4 b-Ich).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Hier beschreiben wir die Verwendung von Geräten wir vor kurzem entwickelt, um 2 Dpf Zebrafisch Mikroinjektion5erleichtern und stellen eine einfache Agarose-freie Halterung für die komfortable Darstellung von Embryonen. Diese Werkzeuge markieren Sie das Dienstprogramm photolithographische Techniken für die Herstellung von Geräten nützlich für Zebrafisch-Techniken.
Wir haben gefunden MSA Geräte besonders nützlich für die Injektion von Zellen oder Partikel anfäll...

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell für viele Bereiche, von der grundlegenden Entwicklungsbiologie, umfangreiche genetische Studien und chemische Bildschirme1,2. Routinemäßige genetische Manipulationen, wie gen-Überexpression, Zuschlag, CRISPR/Cas9 Mutagenese und Transgenese verlassen sich auf Mikroinjektion von genetischem Material in der einzelligen Zygote, die zur Entwicklung von einfachen, leicht zu bedienende, kommerziell geführt hat verfügbare Tools zur Ausrichtung und Stabilisierung von Eiern für Injektion3. Andere Ansätze, wie z.B. Transplantation und Infektion, erfordern oft Mikroinjektion in späteren Embryonen und Larven mit größeren Spurweite Kapillare Nadeln4. Verwendung von größeren g-Nadeln stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen, da es immer schwieriger, das Zielgewebe zu durchdringen, ohne Drücken oder Rollen des Embryos ist. Unter diesen Bedingungen kann Einholung der entsprechenden Wasser Spannung erforderlich, um den Embryo zu stabilisieren, während Trocknung während des Verfahrens zu vermeiden schwierig ist und die Embryonen nicht ideal für die Injektion in das Zielgewebe orientieren.
Nach Mikroinjektion ist es oft sinnvoll, Bildschirm injizierte Embryonen diejenigen auswählen, die erfolgreich injiziert wurde und Bilder von den ersten Zeitpunkt zu erfassen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate entwickelt, die helfen, um 2 Dpf Embryonen in verschiedenen Ausrichtungen Mikroinjektion5, sowohl für schnelle Image-basierten Screening nach der Injektion zu stabilisieren.
Um ausreichende strukturelle Auflösung in diesen Geräten zu erhalten, haben wir photolithographische Techniken verwendet. In mikroelektronischen Industrie und mehr vor kurzem hochgerechnet auf mikrofluidischen Fertigung allgemein verwendet, können diese Ansätze vertikale Strukturen von 1-1.000 µm, einer Skala gut geeignet zur Manipulation von Zebrafisch-Embryonen und Larven bis hin erreichen. Alle Geräte wurden hergestellt mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die billig, körperlich robust, biologisch inert und transparent ist.
Mikrostrukturierte Oberfläche Arrays (MSAs) wurden als Blöcke von PDMS mit einer gemusterten Oberfläche formatiert, analog zu der einfache Kanäle in Agarose Blöcken gebräuchlich für Ei Mikroinjektion. Nach der Injektion Screening können 6 imaging-Geräte in ein standard Glasboden-6-Well-Platte angeordnet. Diese Geräte eignen sich für einfache Befüllung von Embryonen, während der Entlade Verfahren bequem Rettung von bestimmten Embryonen, Erleichterung ermöglicht Image-basierte screening Ansätze in benutzerfreundlicher Weise als diese Geräte zuvor erarbeiteten die Beebe-Labor-6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td></tr><tr><td>Low gelling temperature agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>For casting agarose devices</td></tr><tr><td>PFDTS silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>For casting of negative PDMS molds</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>To anesthetize zebrafish</td></tr><tr><td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>To trace microinjections</td></tr><tr><td>Leukotriene B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>For Casting from the master wafer</td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>For imaging devices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass microcapillaries</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>For microinjection needles</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>For transferring zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Fisher scientific</td><td>E5242956003</td><td>For loading the microinjection needles</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>To punch ports in PDMS imaging devices</td></tr><tr><td>No. 11 Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>For cutting PDMS</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td></tr><tr><td>Marzhauser Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>For manipulating microinjection needle</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>For mounting micromanipulator</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>To control microinjection volume and timing</td></tr><tr><td>EVOS inverted fluorescent microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>To image injected embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>For visualizing microinjecion</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Download AutoCAD files from: https://dx-doi-org.bdigitaluss.remotexs.co/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell der verschiedenen menschlichen Krankheiten und ein nützliches Werkzeug für eine zunehmende Anzahl von experimentellen Studien über grundlegende Entwicklungsbiologie durch zu großen genetischen und chemischen Bildschirme. Allerdings setzen viele Experimente, insbesondere im Zusammenhang mit Infektionen und Xenograft Modelle auf Mikroinjektion und Bildgebung von Embryonen und Larven, die aufwändige Techniken sind, die Fähigkeit und Kompetenz erfordern. Um die Präzision und den Durchsatz des aktuellen Mikroinjektion Techniken zu verbessern, entwickelten wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate zu orientieren und zu stabilisieren Zebrafisch-Embryonen im 2 Tage Post Düngung (Dpf) ventral, dorsal oder seitliche Ausrichtung vor der Verfahren. Um die Darstellung der Embryonen zu erleichtern, haben wir auch ein einfaches Gerät mit Kanälen, die 4 Zebrafisch seitlich parallel gegen ein Glas Deckglas orient entwickelt. Zusammen, belegen die Werkzeuge, die wir hier präsentieren die Wirksamkeit photolithographische Ansätze um nützliche Geräte für die Optimierung von Zebrafisch-Techniken zu generieren.

Der hier beschriebene Ansatz zeigt die Konstruktion (Abbildung 1) und Herstellung von Geräten für den Einsatz mit 2 Dpf Zebrafisch, photolithographische (Abbildung 2) und weichen lithografischen (Abbildung 3) Techniken. Mit dieser Methode können Schnelltests vieler Design-Iterationen und Änderungen und Umbauten und Optimierung der Mikrostruktur Dimensionen für die Verwendung mit Zebrafisch auf a...

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Serie: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Forschung

Biotechnik

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Entwicklungsbiologie

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Neurowissenschaften

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune cell migration. Microfluidic devices are used for entrapment to support long-term imaging of multicellular organisms, including zebrafish. However, the fabrication of these devices using soft lithography requires specialized facilities and competency in 3D printing, which may not be accessible to every lab. Our adaptation of a previously developed low-cost polyethylene terephthalate lamination method for constructing microfluidic devices increases accessibility by enabling design fabrication and iteration for a fraction of the technical investment of conventional techniques. We use a device made with this method, the Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), to accommodate drug treatment, manual wounding, and long-term imaging of up to four embryos in the same field of view. With this new design, we successfully capture gross morphological characteristics of the calcium&#160;signal around laser ablation and manual transection wounds for multiple embryos in the 2 h immediately following injury, as well as neutrophil recruitment to the wound edge for 24 h.

An innovative method for fabricating microfluidic devices using polyethylene terephthalate (PET) lamination significantly reduces the cost and complexity of entrapping and imaging multiple live zebrafish embryos.

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune ...