Name: measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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Wir danken der Lewis-Sigler-Institut für Integrative Genomics Sequenzierung Core Facility an der Princeton University für technische Beratung und RNA Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Rowan University und NIH NIGMS R15GM113187, M.J.H.

1. Induktion Hypoxie
<ol><li>Einen Tag oder mehr vor der Hypoxie zeitlicher Verlauf: bereiten Sie den Brutkasten, Zell-Filter System, Vakuum, Gas-Tank, Fläschchen, Stopper, Glasröhren und Schlauch, wie in der Materialtabelle.</li>
	<li>Ort der N2 Tank, Inkubator, Vakuum und Filtersystem in unmittelbarer Nähe, schnelle Bearbeitung von Zellen aktivieren.</li>
	<li>Bereiten Sie sterile Flüssigmedien YPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Glukose) durch Mischen der Komponenten in einer Glasflasche und Autoklavieren.</li>
	<li>Grundriss der Flaschen in den Inkubator. Hinweis: Aus dem N-2 -Tank, der erste Kolben werden einen Wasserabscheider wird, der zweite Kolben der letzte Zeitpunkt, die dritte Flasche werden bis zum vorletzten Mal Punkt und so weiter bis die letzte Flasche die endgültige Wasserabscheider ist. Abbildung 1 zeigt die Reihenfolge und die Verbindungen zwischen den Kolben.</li>
	<li>Impfen Sie am Vortag den zeitlichen Verlauf eine Hefe-Kolonie in eine Kultur von 5 mL Flüssigkeit YPD in ein steriles Röhrchen. Holen Sie insbesondere eine vollständige Kolonie von einer Platte mit einem sterilen Applikator-Stick ab. Legen Sie den Stick in die flüssige YPD und schütteln Sie den Stick, bis die meisten Zellen in der Schwebe sind.</li>
	<li>Drehen Sie die Rohre bei 30 ° C über Nacht (~ 16 h). Hinweis: Nach 16 h, werden Wildtyp Zellen Sättigung (~ 2 x 108 Zellen/mL), gekennzeichnet durch eine stark bewölkt Kultur erreichen. Andere Stämme können länger dauern, Sättigung erreichen und sollte durch Messung der Zellkonzentration mit einem Spektrophotometer getestet werden, wie in Schritt 1.9.4 angegeben.</li>
	<li>Am Tag der zeitliche Verlauf nach 16 h Inkubation, verdünnen die gesättigte Kultur über Nacht 01:50 mithilfe einer 5 mL pipettieren, 4 mL platzieren Kultur in 196 mL flüssige YPD innerhalb einer steril 500 mL Flasche. Wachsen Sie mit Schütteln bei ~ 200 u/min für 4 h bei 30 ° C. Hinweis: Nach 4 h erreichen eine Wildtyp-Kultur eine Mid Log Konzentration von ~ 1-2 x 107 Zellen/mL.</li>
	<li>Während der 4 h Inkubation beschriften Sie die Fläschchen (für Hypoxie und Wasser fallen) und die 50 mL Röhrchen. Wenn der Inkubator in 1.7 Schritt oben nicht für den zeitlichen Verlauf von Hypoxie verwendet wird, schalten Sie die anderen Inkubator und setzen auf 30 ° C.</li>
	<li>
Kurz vor Zellen Hypoxie zu unterwerfen:
	<ol>
<li>Fügen Sie hinzu ~ 50 mL Wasser, zwei sterile 250 mL-Flaschen dienen als die Wasserfallen werden.</li>
		<li>Füllen Sie 1/3 des Eises Eimer mit flüssigem Stickstoff und Tauchen Sie eine Polystyrol-Hartschaum-Rack um 50 mL Zentrifuge Röhren zu halten.</li>
		<li>Richten Sie das Filtersystem für das Sammeln von Zellen. Fügen Sie eine Sterilfilter Disc auf der unteren Einheit des Filtersystems mit einer sterilen Pinzette, achten Sie darauf, nur die Kanten der Filterscheibe berühren. Die Filtereinheit oberen auf die unteren Filtereinheit und mit den Klemmen mit dem System zur Verfügung gestellt. Stellen Sie sicher, dass die unteren und oberen Einheiten ausgerichtet sind, so dass es eine gute Abdichtung und keine Leckage.</li>
		<li>Messen Sie die Zellkonzentration mit einem Spektrophotometer. Verdünnen Sie Zellen, so dass sie im linearen Bereich des Spektralphotometers – OD600 zwischen ~0.2 - 0,6, je nach dem Spektralphotometer gemessen werden können. Hinweis: Eine OD600 Einheit ist ~ 3 x 107 Zellen/mL, je nach Zellmorphologie und Spektralfotometer. Eine Konzentration von ~ 1-2 x 107 Zellen/mL wird erwartet, entspricht OD600 ~0.33 - 0,66.</li>
		<li>
Erhalten Sie schnell die Zeitprobe 0.
		<ol>
<li>Verbinden Sie das Filtersystem mit starken (~ 10 Mbar) Vakuum über Vakuumschlauch und 1.000 mL Flasche Falle. Schalten Sie das Vakuum. Die obere Einheit die Kultur (in der Regel ~ 20 mL) gießen und warten, bis die Flüssigkeit durch den Filter gezogen werden (~ 10 s, je nach Stärke des Vakuums).</li>
			<li>Vorsichtig entfernen Sie die Filterscheibe mit sauberen Pinzette und setzen Sie in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Legen Sie die Zentrifugenröhrchen sofort in das Rack in flüssigen Stickstoff getaucht. Wichtig ist, nicht vorab chill die Rohre vor dem Einsetzen des Filters, da die Rohre explodieren werden.</li>
			<li>Nach > 30 s, Ort der Röhre in einem-80 ° C Gefrierschrank für die späteren RNA-Extraktion. Reinigen Sie nach jeder Filtration und wieder zusammenbauen Sie, das Filtersystem. Spülen Sie das System von durchziehen Wasser für 10 s ohne eine Filterscheibe. Zu guter Letzt trocknen Sie das System mit einem Papiertuch.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verdünnen Sie die 4 h-Kultur in verschiedenen Fläschchen für die verschiedenen Zeitpunkte, damit jedem Kolben Mitte Log Konzentration (~ 1-2 x 107 Zellen/mL) zum angegebenen Zeitpunkt der Hypoxie erreicht. Hinweis: Die Tabelle 1 zeigt Verdünnungen, die für die Wildtyp S288C HAP1+ haploiden Belastung verwendet wurden. Es wird empfohlen, jede Belastung in diesen hypoxischen Kulturbedingungen zu testen und die Verdünnungen entsprechend anpassen.</li>
		<li>Sobald Zellen und Medien Fläschchen hinzugefügt werden, ersetzen Sie die Aluminiumfolie abdecken der Küvette öffnen mit einem Stopfen mit zwei Glasröhren eingefügt.</li>
		<li>Platzieren Sie die Fläschchen in den Inkubator in das Layout bestimmt früher.</li>
		<li>Sicher verbinden Sie den Schlauch, wie in Abbildung 1dargestellt.</li>
		<li>Überprüfen Sie, dass die Stopper fest in die Küvette Öffnungen herausgedrückt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Zeit 0 öffnen Sie das Regulierventil. Legen Sie den Durchflussmesser auf 3 L/min. Hinweis: Sprudeln wird in beiden Flaschen Wasser beobachtet richtige Gasstrom angibt. Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie alle Verschlüsse sind eng und Schlauch ist ordnungsgemäß angeschlossen.</li>
	<li>Schließen Sie den Inkubator und die Schütteldrehzahl auf ~ 200 u/min festgelegt. Einen Timer gestartet wird.</li>
	<li>Richten Sie vor jeden Zeitpunkt das Filter-System wie oben in Schritt 1.9.3 beschreiben.</li>
	<li>
Haben Sie zu jedem Zeitpunkt (z.B., 5 min, 10 min, etc.) zwei Personen schnell die Zellen wie folgt bearbeiten:
	<ol>
<li>Ego: den entsprechende Kolben aus der Halterung zu entfernen und den Stopfen (mit Glasrohr angeschlossen). Hinweis: Dies nicht den Fluss der N2 einer der verbleibenden Kulturflaschen bricht aber unterbricht vorübergehend die Strömung zu der letzten Wasserabscheider.</li>
		<li>Zweite Person: Pipettieren 1 mL der Kultur und in eine Küvette zu verzichten. Schließen Sie den Schlauch aus der Kultur-Flasche, die jetzt am Ende der Zeile bis zum letzten Wasserabscheider (eine Röhre und ein Stopfen wird dabei entfernt werden.). Dann messen Sie Zellkonzentration in der Küvette, wie oben in Schritt 1.9.4 beschrieben.</li>
		<li>Ego: Gießen Sie den Rest der Kultur in der Vakuumfiltration System, und führen Sie dann filtern und Einfrieren, wie oben in Schritt 1.9.5 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind mit den Zeitpunkten, schalten Sie das N2 Gas. Schließen Sie zunächst den Regler und warten Sie, bis der Druck zum lösen, und dann schalten Sie den Durchflussmesser. Schließlich zerlegen Sie das System zu und reinigen Sie alle Materialien mit Wasser und dann 70 % Ethanol.</li>
</ol>2. RNA-Extraktion
<ol><li>Bereiten Sie RLT-Puffer zur Reinigung von RNA-Spalte, wie in der Materialtabellebeschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie eine funktionierende Lösung der DNase durch Zugabe von 10 µL der DNase Vorratslösung zu 70 µL Puffer RDD pro Probe (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Entfernen Sie die 50 mL Röhrchen mit Filter und Zellen von-80 ° C Gefrierschrank zu und auf Eis auftauen (ca. 15 min). Führen Sie die folgenden Schritte mit Röhren auf dem Eis.</li>
	<li>Beschriften Sie 2 mL Schraubverschluss Röhrchen und legen Sie sie auf dem Eis, eine Röhre für jede Probe. Jedes Rohr, mit einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu schöpfen und messen die Perlen fügen Sie ~0.6 mL säuregewaschen Perlen hinzu.</li>
	<li>Die 50 mL Röhrchen 0,6 mL kaltem Puffer RLT hinzufügen.</li>
	<li>Pipettieren rauf und runter zu Zellen aus Filter entfernen und suspendieren in Lösung. Lassen Sie den Filter in der Lösung bleiben, da der Filter wird die Lösung einweichen. Entfernen Sie alle Lösung absorbiert in den Filter mithilfe der Pipettieren Spitze, um den Filter gegen die Wand des Rohres zu quetschen.</li>
	<li>Übertragen Sie alle Flüssigkeit aus der 50 mL-Tube, der Schraubverschluss-Röhrchen mit Perlen.</li>
	<li>Legen Sie die Schraubverschluss-Röhrchen in eine Korn-Mühle-Homogenisator und 1 min laufen lassen. Legen Sie sofort die Röhren für 3 min auf Eis. Wieder, setzen Sie die Rohre in den Homogenisator und 1 min laufen lassen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Rohre aus den Homogenisator und Platz für 5 min auf Eis. Die Perlen werden auf den Boden der Röhrchen abrechnen.</li>
	<li>Führen Sie die restlichen Schritte bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Mit einem Pipettieren übertragen nur die lysate (~ 350 µL), die Perlen zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu vermeiden.</li>
	<li>Microcentrifuge für 2 min bei max. Drehzahl und übertragen Sie dann den Überstand zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Fügen Sie 1 Volumen von 70 % Ethanol (aus 200 Beweis Molekularbiologie-Klasse Ethanol). Mischen Sie gut durch pipettieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Lösung und einem Niederschlag einer RNA-Spalte, die in einem 2 mL Sammlung Rohr platziert wurde.</li>
	<li>Zentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten (die Flüssigkeit im Rohr).</li>
	<li>Die Spalte 350 µL Puffer RW1 hinzufügen. Zentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten.</li>
	<li>Fügen Sie 80 µL DNase ich Inkubation mischen, um die Spalte-Membran (nicht bekommen, auf Seiten des Rohrs) und für 15 min sitzen lassen.</li>
	<li>Spalte 350 µL Puffer RW1 hinzufügen. Microcentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen der durchströmten.</li>
	<li>Die Spalte 500 µL Puffer RPE hinzufügen. Microcentrifuge für 15 s bei ≥12, 000 X g und entsorgen Durchflussverfahren.</li>
	<li>Die Spalte 500 µL Puffer RPE hinzufügen. Microcentrifuge für 2 min bei ≥12, 000 X g.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie die Spalte und legen Sie in eine neue 2 mL Sammelröhrchen. Microcentrifuge auf Hochtouren für 1 min (um die Membran vollständig zu trocknen).</li>
	<li>Entsorgen Sie das Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Die Spalte Membran 30 µL RNase-freies Wasser hinzufügen.</li>
	<li>Eluieren Sie die RNA aus der Spalte von Microcentrifuging für 1 min bei ≥12, 000 X g. Beim Laden der Spalten in der Microcentrifuge sicherstellen Sie, dass die Deckel von dem Sammelrohr in Richtung stehen die Zentrifuge dreht sich um die Lider Abbruch zu verhindern.</li>
	<li>Hinzu kommt ein weiterer 30 µL RNase-freies Wasser der Spalte Membran, unter Beibehaltung der Spalte in der gleichen Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Microcentrifuge für 1 min bei ≥12, 000 X g, so dass die endgültige Eluat Lautstärke 60 µL.</li>
	<li>Speichern Sie jede 1,5 mL Röhrchen mit 60 µL RNA in den-80 ° C Gefrierschrank.</li>
</ol>3. Bestimmung der RNA-Konzentration und Qualität
<ol><li>Messen Sie die Konzentration von RNA und DNA in jeder RNA-Probe mit (a) Fluorometer, (b) DNA und RNA-spezifische fluoreszierende Farbstoffe und (c) Assay Röhren, wie in der Materialtabelleaufgeführt. Folgen Sie den Anweisungen der Fluorometer und Farbstoffe.</li>
	<li>Alternativ messen die Nukleinsäure-Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer setzen bei 260 nm. Hinweis: Eine A-260 -Lesung von 1,0 entspricht ~ 40 µg/mL einsträngige RNA.</li>
	<li>RNS-Qualität testen, indem Sie die RNA auf einem kommerziellen Nukleinsäure-Analysator ausgeführt (siehe Materialtabelle) oder auf einem standard Formaldehyd/Agarose gel 26.</li>
</ol>(4) RNA-Seq-Analyse
<ol><li>Bilden Sie aus den Gesamtbestand der RNA 21 µL von 100 ng/µL RNA in RNase-freies Wasser. Verwenden Sie 1 µL von diesem 21 µL, um die RNA-Konzentration wie oben beschrieben zu testen. Senden Sie die restlichen 20 µL (2 µg) gesamte-RNS eine externe Sequenzierung Center für mRNA Bereicherung, Strang-spezifischen Bibliothek Vorbereitung (mit acht oder mehr Barcodes für multiplexing) und Sequenzierung (siehe Materialtabelle). Alternativ lokal führen Sie mRNA Bereicherung und Bibliothek Vorbereitung aus, und senden Sie die Bibliothek für die Sequenzierung.</li>
	<li>Pool acht oder mehr gemultiplexten Proben und Sequenz in eine Spur der nächsten Generation Sequenzer.</li>
	<li>Laden Sie die FASTQ-Datei mit allen von der Sequenz liest und der entsprechende Index liest. Außerdem laden Sie die Textdatei mit den Multiplex-Barcodes. Hinweis: Der Index liest können in einer separaten Datei FASTQ vorhanden sein. Legen Sie alle diese Dateien in einem Verzeichnis.</li>
	<li>Legen Sie das Shell-Skript zur Verfügung gestellt hier, "fastq_pipeline.sh" im gleichen Verzeichnis. Bearbeiten Sie das Skript als angemessen für das Experiment und die Computer-Verzeichnisse. Hinweis: dieses Skript enthält umfangreiche Anmerkungen die Schritte erklären. In Kürze die Skript-Qualität trimmt die liest, ordnet der liest das Genom und erzeugt eine tabulatorgetrennte Datei, enthält die Anzahl der Lesevorgänge pro gen für jede Probe.</li>
	<li>Die FASTQ Dateien und raw lesen Sie Zähldaten auf NCBIs Gene Expression Omnibus vor Veröffentlichung 27einzahlen. Befolgen Sie die Anweisungen für "Submitting Hochdurchsatz-Sequenzdaten, GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>Importieren Sie die gelesenen Daten in R statistische Umwelt und führen Sie statistische Analyse mit dem R-Skript zur Verfügung gestellt hier, "Time_course_script. R". Bearbeiten Sie das Skript als angemessen für das Experiment und die Computer-Verzeichnisse. Hinweis: Dieses Skript enthält umfangreiche Anmerkungen die Schritte erklären. Kurz gesagt, dieses Skript importiert die gelesenen Daten, normalisiert das liest, Gene, die im Laufe der Zeit erheblich ändern, führt PCA Analyse und Grafiken die Expression von ausgewählten Genen identifiziert.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie wurde die mRNA-Niveaus für alle Gene während Hypoxie in der Hefe S. Cerevisiaegemessen. Ziel war es, wie die globalen Veränderungen der Genexpression durch Wachstum in einer kontrollierten Umgebung in der Nähe von anoxischen analysieren. Mehrere Maßnahmen wurden ergriffen, um sicherzustellen, dass die hier beschriebene Methode sorgfältig kontrolliert und reproduzierbar war. Erstens Zellen einer genau definierten hypoxischen Umgebung ausgesetzt waren: 99,999 % N2 in rich-Media (Y...

Viele Organismen reagieren auf Hypoxie oder niedrigen O2, durch die Veränderung der gen-Expression- 1,-2,-3. Diese Antwort hilft Zellen, die mit dem Mangel an ein Substrat für die aerobe Atmung und für mehrere biosynthetischen Reaktionen von entscheidender Bedeutung, sondern auch mit einem wechselnden Redox-Zustand 4zu bewältigen. Mehrere Studien in S. Cerevisiae Microarray zeigen, dass die mRNA-Niveaus von Hunderten von Genen in Erwiderung auf Hypoxie 5,6,7,8,9 ändern , 10 , 11 , 12. vor kurzem RNA-Seq wurde verwendet, um Veränderungen der Genexpression im Laufe der Zeit während der Hypoxie 13charakterisieren. Hier werden die experimentellen Details präsentiert und diskutiert.
Hypoxie kann auf verschiedene Weise, jeder produziert eine andere Ebene der O2erreicht werden. Hier, gründete Hypoxie kontinuierlich fließenden ultra-high-Reinheit N2 in Flaschen, die [O2] senkt sofort mit reproduzierbaren Kinetik 10aufgelöst. Es ist möglich, dass es einige O2 Moleküle, die Stoffwechsel und die Genexpression beitragen, aber dieses Umfeld sehr in der Nähe von anaeroben als. In Ermangelung von O2nicht Hefezellen Biosynthese Häm, Ergosterin und ungesättigten Fettsäuren 4,12,14. Frühere Studien haben daher diese Metaboliten aufgenommen, beim Anbau von Hefe ohne Sauerstoff 5,10,15. Jedoch viele hypoxische Antworten sind durch Erschöpfung dieser Metaboliten vermittelt und somit ergänzen sie kehrt die hypoxischen gen Ausdruck Antworten 12,16. Um natürliche Hypoxie zu imitieren, waren diese Metaboliten die Medien nicht hinzugefügt. In der kurzen Zeit, dass Zellen Hypoxie ohne das Vorhandensein dieser wichtige Metaboliten ausgesetzt waren gab es keine spürbaren Zelltod (Daten nicht gezeigt) noch ein längerer Stress-Reaktion- 13.
Die Antwort ist ebenfalls abhängig von der Belastung und der Genotyp. Besonders wichtig sind die Allele der bekannten Regulatoren von hypoxischen Antworten 2. S288C Belastung Hintergrund ist sehr gewünscht, so dass Ergebnisse mit den anderen genomischen Studien mit dieser Sorte verglichen werden können. S288C enthält jedoch ein teilweiser Verlust der Funktion Allel der HAP1 gen 17, kritische transcriptional Regulator für die hypoxischen Antwort. Dieses Allel wurde repariert, in S288C mit einem Wildtyp Kopie aus dem Σ1278b Stamm Hintergrund 11.
Genexpression ist stark abhängig von der zellulären Umgebung. Genomweite mRNA Analyse durchführen, ist es daher wichtig, eine konstante Umgebung beizubehalten und gleichzeitig die unterschiedlichen ein weiterer Parameter wie Zeit, Anregung oder Genotyp. Um hoch reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, betrachten Sie diese drei Methoden für die Untersuchung und aller seiner biologischen oder technischen Wiederholungen. Erstens sollten die gleichen Experimenter(s) Durchführung der Studie, da technische Verfahren über Experimentatoren variieren. Zweitens sollte die gleiche Charge von Zutaten in den Wachstumsmedien verwendet werden, da jede Charge hat eine etwas andere Zusammensetzung, die Genexpression beeinflussen können. Drittens um Zellzyklus Auswirkungen zu minimieren, sollte jeden Zeitpunkt des asynchronen Zellen in der Mitte des Log-Phase des Wachstums (1-2 x 107 Zellen/mL) bestehen.
Wenn eine komplexe Antwort wie die gen-Ausdruck-Reaktion auf Hypoxie zu charakterisieren, ist ein zeitlichen Verlauf vorteilhaft für die Bestimmung der Kinetik der verschiedenen Veranstaltungen. Bestimmten Zeitpunkten sollte gewählt werden, die die wichtigsten Änderungen der Antwort zu erfassen. In dieser Studie wurden Zeitpunkten zwischen 0 und 4 h beobachtet, weil letzten Experimente weit verbreitete Änderungen in der Genexpression während diesem Zeitraum 13 zeigten.
Zur Messung der globalen Genexpression wurde RNA-Seq gebrauchte 18,19. Diese Methode nutzt Next Generation Sequencing, um die relative Häufigkeit jedes Gen Niederschrift zu bestimmen. Im Vergleich zu DNA-Microarray Analyse, weist RNA-Seq höhere Empfindlichkeit (, weniger reichlich Transkripte zu erkennen), einen größeren Dynamikbereich (um größere Falte Veränderungen zu messen) und hervorragende Reproduzierbarkeit (, Genexpression im Laufe der Zeit genau zu folgen). In der Regel ist die zelluläre RNA ribosomalen RNA, die so viele Methoden entwickelt wurden, um für spezifische RNA Arten 20bereichern. Hier, Poly-T Perlen wurden verwendet, um Poly-A-haltige mRNA Transkripte, obwohl die verschiedenen kommerziell zu reinigen - erhältlichen rRNA Erschöpfung Kits könnte auch wirksam bei der mRNA Bereicherung sein.
Hier zeichnete sich die S. Cerevisiae gen Ausdruck Reaktion auf Hypoxie. Zellen Hypoxie ausgesetzt waren und dann zu acht Zeitpunkten abgetastet (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 und 240 min). Reproduzierbarkeit zu bestätigen und um statistisch veränderte Abschriften zu identifizieren, wurden drei biologische Wiederholungen durchgeführt. RNA wurde durch mechanische Störungen und Spalte Reinigung extrahiert und dann für die Analyse der RNA-Seq verarbeitet. Die Post-Sequenzierung Pipeline wird beschrieben und Programmierung Skripte werden bereitgestellt, mit denen die exakte Replikation der Analysen durchgeführt. Speziell, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R statistische Umgebung 24und die DESeq2 Paket 25 dienten, die RNA-Seq-Daten verarbeiten und 607 Gene zu identifizieren, die wesentlich zu, während verändern Hypoxie. Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Genexpression von der Wiederholungen angegeben die Reproduzierbarkeit der Technik. Clustering und Heatmaps offenbart weit reichende Ausdruck Kinetik, während gen Ontology (gehen Sie) Analyse zeigte, dass viele zelluläre Prozesse, wie Atmung, in den Sauerstoff-regulierten Genen angereichert sind.

<table><tbody><tr><td>Enclosed dry incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Set at 30 &amp;deg;C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.</td></tr><tr><td>Micro-analysis Filter Holder</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask</td></tr><tr><td>Strong vacuum</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>The &amp;ldquo;house&amp;rdquo; vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.</td></tr><tr><td>1,000 mL flask</td><td></td><td></td><td>To act as vacuum trap.</td></tr><tr><td>~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.</td></tr><tr><td>High-pressure N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td></td><td></td><td>99.999% purity, &gt;1,000 psi, with a regulator and gas flow controller</td></tr><tr><td>Autoclaved 500 mL flask</td><td></td><td></td><td>Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.</td></tr><tr><td>Autoclaved 250 mL flasks</td><td></td><td></td><td>Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.</td></tr><tr><td>Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.</td></tr><tr><td>Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.</td></tr><tr><td>~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.</td></tr><tr><td>Sterile filter discs</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm diameter, 0.45 &amp;micro;m pore size, one for each time point</td></tr><tr><td>Sterile dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL cuvettes</td><td></td><td></td><td>For measuring OD600 (i.e., cell concentration)</td></tr><tr><td>50 mL sterile centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>One for each time point</td></tr><tr><td>Clean and sterile tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>acid-washed beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C for lysing cells</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For RNA column purification</td></tr><tr><td>Qiagen RLT buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare by adding 10 &amp;micro;L of &amp;beta;-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>2 mL collection tubes</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I stock and working solutions</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 &amp;micro;L of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 &amp;deg;C) in single-use aliquots (80 &amp;micro;L each). The stock solution should not be thawed and refrozen.</td></tr><tr><td>Buffer RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen DNase Kit</td></tr><tr><td>Ice cold 2 mL screw-cap tubes</td><td></td><td></td><td>For lysing cells during RNA extraction</td></tr><tr><td>bead mill homogenizer</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Keep in cold room</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Commercial electrophoresis system</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>for measuring nucleic acid quality</td></tr><tr><td>Next-generation sequencer</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>for sequencing libraries</td></tr><tr><td>automated liquid handling system</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>for creating sequencing libraries</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>for isolating mRNA from total RNA</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA</td></tr><tr><td>Barcode Splitter</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&amp;amp;changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, which includes the gzip command</td><td></td><td></td><td>http://www.htslib.org/download/</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (installed before TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (installed before R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (free version)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response

Komplexe Änderungen in der Genexpression zu vermitteln in der Regel einen Großteil eine zelluläre Reaktion. Jedes Gen kann Ausdruck mit einzigartigen Kinetik ändern, da das Gen durch den bestimmten Zeitpunkt einer der vielen Reize, Signalisierung, Wege oder Nebenwirkungen geregelt ist. Um das gesamte gen einzufangen war Ausdruck Reaktion auf Hypoxie in der Hefe S. Cerevisiae, RNA-Seq-Analyse verwendet, um die mRNA-Niveaus aller Gene zu bestimmten Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber Hypoxie zu überwachen. Hypoxie entstand durch wachsenden Zellen in ~ 100 % N2 Gas. Wichtig ist, wurden im Gegensatz zu anderen hypoxischen Studien, Ergosterin und ungesättigten Fettsäuren nicht zu den Medien hinzugefügt, da dieser Metaboliten Genexpression beeinflussen. Zeitpunkten wurden im Bereich von 0 - 4 h nach Hypoxie ausgewählt, weil damals die wichtigsten Änderungen in der Genexpression erfasst. Zu jedem Zeitpunkt Mitte Log hypoxische Zellen waren schnell gefiltert und eingefroren, Begrenzung der Exposition gegenüber O2 und damit einhergehende Veränderungen der Genexpression. Gesamt-RNS war aus Zellen extrahiert und verwendet, um bereichern für mRNA, die dann in cDNA umgewandelt wurde. Aus diesem cDNA Multiplex-Bibliotheken erstellt wurden und mindestens acht Proben wurden in einer Spur von einer nächsten Generation Sequenzer sequenziert. Eine Post-Sequenzierung Pipeline wird beschrieben, worunter Qualität Basis trimmen, Kartierung und Bestimmung der Anzahl der Lesevorgänge pro gen zu lesen. DESeq2 innerhalb der statistischen R-Umgebung wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die an einem hypoxischen Zeitpunkten wesentlich verändern. Analyse von drei biologische Wiederholungen zeigte hohen Reproduzierbarkeit, Gene der unterschiedlichen Kinetik und eine große Anzahl von erwartet O2-Gene reguliert. Diese Methoden können zur Untersuchung, wie die Zellen der verschiedenen Organismen auf Hypoxie im Laufe der Zeit reagieren und angepasst, um gen-Expression in anderen zellulären Reaktionen zu studieren.

Die Hypoxie zeitlichen Verlauf und RNA-Seq-Analyse wurden unabhängig dreimal durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der drei Wiederholungen zu untersuchen, wurde Genexpressionsdaten für alle Gene mit Principal Komponente Analysis (PCA) analysiert. Abbildung 2 zeigt, wie die Proben über die ersten beiden Hauptkomponenten verändern die 58,9 % der Variabilität darstellen. Diese Analyse ergab, dass jeder zeitlichen Verlauf ähnliche Veränderungen zeigt (w...

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit RNA-Seq, um mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der hypoxischen Antwort von S. Cerevisiae Zellen zu überwachen. Diese Methode kann zu analysieren, gen-Expression in eine zelluläre Reaktion angepasst werden.

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

8.2K Aufrufe.  Rowan School of Osteopathic Medicine. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit RNA-Seq, um mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der hypoxischen Antwort von S. Cerevisiae Zellen zu überwachen. Diese Methode kann zu analysieren, gen-Expression in eine zelluläre Reaktion angepasst werden.

Serie: Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Forschung

Biochemie

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetik

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

Im lebenden Organismus Überwachung der transkriptionellen Aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter in Hefe

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biologie

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Zusammenfassung

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