R. W. H. V wurde von der McGill Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) Schulungsprogramm in Bionanomachines unterstützt. A. K. M. und P. E. J. wurden von NSERC Zuschüsse 327028-09 (A. K. M) und 238562 (P. E. J.) unterstützt.

1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Reinigen Sie die gewünschte Biomolekül13. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet gekauft Kokain-Bindung DNA-Aptamer MN4 nach dem Austausch gegen 2 M NaCl dreimal gefolgt von drei Runden von entionisiertem Wasser mit einem zentrifugalen Filter mit einer 3 kDa Molekulargewicht Cut-off Membran.</li>
	<li>Synthetisieren Sie und zu reinigen Sie, oder kaufen Sie die gewünschte thermolabilen Liganden-13. Hinweis: MN4 bindet die thermolabilen Liganden Kokain. MN4 bindet auch Chinin, das als Negativkontrolle für Liganden Thermolability bei diesen experimentellen Temperaturen verwendet wird.</li>
	<li>Bereiten Sie Puffer für die Dialyse von gereinigten Biomolekül und Auflösung des Liganden (20 mM Natriumphosphat und 140 mM NaCl-Puffer, pH 7,4, für MN4 und die hier verwendeten Liganden vor).</li>
	<li>Dialyse das Biomolekül gegen mindestens 2 L Puffer mit Dialyse Schläuche mit 0,5 - 1,0 kDa Cutoff.</li>
	<li>Filtern Sie die endgültige Puffer (arbeiten Puffer genannt) durch einen 0,2 µm-Filter, der gründlich mit Puffer equilibriert wurde.</li>
	<li>Abwiegen der gewünschten Massen der Liganden und in gefilterten arbeiten Puffer auflösen. Wenn die gewünschte Liganden Konzentrationen Massen, die zu klein erfordern, genau abzuwägen, stellen Sie eine konzentrierte Liganden-Stammlösung (z. B. 10 X). Anmerkung: Es ist wichtig, dass alle DSC Experimente die gleichen Arbeiten-Puffer für die Probe nutzen und Liganden, d.h.führen Sie niemals ein Experiment wo ist der Liganden in einer anderen Charge arbeiten Puffer als das Biomolekül aufgelöst, als Puffer dadurch Mismatch-Artefakte in den Daten.</li>
	<li>Filtern Sie die Biomolekül-Stammlösung durch einen 0,2 µm-Filter, der gründlich mit arbeiten Puffer equilibriert worden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Biomolekül-Konzentration durch Absorption Messungen (260 nm Nukleinsäuren wie MN4 und 280 nm für Proteine).</li>
	<li>Lagern Sie das vorbereitete Biomolekül und Liganden im Kühlschrank (geeignet für MN4 und die hier verwendeten Liganden) 4 ° C oder-20 oder-80 ° C Wenn die Biomolekül und Liganden Einfrieren und langfristige Lagerung tolerieren erforderlich ist. Degas die Puffer, Biomolekül und Liganden Lösungen in eine Tischplatte vor der Verladung in die DSC degasser (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Entgasung verhindert Blasenbildung in der DSC bei höheren Temperaturen. Luftblasen verursachen Signal Artefakte, die DSC Spitze Formen und Basislinien verdunkeln.</li>
</ol>2. DSC Vorbereitung
<ol><li>Schrauben Sie den Druck-Griff von der DSC (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Führen Sie Silikon Schlauch aus dem Puffer arbeiten und befestigen Sie es an den vorderen Flansch (Metall Öffnung) der Referenz-Kapillare.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Brücke zwischen der Referenz und Sample Kapillaren durch den Anschluss des hinteren Referenz-Flansches an der vorderen Probe-Flansch.</li>
	<li>Bringen Sie ein Stück Silikon Schlauch an den hinteren Probe-Flansch, der mit einer Vakuumleitung angebracht zu einem Abfall Kolben läuft.</li>
	<li>Schalten Sie die Vakuumleitung die DSC mit 200 mL arbeiten Puffer geleert.</li>
	<li>Laden Sie die Referenz-Kapillare der DSC mit Puffer arbeiten. Legen Sie etwa 3-5 cm Abschnitte von Silicon Schläuche auf die Referenz Kapillare Flansche.</li>
	<li>Legen Sie eine 1 mL-Pipettenspitze in den hinteren Flansch Silicon Schläuche. Zeichnen Sie 0,8 mL Puffer arbeiten mit einer Pipette zu und setzen Sie die Pipettenspitze mit Puffer in der vorderen Referenz Flansch Silikon Schlauch.</li>
	<li>Drücken Sie vorsichtig die Pipette Kolben bis auf Pass arbeiten Puffer durch den vorderen Silikon Schlauch in der Referenz-Kapillare und hinauf in des hinteren Flansches befestigt Pipettenspitze. Der Pipette Kolben herunterdrücken Sie, bis die Puffer Arbeitsebene oberhalb der vorderen Silikon Schlauch erreicht, dann lassen Sie die Pipette Kolben bis Puffer Arbeitsebene oberhalb der hinteren Silikon Schlauch erreicht.<ol>
<li>Wiederholen Sie, vorbei an der Arbeit Puffer hin und her, um die Lautstärke in der Referenz-Kapillare blasenfrei zu bereinigen. Hinweis: In der Regel reichen 10 Pässe der Lösung hin und her um alle Bläschen klar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verschließen Sie die hinteren Pipettenspitze mit dem Daumen und ziehen Sie vorsichtig auf die hinteren Pipettenspitze und vorderen Pipette zu entfernen aus der Referenz-Flansche mit dem Silikon-Schlauch befestigt.</li>
	<li>Laden Sie die Probe-Kapillare mit Puffer arbeiten wie in den Schritten 2,6-2,9. Die hinteren Referenz setzen Sie eine schwarzen Kunststoff-Kappe auf und probieren Sie Flansche, verlassen die vorderen Flansche aufgedeckt.</li>
	<li>Befestigen Sie den Druck-Griff.</li>
	<li>Öffnen Sie die DSC Software (siehe Tabelle der Materialien) und das Instrument unter Druck zu setzen, indem Sie auf den roten Pfeil am oberen Rand der Schnittstelle nach oben, nach der Stabilisierung der macht Lesung; die DSC-Kraft wird in ein Feld an der Spitze direkt von der Schnittstelle zusammen mit dem Instrumententemperatur und Luftdruck. Hinweis: Monitor unter Druck setzt die Macht als der DSC zu lesen. Änderungen an der Macht von mehr als ~ 10 µW zeigen Blasenbildung in den Kapillaren, die Artefakte in den Daten verursachen können. Die Lösungen müssen entfernt und entgast weiter, bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Equilibrate der DSC mit Puffer arbeiten durch eine Forward- und reverse-Scan durchführen. Sicherstellen Sie im Register "Experimentelle Methode" auf der linken Seite des Bildschirms, dass die "Scan"-Option ausgewählt ist, die DSC im scanning-Modus Temperatur ausgeführt. Hinweis: Experimentelle Parameter sind die Temperatur, die Scan-Bereich, Scan-Rate, niedriger und hoher Temperatur Gleichgewichtherstellung Zeit und Anzahl der Scans.<ol>
<li>Klicken Sie im "Temperaturparameter" Einschub "Experimentelle Methode" auf der Registerkarte zum "Heizen". Geben Sie 1 bis 100 ° C für die untere und obere experimentellen Temperaturen, 1 ° C/min für die Abtastrate und 60 s lang Gleichgewichtherstellung.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Hinzufügen-Serie" unter dem Eingabefeld für den Zeitraum entnehmen. Geben Sie 2 im Feld "Schritte zum Hinzufügen" in das Popup-Fenster (für eine Heizung und eine Kühlung Scan) und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Alternative Heizung/Kühlung". Klicken Sie auf "OK"; die zusätzlichen Scans erscheinen im unteren Teil der Schnittstelle. Kontrollieren, ob die Parameter für jeden Scan als gewünscht.</li>
		<li>Starten Sie das Experiment durch Klicken auf den grünen "play" Knopf an der Spitze der Schnittstelle. Navigieren Sie zu dem gewünschten Ordner und geben Sie einen Dateinamen für die Rettung des Experiments in das Popup-Fenster. Zeigen Sie den Experiment Fortschritt, indem Sie auf die Registerkarte "Daten" auf der rechten Seite der Registerkarte "Experimentieren-Methode".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sammeln von thermolabilen Liganden DSC Datasets
Hinweis: Die minimale Verfahren besteht aus fünf Experimente: Puffer Referenz Experimente mit und ohne Liganden (verwendet für die Basislinie Subtraktion, siehe Diskussion), probieren Sie Experimente mit kostenlosen Biomolekül, das Biomolekül Liganden gebunden und die Liganden gebundenes Biomolekül mit Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung länger.
<ol><li>Führen Sie Referenz-Experimente für die Basislinie Subtraktion der Beispieldaten. Laden die DSC mit Puffer arbeiten in beiden Kapillaren und sammeln Mehrfachscans vorwärts und rückwärts über einen geeigneten Temperaturbereich bei 1 ° C min-1 mit einer oberen (hohe Temperatur) Gleichgewichtherstellung Zeit von 120 s.<ol>
<li>Löschen Sie die bisherigen Puffer Gleichgewichtherstellung Scans aus dem unteren Teil der Schnittstelle durch jeweils einzeln markieren und auf das rote X in der Mitte rechts der Schnittstelle. Fügen Sie die neue Scans durch Klicken auf die Schaltfläche "Hinzufügen-Serie", 20 im Feld für "Schritte zum Hinzufügen" eingeben und das Kontrollkästchen "Alternative Heizung/Kühlung". Klicken Sie auf "OK" und führen Sie das Experiment, indem Sie auf den grünen Play-Button wie oben beschrieben.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1 - 3.1.1 mit arbeiten Puffer, enthält die gewünschte Konzentration des Liganden in beiden Kapillaren der Verweis abrufen Experimente für den Liganden (sammeln Sie zwei separate Experimente mit 120 s und s Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung 600-fache bzw. bei Erwerb der Geschwindigkeitskonstante für thermolabile Liganden Konvertierung verwendet werden). Hinweis: Die hier verwendete Abtastrate sorgt dafür, dass das Biomolekül in späteren Experimenten im thermischen Gleichgewicht in den forward und reverse-Scans (siehe Diskussion). Scannen Sie Preise < 0,1-0,2 ° C min-1 zu laut Thermogramme führen und sind nicht anwendbar bei DSC-Experimenten. Die Temperaturen sollten reichen von weit unter der Schmelztemperatur der freien Biomolekül oberhalb der Schmelztemperatur des Liganden gesättigt Biomolekül gut (~ 20-80 ° C für MN4). Überprüfen Sie die Reproduzierbarkeit der Scans (z. B. 10 nach vorn und 10 reverse Scans für insgesamt 20 ist ausreichend).</li>
		<li>Wenn mehrere Liganden (z. B. Kokain und Chinin), Spülen der DSC mit 200 mL arbeiten Puffer (Wiederholung von Schritt 2.5) zwischen den Läufen zur Liganden aus den Kapillaren zu entfernen und zur Vermeidung von Kreuzkontamination. Hinweis: Es ist hilfreich, um festzustellen, ob die vorherigen Liganden stark, die Kapillarwände absorbiert und ist nicht hinreichend mit Puffer spülen entfernt replizieren Experiment auf das kostenlose Biomolekül nach einem Liganden gebundenes Lauf durchführen. Wenn die Thermogramme für das kostenlose Biomolekül erscheinen zu einem größeren Ausmaßes und höhere Denaturierung Temperatur verschoben werden, nachdem der Liganden-gebunden experimentieren, ist es wahrscheinlich, dass die vorherigen Liganden in der Kalorimeter nach dem Spülvorgang noch vorhanden ist. Entfernen den adsorbierten Liganden durch Inkubation der Kapillaren mit 20 % Contrad-70 für 1 h bei 60 ° C mit Kunststoffkappen und Druck Griff aus. In der DSC-Software ändern der experimentellen Modus in "Isotherm" unter die Versuchsmethode Registerkarte und wählen Sie 3.600 s für die Dauer und 60 ° C für die Isotherme Temperatur mit Null zum Gleichgewichtherstellung Mal betrat. Klicken Sie auf "Experimentelle Methode hinzufügen". Die Isotherme Experiment erscheint im unteren Teil des Bildschirms. Spülen Sie nach Beendigung wird das Instrument mit 2 L entionisiertem Wasser und wiederholen Sie ab Schritt 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie Probe Experimente unter Verwendung derselben DSC laden Prozedur und experimentellen Parameter wie die Referenz scans. Sicherstellen Sie für den kostenlosen Biomolekül Datensatz, dass die Referenz-Kapillare der Arbeit Puffer enthält, während die Probe Kapillare das kostenlose Biomolekül in der gewünschten Konzentration in Arbeit Puffer enthält.<ol>
<li>Sicherzustellen Sie für die Liganden gebundenes Experimente, dass die Liganden im Puffer arbeiten in der Referenz-Kapillare, und das Biomolekül plus Liganden in Arbeit-Puffer in der Probe-Kapillare sind. Spülen Sie das System zwischen den Zugaben von verschiedenen Liganden wie in Schritt 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine zusätzliche Experiment mit das Biomolekül an thermolabilen Liganden gebunden, wo ist die hohe Temperatur Gleichgewichtherstellung auf 600 erhöht s und anderen experimentellen Parameter sind identisch mit Schritt 3.2.1. Hinweis: Die Dauer der Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung für das zweite Liganden gebundenes Experiment ist einfach um sicherzustellen, dass die Liganden schneller erschöpft als das kurze Gleichgewichtherstellung Zeit Experiment ausgewählt. Wenn die Liganden gebundenes Gipfel vom ersten Verfall langsam als Funktion des Scan-Nummer experimentieren (z. B.die Unterschiede zwischen aufeinanderfolgenden Peak Maxima sind ≤ 0,5 ° C), 10 bis 20 fache erhöht in der Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung Periode zur Schätzung adäquat zum Abbau des Liganden während des zweiten Versuchs. Die genaue Berechnung der Rate konstant für die Liganden Konvertierung erfordert, dass das zweite Experiment schnelleren Erschöpfung des Liganden relativ zur ersten hat. Die Liganden-Konzentrationen extrahiert aus der globalen Analyse der zwei Experimente werden ähnliche und daher unbrauchbar, wenn die Liganden Erschöpfung nicht ausreichend in das zweite Experiment beschleunigt wird.</li>
</ol>4. Datenverarbeitung
<ol><li>Öffnen die DSC experimentieren Dateien in der DSC-Daten-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien) und die rohe Kraft-Daten als Tabellen exportieren.</li>
	<li>Importieren Sie die Tabellen mit den rohen Leistungsdaten in Software für Daten passend.</li>
	<li>Grundlinie subtrahieren Sie die Beispieldaten durch Subtraktion Puffer Leistungsdaten von der freien und gebundenen Liganden Biomolekül Experimente. Hinweis: Für das Experiment thermolabilen Liganden sinkt die Konzentration der ersten Liganden mit jedem Scan. Daher ist es ideal, um den Puffer Scan 1 Probe Scan 1 subtrahieren, und so weiter. Wir haben festgestellt, dass die Puffer-Scans mit Kokain nicht merklich ändern wie die Liganden-Konvertierung wird fortgesetzt und kann daher ein einzigen thermolabilen Liganden Puffer Scan alle thermolabilen Liganden gebundene Daten subtrahieren verwendet werden.</li>
	<li>Konvertieren Sie die Grundlinie abgezogen macht Beispieldaten in Wärmekapazität. Hinweis: Die Konvertierung erfordert das Biomolekül teilweise spezifische Volumen, das schätzungsweise14,15,16sein können. Die Gleichung für die Umwandlung von Strom zu Wärmekapazität wurde zuvor17beschrieben.</li>
</ol>(5) Datenanalyse
<ol><li>Weltweit passen Sie das kurze Gleichgewichtherstellung Zeit thermolabilen Liganden gebundenes Wärmekapazität Dataset mit einem einzigen Satz der Basislinie, Liganden-Konzentration, Falt- und Ligand verbindliche Parameter wie zuvor beschrieben4.</li>
	<li>Wiederholen Sie die globale fit für die langen Gleichgewichtherstellung Zeit Dataset zur Berechnung der Rate konstant für thermolabile Liganden Konvertierung wie zuvor beschrieben4.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Modifikationen und Fehlerbehebung
Die Details der globalen passende Analyse verwendet in Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden4beschrieben. Hier beschreiben wir die praktischen Aspekte der Durchführung und Analyse von DSC verbindliche Experimente mit thermolabilen Liganden. Beachten Sie, dass Basispläne DSC erhalten für thermolabile Liganden allein von den Liganden subtrahiert wird + Biomolekül...

Differential scanning-Kalorimetrie (DSC) ist eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung biomolekularen Bindung und faltende Wechselwirkungen1,2,3. Die Stärken der DSC gehören seine Fähigkeit zur Bindung und Falten Mechanismen aufzuklären und zu der entsprechenden thermodynamischen Parameter2,3. Darüber hinaus DSC kann in Lösung in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und erfordert keine Kennzeichnung der Biomolekül oder Liganden, z. B.mit Fluorophore, Spin-Etiketten oder nuklearen Isotope4. Das Gerät scannt in Temperatur, Messung der Menge an Wärme benötigt, um das Biomolekül in an- und Abwesenheit des Liganden zu denaturieren. Die daraus resultierende Thermogramme werden verwendet, um die thermodynamischen Parameter den Liganden binden und Faltung Prozesse zu extrahieren. DSC oder anderen thermodynamischen Verfahren übermittelten Informationen ist entscheidend für die Führung der Gestaltung der Medikamente gegen Biomoleküle1,5,6,7,8. Jedoch das wiederholte Scannen zu hohen Temperaturen (~ 60-100 ° C) kann problematisch sein. Zum Beispiel viele pharmazeutisch wichtige Verbindungen zu unterziehen, Rearrangement oder Zersetzung auf anhaltende Exposition gegenüber hohen Temperaturen9,10,11, d. h., sie sind thermolabilen. Prüfung von verbindlichen Interaktionen von DSC in der Regel erfordert Mehrfachscans vorwärts und rückwärts um die Reproduzierbarkeit der Thermogramm für thermodynamische Analysen12zu überprüfen. Thermische Umwandlung von einer anfänglichen Liganden an einen sekundären Formen mit veränderten Bindungseigenschaften führt zu ausgeprägten Unterschiede in Form und Position der aufeinanderfolgenden Thermogramme, da verringert sich die Konzentration des ersten Liganden mit jedem Scan während der thermische Umwandlungsprodukte ansammeln. Diese Datensätze sind nicht traditionelle Analysen zugänglich.
Vor kurzem haben wir eine globale Anpassungsmethode für thermolabile Liganden DSC-Datasets, die die Gesamtheit der thermodynamischen Parameter für die biomolekularen Faltung und bindende Wechselwirkungen aus einem einzigen Liganden gebundenes Experiment bezogen auf ergibt die erforderlichen Thermogramm für die kostenlose Biomolekül-4. Die Analyse reduziert den experimentellen Probe vorgeschriebenen ~ 10-fach im Vergleich zu standard-DSC-Ansätze. Wir haben entfielen für Liganden thermische Umwandlung von vorausgesetzt, dies geschieht während der Hochtemperatur-Teil für jeden Scan wo das Thermogramm nicht Liganden-Konzentration hängt. Daher ist die Liganden-Konzentration eine konstante innerhalb des Teils des Thermogramm, die verwendet wird, um thermodynamische Parameter zu extrahieren. Wir zusätzlich gezeigt, wie die Geschwindigkeitskonstante für Ligand thermische Umwandlung erreicht werden kann, durch eine ergänzende Experiment mit Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung länger ausführen. Für Systeme, wo Liganden thermische Umwandlung weniger temperaturabhängig (d.h.auftretenden spürbar bei allen Temperaturen), die Analyse kann geändert werden, um Variable Liganden Konzentrationen enthalten. Hier zeigen wir dieses Verfahren zur DNA-Aptamer MN4 in Anwesenheit von thermolabilen Liganden Kokain, die schnell zum Benzoylecgonin bei hohen Temperaturen Konvertiten (> 60 ° C). Chinin wird als Negativkontrolle für Liganden Thermolability verwendet, da es Konvertierung bei diesen experimentellen Temperaturen nicht unterziehen und auch an MN4 bindet. Wir beschreiben den Erwerb von thermolabilen Liganden DSC Datasets und ihre Analyse nachgeben thermodynamischen und kinetischen Parameter der Faltung, Bindung und Liganden Konvertierungsprozesse.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Deioinized water for molecular biology</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 micron sterile syringe filters</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa centrifugal filters</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic DSC flange caps</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimeter</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr><tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Differential scanning-Kalorimetrie (DSC) ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Quantifizierung der thermodynamischen Parameter für biomolekulare Falt- und bindender Wechselwirkungen. Diese Information ist entscheidend bei der Gestaltung neuer Arzneimittel zur Behandlung. Allerdings sind viele pharmazeutisch relevante Liganden chemisch instabil bei den hohen Temperaturen im DSC-Analysen verwendet. So messen bindender Wechselwirkungen wird schwierig, da die Konzentrationen von Liganden und thermisch umgewandelt Produkte innerhalb der Kalorimeter Zelle ständig in Bewegung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit thermolabilen Liganden und DSC für schnell Informationsbeschaffung thermodynamischen und kinetischen auf die Falten, Bindung und Liganden Konvertierungsprozesse. Wir haben unsere Methode auf die DNA-Aptamer MN4 angewandt, die das Kokain thermolabilen Liganden bindet. Verwenden eine neue globale Fitting-Analyse, die Konten für thermolabile Liganden Umwandlung, die Gesamtheit der Faltung und Bindungsparameter stammen aus ein paar DSC Experimente. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Geschwindigkeitskonstante für thermolabile Liganden Konvertierung mit nur einem zusätzlichen DSC Dataset bezogen werden kann. Die Leitlinien für die Identifizierung und Analyse von Daten aus mehreren komplizierter Szenarien werden vorgestellt, einschließlich irreversible Aggregation der Biomolekül, langsam Falten, langsame verbindliche und schnelle Entleerung des thermolabilen Liganden.

Repräsentative Daten für den DSC thermolabilen Liganden sind in Abbildung 1dargestellt. Die Position und Höhe des thermolabilen Liganden gebundenes Peaks rückt sukzessive nach unten, die das ungebundene Biomolekül thermolabile Liganden mit jedem Scan (Abbildung 1a) erschöpft ist. Das kostenlose Denaturierung-Profil dient als Referenz für den Endpunkt der thermolabilen Liganden Umwandlung (Abbildung 1 b...

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für schnelle Charakterisierung der biomolekularen Faltung und Interaktionen mit thermolabilen Liganden mit differential scanning Kalorimetrie verbindlich.

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K Aufrufe.  McGill University. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für schnelle Charakterisierung der biomolekularen Faltung und Interaktionen mit thermolabilen Liganden mit differential scanning Kalorimetrie verbindlich.

Serie: Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Forschung

Biotechnik

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Differential Scanning Calorimetry - Eine Methode zur Beurteilung der thermischen Stabilität und Konformation von Protein-Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Biochemie

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hochdurchsatz-Thermoshift-Assays für Protein-Liganden-Wechselwirkungen

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Förderung struktureller und biochemischer Studien von Proteinen durch thermische Shift-Assays

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

Isotherme Titrationskalorimetrie für Mess-Makromolekül-Ligand-Affinität

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Biologie

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie

Differential Scanning Calorimetry - Eine Methode zur Beurteilung der thermischen Stabilität und Konformation von Protein-Antigen

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Isotherme Titrationskalorimetrie für Mess-Makromolekül-Ligand-Affinität

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese