Name: dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
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Diese Forschung wurde vom Brigham &amp; Women&#39;s Hospital und dem March of Dimes unterstützt. Die Autoren danken allen Mitgliedern des Whited Labs für ihre Unterstützung und Beratung.

Alle Axolotl-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Brigham und Women&#39;s Hospital (BWH) Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Perfusionsexperiment einrichten <ol><li> Legen Sie ein erwachsenes Axolot in einen mit 0,1% Triacinlösung (MS222) gefüllten Plastikbehälter für 15-20 min oder bis vollständig anästhesiert. Stellen Sie sicher, dass der Behälter mit genügend Triacin-Lösung gefüllt ist, so dass das Axolotl vollständig untergetaucht ist. Hinweis: Alle Verfahren müssen gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege durchgeführt werden. Bei BWH wird ein Axolotl als vollständig betäubt betrachtet, wenn es einen Fuß-Prise-Test versagt, dh es gibt keine reflexive Bewegung, wenn der Fuß sanft gequetscht wird. Achtung: Obwohl Tricaine ein Anästhetikum ist, das speziell für Wasserorganismen verwendet wird, sollte ein direkter Hautkontakt mit der Tricainlösung vermieden werden. </li><li> Richten Sie die Axolotl-Perfusionsstation ein. <ol><li> Setze dasAbsorbierende Auflage auf einer ebenen, ebenen Oberfläche mit der nach oben weisenden Seite. </li><li> Schneiden Sie ein Loch in den Polystyrol-Schaumrahmen, der die passende Größe und Form für das anästhesierte Axolotl ist, um in der Rückenlage zu liegen. Legen Sie den Rahmen auf das saugfähige Pad. Hinweis: Einige zusätzliche Papiertücher können sofort unter dem Rahmen für zusätzliche Saugfähigkeit platziert werden. </li><li> Die peristaltische Pumpe mit dem Perfusionsschlauch beladen. Stellen Sie die Pumpe auf eine Durchflussrate von 0,7 ml / min ein, die im Uhrzeigersinn fließt. </li><li> Mischen Sie die Verdünnungslösung mit 0,7x PBS und 5% Glukose in einer 1: 4 Mischung. </li><li> Mischen Sie 10 ml Verdünnungslösung mit 200 μl der DiI-Stammlösung in einem 50 ml konischen Röhrchen. Cap und Mix durch Inversion. Decken Sie diesen Schlauch mit Aluminiumfolienpapier ab, um die Arbeitslösung vor Lichteinwirkung zu schützen. Hinweis: Die Volumina sollten entsprechend der Größe des Axolotls proportional geändert werden. Diese Werte sind für eine ca. 15 cm axolotl (Schnauze-zu-Schwanz-Länge). EINNaturen dieser Größe haben möglicherweise nicht die volle Geschlechtsreife erreicht, so dass Tier Sex nicht zu diesem Zeitpunkt bestimmt werden kann. </li><li> Füllen Sie ein 50 mL konisches Rohr mit 0,7x PBS. Hinweis: PBS wird für die Priming der Schleife und Axolotl Exsanguination verwendet werden. </li><li> Befestigen Sie die 27-Gauge-Schmetterlingsnadel am Austrittsende des Perfusionsschlauches. Falten Sie die Schmetterlingsflügel aufeinander und legen Sie sie in den Klemmenständer. </li><li> Legen Sie das freie Ende des Perfusionsschlauches in das 50 mL konische Rohr, das mit 0,7x PBS gefüllt ist, und führen Sie die Perfusionspumpe, bis der gesamte Schlauch mit einer Lösung gefüllt ist. Pausieren Sie die Pumpe, sobald der gesamte Schlauch mit PBS gefüllt ist. Hinweis: Achten Sie darauf, dass der Schlauch jederzeit frei von Luftblasen ist, da diese Luft in den Axolotl bringen und eine vollständige Perfusion verhindern. </li><li> Legen Sie ein Papiertuch in die axolotlförmige Form im Polystyrol-Schaumstoffrahmen. Mit einer Transferpipette das Tuch mit Triacinlösung einweichen. Anmerkung: Schneiden Sie ein kleines Quadrat in der Mitte des PapiertuchesEl, um die Drainage von Flüssigkeiten während des Perfusionsverfahrens zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie die anästhesierte Axolotl Rücken auf das Papiertuch im Polystyrol-Schaumstoffrahmen. </li></ol></li></ol> 2. Eröffnung der Axolotl Brust <ol><li> Benutze chirurgische Pinzette, um die Haut entlang der Mittelachse der Axolotl-Brust zu knacken, knapp unterhalb der Schulterlinie. Nach oben ziehen </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt zu machen, wo die Haut gezogen wurde. </li><li> Entfernen Sie einen quadratischen Fleck der Haut über die Brust, um zwei Knorpelplatten zu enthüllen. <ol><li> Entfernen Sie die Haut, um ein Fenster über die Thoraxhöhle zu öffnen, das groß genug ist, um das Herz deutlich zu sehen und ungefähr 5 mm der Aorta, die vom Herzen abzweigt. </li></ol></li><li> Das Bindegewebe sorgfältig mit einer Pinzette oder der geschlossenen Schere zerreißen, um das Entfernen von größeren Blutgefäßen zu vermeiden. </li><li> Heben Sie jede Knorpelplatte einzeln mit der Pinzette an und verbrauchen sie wMit der chirurgischen Schere. </li><li> Sorgfältig das Perikard mit der Pinzette einklemmen, hochziehen und mit der chirurgischen Schere punktieren; Dieser Einschnitt sollte gerade tief genug sein, um das sehr dünne Perikard zu durchstechen und sollte groß genug sein, um die Entfernung des Perikards zu ermöglichen. Achten Sie darauf, das Herz nicht zu schneiden. </li><li> Zartes das Perikard entfernen, um das Herz und die Aorta auszusetzen. Hinweis: Verwenden Sie eine Transferpipette, periodisch spülen Sie die Brusthöhle und die Kiemen mit Tricain-Lösung, um den Bereich klar zu halten und halten Sie die Axolotl anästhesiert. </li></ol> 3. Perfusion des Axolotl <ol><li> Legen Sie den Klemmenständer mit der beladenen Schmetterlingsnadel neben dem Polystyrol-Schaumstoffrahmen, so dass der Arm der Klemme leicht manipuliert werden kann, um die Nadel in die Axolotl-Aorta einzuführen. Richten Sie die Nadelspitze auf den rostralen Aspekt des Tieres während der Insertion und halten Sie die Nadel parallel zur Aorta, um zu vermeiden, dass sie durch die opPosite Seite. </li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein. 0,7x PBS sollte weiterhin durch Schlauch fließen. </li><li> Setzen Sie die Nadel in die Aorta ein. <ol><li> Schieben Sie die Pinzette unter den Aortenbogen und ziehen Sie leicht nach unten, um einen leichten Zugang zu ermöglichen. </li><li> Manövrieren Sie die Nadel-Klemm-Kombination, so dass die Nadel entlang der Länge der Aorta läuft und nach oben zum Kopf zeigt. Setzen Sie die Nadel ein, während Sie die Pinzette für die Unterstützung hinter der Aorta verwenden. Hinweis: Die Nadel sollte tief genug in die Aorta eingesetzt werden, um sicherzustellen, dass sie während der Perfusion nicht ausrutscht. Dies kann etwa 5 mm für ein 15 cm Axolotl sein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel perfekt mit der Aorta in Einklang steht, um eine vollständige Punktion des Schiffes zu vermeiden. Durch-und-Durchgangsdurchgänge können massive Blutung verursachen und die Erfolgsquoten der Perfusion verringern. Eine erfolgreiche Einfügung kann durch eine sichtbare Vergrößerung der Herzmuster des Herzens bestätigt werden. </li></ol></li><li> Schnell zerreißt ein Atrium mit dem sciSsors und lassen Blut abtropfen lassen. <ol><li> Spülen Sie mit Tricain-Lösung, um Blutansammlung und Gerinnselbildung in der Brusthöhle zu verhindern. </li></ol></li><li> Perfekt das Axolot mit etwa 20-30 ml PBS. Das Tier sollte von hellrosa in Farbe zu Weiß in einer erfolgreichen Perfusion wechseln. </li><li> Pausieren Sie die peristaltische Pumpe und bewegen Sie das freie Ende des Schlauches in das 15 ml Rohr der DiI-Lösung. Starten Sie die Pumpe neu, achten Sie darauf, keine Luftblasen im Schlauch zu erzeugen. </li><li> Setzen Sie den Axolotl mit dem gesamten Arbeitsmaterial von DiI ein. Anmerkung: In einer erfolgreichen Perfusion, die Axolotl mit Veränderung Farbe auf die helle rosa der DiI. Das wird am deutlichsten in den Kiemen. </li><li> Pausieren Sie die Pumpe, nachdem die Perfusion mit DiI abgeschlossen ist und legen Sie das freie Ende des Schlauches in 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung, um das Gewebe zu fixieren. Starten Sie die Pumpe neu und benachrichtigen Sie mindestens 10 ml PFA. Achtung: PFA ist giftig und sollte gehandhabt und dispo seinSed von angemessenem. Handschuhe und Schutzbrillen sollten getragen werden, und Lösungen sollten in einer Dunstabzugshaube hergestellt werden. Die Perfusion des Axolotls mit PFA zur Fixierung des Gewebes führt zum Tod des Tieres. </li></ol> 4. Beenden der Perfusion und Visualisierung Vorbereitung <ol><li> Stoppen Sie die peristaltische Pumpe und entfernen Sie die Nadel aus der Axolotl-Aorta. </li><li> Legen Sie das Axolotl auf eine Plastikplatte. Anmerkung: Die Verwendung einer Hälfte einer großen Petrischale funktioniert gut und ermöglicht das Gießen einer kleinen Menge Tricaine oder PBS auf das Axolotl, um seine Haut nass zu halten und die Visualisierungsqualität zu verbessern. </li><li> Entsorgen Sie alle verwendeten Materialien in den entsprechenden Abfallbehältern. Saubere chirurgische Werkzeuge mit 70% Ethanol, desinfizieren mit einem Glasperlen-Sterilisator zwischen den Tieren und sterilisieren durch Autoklavieren nach dem Verfahren. Schlauch mit der PBS-Lösung spülen und abtropfen lassen, vollständig abtrocknen und zur weiteren Verwendung aufbewahren. </li></ol> 5. Visualisierung der perfundierten Axolotl <oL&gt; <li> Lege das Axolotl unter ein fluoreszierendes konfokales Mikroskop. </li><li> Schalten Sie die Lichter aus, da die Visualisierung der DiI-gefärbten Gefäße durch Licht beeinträchtigt wird. </li><li> Verwenden Sie einen grünen Fluoreszenz-Emissionsfilter-Würfel ( zB ET-CY3) mit dem konfokalen Mikroskop, um die Vaskulatur des Axolotls zu visualisieren. Verwenden Sie Anregungslicht der Wellenlänge 545 nm. Hinweis: Um ein Bild von hoher Qualität zu erhalten, können folgende Parameter verwendet werden: Belichtung für 1,1 s, Verstärkung von 1x, Sättigung von 1,0, Vergrößerung von 2X. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Visualisierung der Vaskulatur des Axolotls kann erfolgreich durch Perfusion mit dem lipophilen Carbocyaninfarbstoff DiI erreicht werden. In dieser Studie beschreiben wir ein neuartiges Protokoll für die Perfusion des Axolotls mit DiI mit einer peristaltischen Pumpe. Wir zeigen auch die anschließende Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems mit einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop. Dieses Protokoll war eine Anpassung des Nagetier-DiI-Perfusionsprotokolls, das in Li et al. 7 , aber große Unterschiede zwischen dem Nagetier und dem Axolotl erforderte eine Revision des Protokolls, um das Axolotl-Modell anzupassen. Diese Studie diskutiert eine Methode der DiI-Perfusion des Axolotls, um das Vaskulatur erfolgreich zu visualisieren. Unterschiede in der Anatomie und Physiologie zwischen dem Salamander und Nagetier verlangen Veränderungen in den wichtigsten Aspekten der Perfusion, einschließlich der Lage der Nadel-Insertion, Methode der Perfusion und der verwendeten Reagenzien. Um zu schmerzenDh eine erfolgreiche Perfusion, beschränkten wir den Schaden, der dem Vaskulatur des Axolotls zugeführt wurde. Während des Öffnens der Brusthöhle wurde sorgfältig darauf geachtet, das Herz und die Aorta vollständig zu entlarven, während jegliche Beschädigung oder Verletzungen der großen Blutgefäße vermieden wurden. Die Begrenzung der Verwendung der chirurgischen Schere verhinderte das versehentliche Abschneiden von Großschiffen, während kleine Einschnitte die Kontrolle über die Belichtung von Herz und Aorta beherrschten. Die Erfolgsraten der Perfusionen erhöhten sich auch, wenn die DiI-Nadel durch die Aorta eingeführt wurde, und nicht direkt in die Herzkammern. Der Axolotl hat im Gegensatz zur Maus ein dreikammeriges Herz, das nur einen Ventrikel mit deutlich weniger Muskulatur enthält als der der Maus. Wegen dieser Unterschiede musste die Lage der Nadeleinführung in die stabilere Aorta verlagert werden. Die Aorta war entschlossen, der optimale Ort für die Einfügung der Perfusionsnadel zu sein, da sie groß genug für die Punktion durch eine 27 G-Nadel ist und eine begrenzte Bewegung hat. Bewegung war minimalUm ein versehentliches Entfernen oder Abrutschen der Perfusionsnadel oder durchdurchschnittliche Punktion der Aorta zu vermeiden. Herzperfusionen, die den Ventrikel als Einführungspunkt verwenden, erwiesen sich als eine viel niedrigere Erfolgsrate als die mit einem Aorteneinfüllungspunkt. Eine fehlerhafte Durchstreichung des Gefäßsystems führte häufig zur Bildung von Embolien oder zur Verhinderung der Perfusion, was zu sehr niedrigen Erfolgsraten der vaskulären Markierung führte. Durch die Verwendung eines Klemmenständers, um die Schmetterlingsnadel während der Perfusion zu halten, haben wir ihre Bewegung verringert, wodurch die Rate der erfolgreichen Perfusionen erhöht wird. Zusätzlich war aufgrund der Zartheit des Axolotlgewebes im Vergleich zur Maus eine peristaltische Perfusionspumpe erforderlich, im Gegensatz zu der zuvor verwendeten manuellen Perfusion. Die Verwendung dieser Pumpe erlaubte eine praktische Annäherung an die Axolotl-Perfusion, um eine falsche Punktion der dünnen Gewebe zu minimieren. Perfusionen waren erfolglos für viele zusätzliche Gründe, einschließlich Durch-und-Durchgang punctUre, Gerinnung und Embolie. In dem Fall, dass die Nadel in die Aorta eingeführt wurde und eine zweite Punktion durch die hintere Wand erzeugt wurde, würde die DiI-Lösung direkt in die Brusthöhle fließen, anstatt durch die systemische Zirkulation zu gehen. Zusätzlich, sobald das Blut die Vaskulatur verlassen hat, bildete es schnell ein Blutgerinnsel, das die Perfusion behindern könnte. Klumpen und Luftblasen könnten sich auch im Gefäß bilden, wodurch Embolien entstehen, die eine erfolgreiche Perfusion ausschließen. Schließlich stellte dieses Protokoll Reagenzien ein, die an die Axolotl-Osmolalität angepasst wurden, die sich deutlich von der des Säugetiers unterscheidet. Die Anpassung dieses Protokolls und die signifikanten Änderungen, die an das Axolotl-Modell angepasst werden, werden bei der Verfolgung des Verständnisses des Prozesses der Revaskularisierung von Geweben während der Regeneration helfen. DiI, die in der Farbe rosa ist, wird das Tier perfundieren und ihm einen leuchtend rosa Farbton geben. Erfolgreich perfundierte Axolotsen wurden mit bloßem Auge hellrosaVaskularisierte Regionen, die intensiver gefärbt sind. Perfundierte Tiere, die mit einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop unter Verwendung eines grünen Filters betrachtet werden, können im rotorangenen Emissionsspektrum visualisiert werden. Vaskulatur wurde am besten in dünneren Geweben sichtbar gemacht, die die versehentliche DiI-Färbung von nicht-vaskulären Geweben minimierten. Perfusion des Gewebes mit 4% Paraformaldehyd (PFA) unmittelbar nach DiI Perfusion sollte durchgeführt werden, um das Gewebe zu fixieren. DiI-Perfusionen sind Endpunkt-Experimente für das Axolotl. Während des Verfahrens wird das gesamte Blut des Tieres effektiv entwässert und durch 0,7x PBS ersetzt, gefolgt von DiI-Lösung und schließlich 4% PFA. Dies stört die Fähigkeit des Axolotls, sich in den lebenswichtigen Akt des Gasaustausches einzubringen, und es verliert die Fähigkeit, sein Körpergewebe zu oxygenieren. Aufgrund dieser Endpunkt-Natur fängt jede Perfusion nur einen einzigen Zeitpunkt des vaskulären Wachstums ein, und das Tier kann zu einem späteren Zeitpunkt nicht weiter perfundiert werden. Aufgrund dieser Zeit-LimiEs müssen mehrere Tiere verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf der Gefäßentwicklung zu beschreiben. Dieses DiI-Protokoll und die Modifikationen, die angewendet werden, um es zu verbessern, können verwendet werden, um das Vaskulatur des Axolotls erfolgreich zu etikettieren und zu visualisieren. Da das Axolotl ein wesentlicher Modellorganismus für das Studium der Regeneration ist, eröffnen erfolgreiche Perfusionen Möglichkeiten, den Prozess der Angiogenese während der Regeneration zu verhören. Das Axolotl ist ein Modellorganismus für das Studium der Regeneration, weil es ein neotisches Tier ist und daher eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration im Erwachsenenalter behält. Der Revaskularisierungsprozess der regenerierenden Gewebe ist jedoch nicht gut verstanden, daher bietet die Anpassung der DiI-Perfusion an das Axolot-System die Möglichkeit, die Regeneration zu verstehen, die mit dem Säugetiermodell nicht verfügbar war. Die Perfusion des Axolotls mit DiI ist eine neuartige Technik für das Studium von revasCularisierung von regenerierendem Gewebe in diesem Tiermodell, daher kann dieses Protokoll weiter verwendet werden, um die Organogenese während der Entwicklung und Angiogenese während der Krankheit zu verstehen und als ein wichtiges Werkzeug während des Studiums der Regeneration verwendet zu werden.

Die Visualisierung der Vaskulatur spielt eine wesentliche Rolle beim Verständnis der Struktur und Funktion von Organismen über viele Arten hinweg. Ab dem 16. Jahrhundert mit Leonardo da Vinci wurden Modelle und grafische Darstellungen der Zirkulation untersucht 1 . Mit Hilfe von Wachs und Gummi-Formen wurden Gewebe perfundiert, um dreidimensionale Modelle des Gefäßsystems zu schaffen, die das Studium der Organogenese und Pathogenese 1 , 2 erlaubten. Harze und Wachse wurden mit Farbstoffen wie Indien Tinte oder Karminrot gefärbt, um ihre einfache Visualisierung zu ermöglichen 1 , 2 . Allerdings verursachten diese Techniken viele Probleme, weil ihre hohen Viskositäten eine vollständige Perfusion des interessierenden Gewebes verhinderten. Als das Feld anspruchsvoller wurde, kam die Verwendung von konfokalen und Elektronenmikroskopen ins Spiel, indem er die Perfusionstechnologie bewegte<html> Ues weg von Gussformen und zu flüssigen Perfusionen des Gefäßsystems, von denen einige die Perfusion und Bildgebung von Blutgefäßen erlaubt haben, ohne das anfängliche Gewebe 3 zu zerstören. DiI, ein fluoreszierender Carbocyaninfarbstoff, ist ein solcher Fleck, der die Perfusion von Tieren ohne Beschädigung des Gefäßgewebes ermöglicht. Carbocyaninfarbstoffe sind lipophile Farbstoffe, die bei Kontakt in Zellmembranen einfließen. Diese Farbstoffe ermöglichen eine einfache und sofortige Färbung von vaskulären Endothelzellen, die dann unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop betrachtet werden können. DiI bewegt sich über laterale Diffusion in der Lipidmembran von Zellen, wie in der Markierung und Verfolgung von Neuronen gezeigt 4 . Chemikalisch geben die beiden Alkylketten von DiI dem Farbstoff seine hohe Affinität für Zellmembranen, während zwei konjugierte Ringe aus einem Fluorochrom, das für die Emission einer roten Wellenlänge verantwortlich ist, wenn es durch grüne Fluoreszenzlichtfilter angeregt wird&gt; 4 DiI wurde in vielen Kapazitäten eingesetzt, darunter die erfolgreiche Markierung der Plasmamembran und sowohl die anterograde als auch die retrograde Markierung in den Neuronen 5 , 6 . DiI wurde zuvor in Perfusionsprotokollen verwendet, während das Vaskulatur von Mäusen sichtbar gemacht wurde 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sind Salamander, die exklusiv in Brackseen in der Nähe von Mexiko-Stadt, Mexiko leben. Diese Tiere sind zu einem wichtigen Modell für das Verständnis von regenerativen Prozessen geworden, da sie ganze Gliedmaßen, Schwanz (einschließlich Nervenkabel), Teile des Herzens und anderer innerer Organe und Teile des Auges als Erwachsene 8 , 9 regenerieren können . Darüber hinaus ist mit der jüngsten Anwendung von genetischen Werkzeugen in Axolotten ein beispielloser Einblick in die Moleküle und Zellen, die diese Prozesse durchführen, nun möglich 8 . Das erfolgreiche regeneDie Ration eines ganzen Gliedes erfordert einen umfangreichen Revaskularisierungsprozess, der bei der Regeneration eine wesentliche Rolle spielen kann, die über die traditionellen Funktionen der Blutgefäße bei der Bereitstellung von Sauerstoff und Nährstoffen hinausgeht. Das Verständnis der Revaskularisierung im Kontext der Geweberegeneration ist zwingend erforderlich. Axolotl-Blutgefäße wurden zuvor mit India Ink visualisiert, und während die Ergebnisse faszinierend waren, wurde dieser Prozess in den folgenden Jahrzehnten nicht erneut besucht 10 . Wir suchten ein DiI-Perfusionsprotokoll anzupassen, das für den Einsatz in Säugetieren entwickelt wurde, um eine vollständige Perfusion und Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erfolgreich durchgeführt wurden, um die Axolotl-Zirkulation erfolgreich mit einer DiI-Färbetechnik zu visualisieren und anschließend zu visualisieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht eine genaue Visualisierung von Patentblutgefäßen in homöostatischen Geweben sowie in regenerierenden Geweben und stellt eine neuartige Methode zur Visualisierung zur VerfügungN und Analyse des Revaskularisierungsprozesses im Axolotl.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Marshall Scientific&amp;nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion tubing</td><td>Excelon Lab &amp;amp; Vacuum Tubing</td><td>436901705</td><td>size S1A</td></tr><tr><td>27g butterfly needle</td><td>EXELint Medical Products</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-Dioctadecyl-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100% vol/vol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Surgical foreceps&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene foam frame</td><td></td><td></td><td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&amp;nbsp; cut out</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent underpad</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard disposable transfer pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Clamp stand</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricaine powder</td></tr><tr><td>Adult axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tanks</td><td></td><td></td><td>Varying size appropriate for the axolotl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Fluorescent Filter</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

Perfusionstechniken wurden seit Jahrhunderten verwendet, um die Zirkulation von Geweben zu visualisieren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist eine Spezies von Salamander, die als ein wesentliches Modell für Regenerationsstudien entstanden ist. Es ist wenig bekannt, wie die Revaskularisierung im Zusammenhang mit der Regeneration bei diesen Tieren auftritt. Hier berichten wir über eine einfache Methode zur Visualisierung des Gefäßsystems in Axolotl über Perfusion von 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin perchlorat (DiI). DiI ist ein lipophiler Carbocyaninfarbstoff, der sofort in die Plasmamembran von Endothelzellen eindringt. Die Perfusion erfolgt mit einer peristaltischen Pumpe, so dass DiI durch die Aorta in die Zirkulation gelangt. Während der Perfusion fließt der Farbstoff durch die Blutgefäße des Axolotls und schließt sich bei Kontakt in die Lipiddoppelschicht von vaskulären Endothelzellen ein. Das Perfusionsverfahren dauert etwa eine Stunde für ein Acht-Zoll-Axolotl. Unmittelbar nach Perfusion wiDas Diolotl kann mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden. Der DiI emittiert Licht im rot-orange Bereich, wenn er mit einem grünen Fluoreszenzfilter angeregt wird. Dieses DiI-Perfusionsverfahren kann verwendet werden, um die vaskuläre Struktur von Axolotten zu visualisieren oder Muster der Revaskularisierung in regenerierenden Geweben zu demonstrieren.

<html> Mit der DiI-Färbung kann die Vaskulatur des Axolotls leicht sichtbar gemacht werden. Blutgefäße von Tieren, die mit dem lipophilen Farbstoff perfundiert wurden, sind sofort unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop sichtbar. Abbildung 1: 1-1.5 ist eine schematische Darstellung des Perfusionsprotokolls. Nach der Perfusion mit dem hellen rosa Farbstoff wird ein erfolgreich perfundiertes Axolotl rosa erscheinen. Mit einem grünen Fluoreszenzfilter auf einem konfokalen Mikroskop erscheint eine rote Emission des Gefäßnetzes. Die DiI-Färbung erfolgt in allen Körpergeweben, wenn die Perfusion erfolgreich ist, einschließlich des Schwanzes, der Gliedmaßen, der Kiemen und der Augen (Abbildung 2A , Abbildung 2B , Abbildung 2C , Abbildung 2D ). Erfolglose Perfusionen führen zu einem Mangel an rotgefärbtem Gefäß oder bei fleckiger Färbung der Gefäße. Ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55740/55740fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Perfusionsprotokolls Axolotls, die mit dem lipophilen Farbstoff DiI erfolgreich perfundiert wurden, zeigen eine vollständige Färbung des Gefäßsystems bei der Bildgebung. 1: Volles supine axolotl vor Perfusionsexperiment 2: Die Brust des Axolotls öffnen. 2: Axolotl mit offener Brusthöhle. 3: Insertion der 27 G Schmetterlingsnadel in die Aorta des Axolotls. 4: Tubing sollte zunächst 0,7x PBS, dann die DiI-Arbeitslösung und schließlich 4% PFA enthalten. 5: Vollständig perfundierte Axolotten erscheinen rosa. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55740/55740fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55740/55740fig2.jpg" /> Abbildung 2: Bilder eines völlig perfundierten AxoloTl Bilder des Axolotl-Gefäßsystems wurden mit einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop nach erfolgreicher Perfusion mit dem DiI-Fleck aufgenommen. 2A: Schwanz 2B: Fuß 2C: Kiemen. 2D: Auge Die Bildgebung erfolgt mit einem konfokalen Mikroskop mit einem grün fluoreszierenden Emissionsfilterwürfel. Die Vergrößerung der Bilder A, B, C und D beträgt 1,74X, 2,16x, 1,18X bzw. 5,69X. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55740/55740fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Unter Verwendung einer lipophilen 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI) -Färbetechnik kann Ambystoma mexicanum eine vaskuläre Perfusion durchlaufen, um eine leichte Visualisierung des Gefäßsystems zu ermöglichen.

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K Aufrufe.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  Unter Verwendung einer lipophilen 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI) -Färbetechnik kann Ambystoma mexicanum eine vaskuläre Perfusion durchlaufen, um eine leichte Visualisierung des Gefäßsystems zu ermöglichen. 

Serie: DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Forschung

Genetik

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Entwicklungsbiologie

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The cerebral vasculature dynamically responds to various pathophysiological states and it exhibits considerable differences between strains and under conditions of genetic manipulations. Essentially, a reliable technique for intracranial vessel staining is essential in order to study the pathogenesis of ischemic stroke. Until recently, a set of different techniques has been employed to visualize the cerebral vasculature including injection of low viscosity resin, araldite F, gelatin mixed with various dyes1 (i.e. carmine red, India ink) or latex with2 or without3 carbon black. Perfusion of white latex compound through the ascending aorta has been first reported by Coyle and Jokelainen3. Maeda et al.2 have modified the protocol by adding carbon black ink to the latex compound for improved contrast visualization of the vessels after saline perfusion of the brain. However, inefficient perfusion and inadequate filling of the vessels are frequently experienced due to high viscosity of the latex compound4. Therefore, we have described a simple and cost-effective technique using a mixture of two commercially available carbon black inks (CB1 and CB2) to visualize the cerebral vasculature in a reproducible manner5. We have shown that perfusion with CB1+CB2 in mice results in staining of significantly smaller cerebral vessels at a higher density in comparison to latex perfusion5. Here, we describe our protocol to identify the anastomotic points between the anterior (ACA) and middle cerebral arteries (MCA) to study vessel variations in mice with different genetic backgrounds. Finally, we demonstrate the feasibility of our technique in a transient focal cerebral ischemia model in mice by combining CB1+CB2-mediated vessel staining with TTC staining in various degrees of ischemic injuries.

Analysis of rodent cerebrovascular anatomy plays an important role in experimental stroke research. In this context, intravascular perfusion with colored latex has been considered as a standard tool for several years. However, this technique implies distinct technical limitations, which undermine its reproducibility. Here, we describe a simple method to visualize cerebral vessels in a reproducible manner. Injection of a mixture of two commercially available carbon black inks through the left myocardial ventricle results in adequate filling of cerebral vessels with high contrast visualization. We have successfully applied this technique to identify anastomotic points between cerebral vascular territories of mice with different genetic backgrounds. We finally give evidence that this novel and simple method for vessel staining can be combined with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining - a widely used tool to observe and analyze infarct volumes in mice.

Intravaskuläre Perfusion von Carbon Black Ink ermöglicht eine zuverlässige Visualisierung der Hirngefäße

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The ...

Neurowissenschaften

Erstellung eines mikrofluidikbasierten vaskularisierten humanen Mikrotumormodells

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Autor im Rampenlicht: Schaffung humaner vaskularisierter Mikrotumoren als Modelle für die translationale Krebsforschung 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Krebsforschung

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Biotechnik

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model species such as zebrafish and salamanders that are capable of intrinsic heart regeneration hold promise for future regenerative therapies for human patients. To evaluate the outcome of cardioregenerative experiments it is imperative that heart function can be monitored. The axolotl salamander (A. mexicanum) represents a well-established model species in regenerative biology attaining sizes that allows for evaluation of cardiac function. The purpose of this protocol is to establish methods to reproducibly measure cardiac function in the axolotl using echocardiography. The application of different anesthetics (benzocaine, MS-222, and propofol) is demonstrated, and the acquisition of two-dimensional (2D) echocardiographic data in both anesthetized and unanesthetized axolotls is described. 2D echocardiography of the three-dimensional (3D) heart can suffer from imprecision and subjectivity of measurements, and to alleviate this phenomenon a solid method, namely intra/inter-operator/observer analysis, to measure and minimize this bias is demonstrated. Finally, a method to acquire 3D echocardiographic data of the beating axolotl heart at a very high spatiotemporal resolution and with pronounced blood-to-tissue contrast is described. Overall, this protocol should provide the necessary methods to evaluate cardiac function and model anatomy, and flow dynamics in the axolotl using ultrasound imaging with applications in both regenerative biology and general physiological experiments.

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl Ambystoma Mexicanum

Here we present echocardiography protocols for two-dimensional and three-dimensional image acquisition of the beating heart of the axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), a model species in heart regeneration. These methods allow for longitudinal evaluation of cardiac function at a high spatiotemporal resolution.

2D und 3D Echokardiographie in der Axolotl (Z.B. geschieht)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model ...

Medizin

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in

Intravaskuläre Perfusion von Carbon Black Ink ermöglicht eine zuverlässige Visualisierung der Hirngefäße

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative

2D und 3D Echokardiographie in der Axolotl (Z.B. geschieht)

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle