Name: analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (Startup Fonds, BB) unterstützt.

1. Vorbereitung von Lösungen <ol><li> Bereiten Sie für jeden Versuch die folgenden Lösungen vor. <ol><li> Für die Fixierlösung 37% Formaldehyd zuzubereiten und bei RT zu lagern. Verdünnen Sie es in 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 1,42%. ACHTUNG: Formaldehyd wird als reizend, korrosiv, mutagen, teratogen und karzinogen eingestuft. Nicht einnehmen. Gas / Dämpfe / Dampf / Aerosol nicht einatmen. Bei unzureichender Belüftung Atemschutzgerät anlegen. Berührung mit Haut und Augen vermeiden. Von Inkompatibilitäten fernhalten, wie Oxidationsmittel, Reduktionsmittel, Säuren, Laugen und Feuchtigkeit. </li><li> Für die Glycin-Stop-Fix-Lösung 0,125 M Glycin in 1x PBS-Lösung zubereiten und bei RT aufbewahren. </li><li> Für die Zellschabelösung eine 1x PBS-Lösung in dH 2 O vorbereiten und auf Eis aufbewahren. Direkt vor der Verwendung Proteinase-Inhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) tOa Endkonzentration von 0,5 mM. ACHTUNG: PMSF ist als korrosiv und giftig eingestuft; Schutzkleidung tragen und in einem belüfteten Bereich verwenden. </li><li> Vor der Verwendung des Zell-Lyse-Puffers (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% NP40) wurde 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; 100X Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO): 104 mM 4- ( 2-Aminoethyl) benzolsulfonylfluorid-Hydrochlorid (AEBSF), 80 μM Aprotinin, 4 mM Bestatin, 1,4 mM E-64, 2 mM Leupeptin und 1,5 mM Pepstatin A) und 0,5 mM PMSF. </li><li> Direkt vor der Verwendung des Kerne-Lyse-Puffers (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1% SDS) fügen Sie 1X PIC und 0,5 mM PMSF hinzu. </li></ol></li></ol> 2. Zellfixierung und Scherung <ol><li> Wachsen Sie die Zellen auf 70-80% Konfluenz auf 10 cm Gewebekulturplatten. Stimulieren Sie die Zellen nach den experimentellen Zielen. </li><li> Das Gewebekulturmedium entfernen, 5 ml Fixierlösung zugeben und inkubierenDie Zellen für 10 min bei RT auf einer Schüttelplattform. </li><li> Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem 1x PBS. </li><li> Entfernen Sie die 1x PBS, fügen Sie 5 ml Glycin-Stop-Fix-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei RT auf einer Schüttelplattform. </li><li> Entfernen Sie die Glycin-Stop-Fix-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem 1x PBS. </li><li> Entfernen Sie die 1x PBS, fügen Sie 2 ml Zellschaberlösung hinzu und ernten Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Übertragen Sie die geernteten Zellen auf ein konisches Rohr auf Eis. </li><li> Die Proben für 10 min bei 600 xg und 4 ° C zentrifugieren. </li><li> Den Überstand entfernen, das Pellet in 1 ml 1X-Zell-Lysepuffer resuspendieren und 30 min auf Eis inkubieren. Alternativ das Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C aufbewahren. </li><li> Sobald das Pellet im Zelllysepuffer resuspendiert ist, übergeben Sie die Zellsuspension auf einen eiskalten Dounce-Homogenisator und treten für 10 Hübe mit einem Typ-B-Pest aufE für zellunterbrechung </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben für 10 min bei 2.400 xg und 4 ° C. </li><li> Den Überstand verwerfen, das Pellet in 350 &amp; mgr; l Kornverdauungspuffer resuspendieren und die Proben 5 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Mikrokokken-Nuklease (1 U / μL) zugeben und durch Vortexen mischen. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 5-20 min; Mischen Sie die Proben alle 2 min durch Inversion. HINWEIS: Die Zeit- und Enzymkonzentration unterscheidet sich zwischen Zelllinien und kann bei der suboptimalen enzymatischen Scherung eine Optimierung erfordern. </li><li> Alternativ erreichen Sie die Chromatin-Scherung durch Ultraschallbehandlung mit handelsüblichen Schallapparaten. HINWEIS: Die Sondenbedingungen erfordern eine Optimierung. Ein Optimierungsbeispielprotokoll wird unten unter Verwendung eines Probenvolumens von 300 &amp; mgr; l und einer Probenverarbeitungsleistung von 25% bereitgestellt. <ol><li> Nach Schritt 2.10 den Überstand verwerfen und den n resuspendierenUnclear Pellet in 1,0 ml handelsüblicher Scherpuffer. </li><li> Aliquotieren Sie 300 μl des resuspendierten Kernpellets in drei 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Lege sie auf Eis. </li><li> Die 3 Aliquots des fixierten Chromatins mit 25% iger Leistung mit 3 verschiedenen Bedingungen abscheren, um die optimalen Beschallungsbedingungen zu bestimmen: 5 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls. 10 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls. 20 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 2.15 fort, wie unten beschrieben. </li></ol></li><li> Nach der Inkubation mit der Mikrokokken-Nuklease werden 7 μl eiskaltes 0,5 M EDTA zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. </li><li> Zentrifugieren der Proben mit der gescherten DNA für 10 min bei 16.200 xg und 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie den gescherten DNA-haltigen Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Aliquot 50 μL in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen zur Bestätigung der suCcessful Scherung der DNA (Abschnitt 3). Verwenden Sie das verbleibende Volumen sofort für die Immunpräzipitation (Abschnitt 4) oder lagern Sie es bei -80 ° C. </li></ol> 3. Bestätigung der Scherwirkung <ol><li> Füge 150 μl nukleasefreies dH 2 O und 10 μl 5 M NaCl zu dem 50 μl Aliquot des gescherten Chromatins aus Schritt 2.16 hinzu. </li><li> Inkubieren Sie die Proben bei 65 ° C für 4 h, um die Vernetzungen umzukehren. </li><li> 2 &amp; mgr; l RNase A (10 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l) zugeben und die Proben bei 37 ° C für 15 min inkubieren. </li><li> 10 μl Proteinase K (0,5 μg / μL) zugeben und die Proben bei 42 ° C für 90 min inkubieren. </li><li> Zur Reinigung der DNA eine Phenol / Chloroform-Extraktion 12 durchführen . <ol><li> Fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 200 μl hinzu. 200 μl Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) zur Probe geben und 20 s vortexen. </li><li> Zentrifuge bei RaumtemperaturFür 5 min bei 16.000 x g. Die obere wässrige Phase vorsichtig entfernen und auf ein frisches Röhrchen überführen. Achten Sie darauf, kein Phenol während des Pipettierens zu tragen. </li><li> Fügen Sie 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat (NH 4 OAc), pH 5,2, hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals mit einem Finger flackern. Fügen Sie 2,5 Volumina eiskaltes 100% Ethanol hinzu und mischen Sie durch Vortexen für 5 s. Inkubieren Sie die Probe O / N bei -20 ° C oder mindestens 1 h bei -80 ° C. </li><li> Die Probe wird für 30 min bei 4 ° C und 16000 xg zentrifugiert, um die cDNA zu pelletieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. 1 ml RT, 70% Ethanol zugeben und das Röhrchen mehrmals umkehren. </li><li> Die Probe für 2 min bei 4 ° C und 16000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Das Pellet für 5-10 min bei RT trocknen. Das Pellet wird in 30 μl dH 2 O resuspendiert. </li></ol></li><li> Verwenden Sie ein 5 und 10 μl Aliquot der gereinigten DNA für die Gelelektrophorese mit einem 1% TAEAgarosegel HINWEIS: Erfolgreiche Chromatin-Scherung führt zu einem 200-1.500 bp DNA-Muster. Wenn die Scherung nicht erfolgreich ist, bestimmen Sie die optimalen Scherbedingungen für die spezifischen Zellen durch Modifizieren der Inkubationszeit des Scherungsschrittes (Schritt 2.12) auf 5, 10 und 15 min. </li><li> Verwenden Sie die restliche Probe, um die DNA-Konzentration der Probe zu analysieren. Reverse-berechnen die DNA-Konzentration in der Scher-Chromatin-Probe (Schritt 2.16); Für jede Behandlungsgruppe für die Immunpräzipitation die gleichen DNA-Mengen verwenden (Abschnitt 4). </li></ol> 4. Immunpräzipitation <ol><li> Kombinieren Sie 10-25 μg des gescherten, vernetzten Chromatins (Schritt 2.16) mit 25 μl ChIP-Grad-Protein G-Magnetperlen, 10 μl Immunpräzipitations-Verdünnungspuffer (Stammlösung: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 mM EDTA und 167 mM NaCl) und 1 &amp; mgr; l PIC. </li><li> Nach 4 h Inkubation fügen 1-10 μg Antikörper (der Antikörper-Konzentrat) hinzuWird auf der Grundlage der Affinität des Antikörpers variieren; Es sollte zunächst nach Herstellerempfehlungen verwendet und gegebenenfalls experimentell optimiert werden) in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und dH 2 O zu einem Endvolumen von 100 μl zugegeben. ANMERKUNG: Anstelle des oben beschriebenen direkten Immunpräzipitationsverfahrens kann das indirekte Immunpräzipitationsverfahren verwendet werden, indem zuerst das Chromatin mit den Antikörpern kombiniert und anschließend Protein G magnetische Perlen zugesetzt werden. </li><li> Inkubieren Sie die Proben auf einem End-to-End-Rotator für 4-12 h bei 4 ° C. </li></ol> 5. Elution <ol><li> Legen Sie die Rohre auf einen Magnetständer. Sobald die magnetischen Perlen auf der Seite des Rohres aggregieren, entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. </li><li> Waschen Sie die Perlen dreimal mit 800 μl Waschpuffer 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 und 150 mM NaCl); Mischen, indem man das Röhrchen mehrmals umkehrt. Legen Sie den Schlauch auf den Magnetständer aEntfernen Sie den Waschpuffer sorgfältig und entsorgen Sie ihn, sobald die magnetischen Perlen auf der Seite des Röhrchens aggregieren. </li><li> Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 800 μl Waschpuffer 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 und 500 mM NaCl); Mischen, indem man das Röhrchen mehrmals umkehrt. Legen Sie den Schlauch auf den Magnetständer und entfernen Sie den Waschpuffer vorsichtig und entsorgen Sie ihn, sobald sich die magnetischen Perlen auf der Seite des Rohres zusammensetzen. </li><li> Die Perlen in 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer (1% SDS und 100 mM NaHCO 3 ) resuspendieren und die Proben auf einem End-to-End-Rotator für 15 min bei RT inkubieren. </li><li> Legen Sie die Röhrchen auf einen Magnetständer, und sobald sich die magnetischen Perlen an der Seite des Röhrchens sammeln, übergeben Sie den Überstand in ein frisches Rohr. </li><li> Fügen Sie 6 μl 5 M NaCl hinzu, um die Vernetzung umzukehren, und 2 μl Proteinase K (0,5 μg / μL). Nach dem Mischen der Proben die Proben für 2 h bei 65 ° C inkubieren. </li><li> Zur Reinigung der DNA eine Phe durchführenNol / Chloroform-Extraktion 12 (Schritt 3.5) und anschließend das Pellet in 30 μl dH 2 O resuspendieren. HINWEIS: Die Proben können direkt auf Proteinbindungsstellen (Abschnitt 5) analysiert oder bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol> 6. Binding-Site-Analyse <ol><li> Führen Sie eine Analyse für spezifische Bindungsstellen innerhalb einer bekannten Nukleinsäuresequenz unter Verwendung von PCR oder qRT-PCR durch. Für das Primer-Design folgen Sie konventionellen PCR- oder qRT-PCR-Protokollen. Entwerfen Sie die Primer, um ein 150-400 bp Amplikon zu synthetisieren, das die Proteinbindungsstelle von Interesse überbrückt ( Abbildung 1 ). </li><li> Stellen Sie die PCR mit vier verschiedenen DNA-Matrizen ein, um die Spezifität zu gewährleisten: i) DNA aus ChIP, die mit dem interessierenden Antikörper immunpräzipitiert wurde, ii) DNA aus ChIP, immunpräzipitiert mit einem unspezifischen IgG-Antikörper, iii) Input-DNA und iv) H 2 O als a Negativkontrolle für die PCR, um die Kontamination auszuschließen. Im Falle der Bahnstimulation, Wählen Sie eine fünfte Schablone mit einem anderen Satz von Primern, die für eine bekannte Bindungsstelle des immunpräzipitierten Proteins spezifisch sind. HINWEIS: Im Falle der c-KIT-Liganden-Promotor-Analyse verwenden Sie herkömmliche PCR, um die TGF-β-induzierte SMAD-Bindung an der SBE innerhalb der c-KIT-Liganden-Promotorregion zu demonstrieren. Als Positivkontrolle führen wir PCR auf Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) als bekanntes Ziel der TGF-β-induzierten SMAD-Bindung durch. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In diesem Bericht zeigen wir die TGF-β1-induzierte Bindung von SMAD2 an eine SBE innerhalb des c-KIT-Liganden-Promotors und TGF-β1-induzierte Bindung von STAT3 an seine Erkennungssequenz innerhalb des TGF-β1-Liganden-Gens. Wir zeigen die Cytokin-induzierte Bindung beider Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation. Chromatin-Immunpräzipitation ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die direkte Bindung eines Proteins von Interesse für DNA zu demonstrieren, u...

Im Nukleus von Eukaryoten interagiert DNA mit Histonproteinen und nonhistonischen Proteinen und wird zu Chromatin kondensiert. Im physiologischen, pathophysiologischen und zellbiologischen Kontext werden zelluläre Funktionen räumlich und zeitweise durch chromatin-koordinierte Genexpression kontrolliert. DNA-Protein-Wechselwirkungen haben eine wesentliche Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen wie DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur sowie Protein-Expression. Daher ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen ein unentbehrliches Werkzeug bei der Bewertung von Genexpression und Zellfunktion. Es gibt mehrere Techniken zur Beurteilung von DNA-Protein-Wechselwirkungen in vitro , wie der Elektrophorese (Gel) Mobility Shift Assay (EMSA) und DNase I Footprinting 1 , 2 . Diese Techniken analysieren jedoch nicht die Protein-DNA-Wechselwirkung innerhalb des Chromatin- und Zellkontextes. ChIP iSa-Technik, die Proteine, die an ihre spezifischen DNA-Bindungsstellen gebunden sind, erfasst und dadurch die Identifizierung von DNA-Protein-Wechselwirkungen innerhalb des Chromatinkontextes erleichtert. Die Technik wurde ursprünglich von Gimour und Lis für die Beurteilung der RNA-Polymerase II-Bindung an spezifische Gene in Escherichia coli und Drosophila melanogaster 3 , 4 entwickelt . Es wird durch Fixierung der DNA-Protein-Komplexe durchgeführt, gefolgt von der Durchführung der Chromatingextraktion und der Scherung der DNA in ~ 200 Basenpaar (bp) Fragmente. Anschließend wird das DNA-gebundene Protein von Interesse durch Immunpräzipitation isoliert. Nach der Umkehrung der DNA-Protein-Vernetzung wird die DNA gereinigt und analysiert. Für die Analyse der Proteinbindungsstellen können mehrere Methoden angewendet werden, die von der Nukleinsäuresequenz der Proteinbindungsstelle innerhalb des Zielgens 5 abhängen. In Fällen, in denen die DNA-Sequenz bekannt ist, ist Standard PolYmerase Kettenreaktionen (PCR) können angewendet werden, wobei spezifische Primerpaare, die die bekannte Bindungsstelle flankieren, angewendet werden. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) kann auch verwendet werden 6 . In Fällen, in denen die Sequenz unbekannt ist, kann ChIP mit DNA-Mikroarrays (ChIP-on-Chip), DNA-Sequenzierung (ChIP-seq) oder Klonierungstechniken 7 , 8 , 9 kombiniert werden. Der TGF-β-Weg hat starke Tumorunterdrückungsfunktionen und ist ein Schlüsselweg in der Zelldifferenzierung. Es wird durch die Bindung des TGF-β1-Liganden an seinen kognitiven Rezeptorkomplex aktiviert, was zur Serin-Phosphorylierung von SMAD2 / 3-Transkriptionsfaktoren führt. Nach ihrer Assoziation mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4 verschiebt sich der SMAD-Komplex in den Zellkern und bindet an die SBE innerhalb der Promotorregion der Zielgene, wo er Gene kontrolliert, die den Zellzyklus, die Apoptose und die Zelldifferenzierung kontrollierenauf. Die Transkriptionsreaktion auf die TGF-β-Stimulation ist zelltyp- und kontextspezifisch 10 . In letzter Zeit haben wir eine positive Rückkopplungsschleife zwischen TGF-β und dem c-KIT-Pfad 11 beschrieben . In diesem Modell bindet TGF-β1-aktiviertes SMAD2 an den c-KIT-Liganden-Promotor und induziert seine Expression und Sekretion. Anschließend aktiviert der c-KIT-Ligand den c-KIT-Rezeptor auto- und para-crinisch. Die c-KIT-Rezeptor-Aktivierung führt zu STAT3 Tyr 705 -phosphorylierung über JAK1 / 2. Nach der STAT3-Aktivierung und der nuklearen Translokation bindet STAT3 an das TGF-β1-Liganden-Gen und reguliert seine Expression. Hier zeigen wir die wesentliche Rolle der ChIP-Analyse zur Identifizierung der SMAD2-Bindung an den c-KIT-Rezeptor-Liganden-Promotor und zur Identifizierung des Signaltransducers (und) Activators (von) Transkription 3 (STAT3-Bindung an die TGF- &amp; bgr; 1- Gen).

<table><tbody><tr><td>HepG2 cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>101-B1</td><td>Used at a concentration of 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Anti-SMAD2 antibody</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>5339</td><td>Amount used/IP: 3 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>Anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>4904</td><td>Amount used/IP: 3 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td><td>Active Motif</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Active Motif</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: SCF</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: SCF</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation

Mehrere zelluläre Prozesse, einschließlich DNA-Replikation und Reparatur, DNA-Rekombination und Genexpression, erfordern Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA. Daher regeln DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrere physiologische, pathophysiologische und biologische Funktionen wie Zelldifferenzierung, Zellproliferation, Zellzykluskontrolle, Chromosomenstabilität, epigenetische Genregulation und Zelltransformation. In eukaryotischen Zellen interagiert die DNA mit Histon- und Nonhiston-Proteinen und wird zu Chromatin kondensiert. Mehrere technische Werkzeuge können verwendet werden, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu analysieren, wie die Elektrophorese (Gel) Mobility Shift Assay (EMSA) und DNase I Footprinting. Diese Techniken analysieren jedoch die Protein-DNA-Interaktion in vitro , nicht im zellulären Kontext. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine Technik, die Proteine ​​an ihren spezifischen DNA-Bindungsstellen einfängt, wodurch die Identifizierung der DNA-Protein-Wechselwirkung ermöglicht wirdS in ihrem Chromatin-Kontext. Es erfolgt durch Fixierung der DNA-Protein-Wechselwirkung, gefolgt von einer Immunopräzipitation des Proteins von Interesse. Anschließend wurde die genomische Stelle, an der das Protein gebunden war, charakterisiert. Hier beschreiben und diskutieren wir ChIP und zeigen ihren analytischen Wert für die Identifizierung der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) -induzierten Bindung des Transkriptionsfaktors SMAD2 an SMAD Bindungselemente (SBE) innerhalb der Promotorregion des Tyrosin- Proteinkinase-Kit (c-KIT) -Rezeptorligand Stammzellfaktor (SCF).

Die Bindung des TGF-β1-Liganden an seinen kognitiven Rezeptorkomplex führt zur Serin-Phosphorylierung von SMAD2 / 3-Transkriptionsfaktoren, gefolgt von deren Assoziation mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4. Der SMAD-Komplex verschiebt sich zum Kern. TGF-β kann die Gentranskription entweder direkt über SMAD-Bindung an SBEs innerhalb regulatorischer Regionen der Zielgene oder indirekt durch die SMAD-regulierte Expression von Transkriptionsaktivatoren oder Repressoren regulieren, die ans...

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Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

DNA-Protein-Wechselwirkungen sind für mehrere biologische Prozesse essentiell. Bei der Auswertung von zellulären Funktionen ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen unentbehrlich für das Verständnis der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein mächtiges Werkzeug, um solche Wechselwirkungen in vivo zu analysieren .

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Aufrufe.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  DNA-Protein-Wechselwirkungen sind für mehrere biologische Prozesse essentiell. Bei der Auswertung von zellulären Funktionen ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen unentbehrlich für das Verständnis der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein mächtiges Werkzeug, um solche Wechselwirkungen in vivo zu analysieren . 

Serie: Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Forschung

Genetik

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Krebsforschung

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Ein umfassender Ansatz zur Untersuchung des Promotor-Interaktoms in seltenen Zellen

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity with their target gene promoters to control transcription. Although these regulatory elements are easy to identify, their target genes are difficult to predict, since most of them are cell-type specific and may be separated by hundreds of kilobases in the linear genome sequence, skipping over other non-target genes. For several years, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) has been the gold standard for the association of distal regulatory elements to their target genes. However, PCHi-C relies on the availability of millions of cells, prohibiting the study of rare cell populations such as those commonly obtained from primary tissues. To overcome this limitation, low input Capture Hi-C (liCHi-C), a cost-effective and customizable method to identify the repertoire of distal regulatory elements controlling each gene of the genome, has been developed. liCHi-C relies on a similar experimental and computational framework as PCHi-C, but by employing minimal tube changes, modifying&#160;the reagent concentration and volumes, and swapping or eliminating steps, it accounts&#160;for minimal material loss during library construction. Collectively, liCHi-C enables the study of gene regulation and spatiotemporal genome organization in the context of developmental biology and cellular function.

Autor im Rampenlicht: Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der promotorzentrierten räumlich-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen  

Gene expression is regulated by interactions of gene promoters with distal regulatory elements. Here, we descirbe how low input Capture Hi-C (liCHi-C) allows the identification of these interactions in rare cell types, which were previously unmeasurable.

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biologie

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Zusammenfassung

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Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren