Name: an efficient and flexible cell aggregation method for 3d spheroid production
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production at JoVE.com

The authors thank M. Gordon of the Queen's University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).

<ol>
	<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays.">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li><li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'chemoinvasion'+assay,+25+years+and+still+going+strong:+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis.">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture.">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li><li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering.">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4 (2007).</li><li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. 1078, 119-132 (2013).</li><li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension.">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells:+How+to+go+three-dimensional.">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und flexible Methode zur 3D - Zell Sphäroiden Herstellung der Architektur von in - vivo - Gewebe unter Verwendung von kostengünstigen und weithin verfügbare Reagenzien zu modellieren. Unser Protokoll nutzt die nicht-zytotoxischen und haftungsverbessernde Eigenschaften von MC 8, 9 Zellaggregation zu vermitteln und Zellschicht Bildung zu minimieren. Anders als Proteinbasis Matrices aus tierischen Quellen isoliert, MC inert, enthält keine Wachstumsfaktoren und durch Waschen leicht entfernt werden kann, so dass die Isolierung von Sphäroiden zur Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen ohne Anwesenheit von Restmatrix. Unser Protokoll nutzt schnelle Aggregation von konsistenten Zellzahlen homogen Größe Sphäroiden zu erzeugen, so dass ein direkter Vergleich der Sphäroiden unter verschiedenen experimentellen Bedingungen gezüchtet. Dieses Verfahren kann für Mischkulturen angepasst werden in vivo Tumorwachstum zu modellieren , indem feste Zahlen von mehreren Tumor-assoziierten Zelltypen kombiniert (zB Fibroblasten, Leukozyten, Stromazellen) , um genauer die Tumorumgebung darstellen. Modifikationen unserer Protokoll in hohen Konzentrationen von MC ausgesäten Zellen können hergestellt werden verankerungsunabhängiges Wachstum von Zellen in der Lage zu proliferieren in Suspension zu überwachen, und kann als anoikis Assay (Abschnitt 6) zu identifizieren oder zu quantifizieren Zelltransformation verwendet werden. Sphäroiden durch unser Protokoll erzeugt sind ideal für Anwendungen wie zum Beispiel Drogen-Screening, wodurch ein Vergleich des Zellwachstums, Stoffwechsel, Überleben und Invasivität zwischen den Behandlungsbedingungen. Isolierte Sphäroiden kann auch in einer extrazellulären Matrix, wie Kollagen eingebettet werden, zu bewerten und zu Zell Invasivität in einem 3D-Mikroumgebung (Abschnitt 2.2, 4) , die genauer Modelle in vivo Tumorwachstum zu quantifizieren. Weiter kann unser Protokoll große Mengen von Sphäroiden von der MC-Matrix für Protein- oder RNA-Präparation, so dass u zu isolieren, verwendet werden,sers Zellensignal oder Veränderungen der Genexpression in Reaktion auf die Behandlung oder Wachstumsbedingungen zu bewerten. Unsere Sphäroidbildung Protokoll erfordert die Optimierung von Serum und MC-Konzentrationen, und die Anzahl der für jede Zelllinie ausgesäten Zellen. Zellleitungsspezifischen Eigenschaften, wie die Lebensfähigkeit der Zellen, Zell-Zell- und Zell-Kunststoff Klebrigkeit kann signifikant die Leichtigkeit beeinflussen, mit der Sphäroide gebildet werden. Im Allgemeinen Zelllinien mit einer schlechten Rentabilität in Monolayer-Kultur erforderliche höhere Serumkonzentrationen Sphäroid Bildung zu fördern, während höhere Konzentrationen MC für stark haftend Zelllinien bevorzugt wurden. Wir empfehlen daher, Titrationen von Serum und MC die optimalen Bedingungen für das Überleben der Zelle (Serumkonzentration) zu bestimmen, durchgeführt werden, während einschichtige minimiert und Satelliten Sphäroidformation (MC-Konzentration). Diese Bedingungen sollten ohne Satelliten Erzeugung eines einzelnen diskreten Sphäroiden pro Vertiefung führen. Optimale Sphäroid Größe fürAnalyse ist anwendungsabhängig und wird durch die Anzahl der Zellen beimpft und Serumkonzentration (Schritt 1.4.7) beeinflusst. Weniger Zellen Impfen erzeugt kleinere Aggregate, die leichter homogen gefärbt sind, kann jedoch in vivo Zell-Zell- und Zell-Wechselwirkungen Mikroumgebung nicht reproduzieren. Erhöhen der Anzahl der Zellen beimpft erzeugt größere Sphäroide, die ein physiologisch repräsentativen hypoxischen Kern 10 enthalten kann , die das Zellverhalten und verändern Interpretationen des Wachstums oder Überlebens - Assays beeinträchtigen kann. Wenn jedoch zu groß ist, kann Sphäroiden sein zerbrechlich und sind leicht auseinander gebrochen oder während der Isolierung beschädigt. Größere Sphäroide sind auch viel härter ohne Plattformen für optische Schnitte (zB Lichtbogenfluoreszenzmikroskop) oder durch Einbetten oder Kryoschneiden und Färbung von Querschnitten durch das Sphäroid 11 spezialisierte Bildgebung zu visualisieren. Wir empfehlen ein Ziel Sphäroid Größe von 200 bis 500 &amp; mgr; m für Flexibilität undLeichtigkeit der für die meisten Anwendungen Handhabung. Insgesamt ist es wichtig, die Bedingungen für die Sphäroidbildung in sowohl einer Zellinie spezifische und anwendungsspezifische Art und Weise zu optimieren. Sphäroid Produktionsprotokolle erfordern besondere Aufmerksamkeit Kontamination von Sphäroiden durch Staub und andere Partikel zu vermeiden. Zellen zu Staub und andere unlösliche Verunreinigungen haften, was zu unregelmäßig geformten, lose anhaftenden Zellaggregate für den Einsatz in Analysen (3A) ungeeignet. Kontaminationsquellen kann durch Hindurchleiten alle Lösungen durch einen 0,45 um-Filter, Spülen der Zellschicht mit gefiltertem Medium vor der Dissoziation (Schritt 1.4.1), und Spülen Mehrkanal- Pipetten Reservoire mit gefiltertem Reinstwasser unmittelbar vor dem Gebrauch minimiert werden (Schritt 1.4.6.1). Ferner Baumwolle gefilterte serologischen Pipetten, die Fasern in Lösungen vergießen können, sollten vermieden werden. Obwohl nicht kritisch, kann Staub weiter durch dissociat vorbei reduziert werdenED-Zellen durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb vor der Aussaat (Schritt 1.4.6). Verdampfungsverlust des Mediums ist eine zusätzliche technische Überlegungen, insbesondere für Inkubationszeiten von mehr als 1 Woche , wie sie erforderlich durch bestimmte Zelllinien für die Sphäroid - Bildung (Tabelle 1) oder während anoikis Assays (Abschnitt 6). Verdampfung kann durch Animpfen Zellen in Vertiefungen in dem mittleren Bereich der Multi-Well-Platten, Füllen Umfang Vertiefungen mit Reinstwasser minimiert werden und lose die Ränder der Dichtungsplatte oder der Platte in einer befeuchteten Kammer umschließt. 3D-Zell Sphäroide sind ein wertvolles Modell für die Untersuchung von sowohl normalen als auch Tumorzellverhalten und Physiologie. Unser Protokoll ist ein schnelles und wirtschaftliches Verfahren zur Erzeugung von gleichbleibender Größe 3D-Zell Sphäroide, die in einer Auswahl von Assays und Anwendungen verwendet werden können. Diese Sphäroiden stellen wertvolle Werkzeuge für die Charakterisierung von Tumorwachstum und Mikro Wechselwirkungen sowie Modelle für preClinical Evaluierung neuer Therapien.

Biologisch relevante Beurteilung der Tumorzellverhalten ist eine Herausforderung mit herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkulturmethoden, zum Teil , weil diese nicht in angemessener Weise die Zelle Mikroumgebung in vivo gefunden reflektieren. Alternative Ansätze enthält extrazellulären Matrixkomponenten in die Kultur (zB Boyden - Kammer - Assays) sind physiologisch repräsentativ für die in vivo Gewebeumgebung. Jedoch können sie für die Beurteilung der einzelnen Zellverhaltens begrenzt, und nicht den Komplex in vivo Kombinationen von Zell-Matrix- und Zell-Zell - Wechselwirkungen rekapitulieren, die Gewebe- oder Tumorwachstum 1, 2, 3 tragen. Die Verwendung von mehrzelligen Sphäroiden ist ein neuer Ansatz, der genauer die kompakte Architektur von in vivo Zellwachstum 1 wiedergibt ,4. Sphäroide können verwendet werden , Zell-Matrix - Wechselwirkungen von normalen Zellen zu untersuchen, sondern kann auch als Tumor - Analoga wirken Charakteristika der Tumorprogression, wie metastatische Wachstum oder drug resistance 4 zu modellieren. Sphäroide können in einer Matrix 5 oder schneller eingebettet durch Vermehrung von Einzelzellen gebildet werden, durch die Aggregation von mehreren Zellen fördern 7 eine Einzelzellcluster (zB hängenden Tropfen, Zentrifugationsverfahren) 6, zu bilden. Bestehende Zellaggregation Techniken können teure Materialien oder spezielle Ausrüstung erfordern. Darüber hinaus haben diese Sphäroide eine Vielzahl von Größen und Morphologien und schwierig sein kann, in großen Mengen, so dass Vergleiche zwischen den Wachstumsbedingungen oder Behandlungen schwer herzustellen. Schließlich wird durch diese Verfahren erzeugten Sphäroide kann schwierig sein, von dem proteinischen extracel zu isolierenin anderen Anwendungen zellulären Matrix, in der sie für den Einsatz eingebettet. Hier beschreiben wir eine robuste und einfach modifizierbar Zellaggregation Methode für die schnelle Bildung von einheitlich bemessen Zelle Sphäroide mit handelsüblichen U-bottom zellabweisenden Platten und ein inertes haftungsvermittelnden Matrix, Methylcellulose. Einmal gebildet, werden diese mehrzellige Sphäroide für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gut isoliert. Das Protokoll ist auch leicht zu erzeugen Sphäroide durch Zellproliferation geeignet, die verwendet werden können, andere Zellprozesse zu beurteilen. Hier zeigen wir Zellinvasionsassays, durch Immunfluoreszenzfärbung quantifiziert, und ein anoikis Assay, wie beispielsweise Anwendungen dieser zwei unterschiedlichen Sphäroidbildung Protokolle.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>Used for PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer; Do not autoclave PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer upon addition of calcium chloride</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Used for PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer; Do not autoclave PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer upon addition of magnesium chloride</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Spheroid Formation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>For culturing TT cell line</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filter prior to use to remove particulate contaminants</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Prepare in water to 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Dissociation buffer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Invasion Assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use</td></tr><tr><td>DMEM Phenol Red Free Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium</td></tr><tr><td>Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemoattractant</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Immunofluorescence Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverglass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>For mounting excised spheroids</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Used to stain actin at 1:200</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Used in BSA blocking buffer</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>Antifade</td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Used in MOWIOL mounting medium</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Freeware, NIH</td><td>-</td><td>Used for image analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>For mounting excised spheroids</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Used in MOWIOL mounting medium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Used in fixation buffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Used in permeabilization buffer</td></tr></tbody></table>

an efficient and flexible cell aggregation method for 3d spheroid production

Monolayer - Zellkultur - Modell nicht ausreichend das in vivo Verhalten von Geweben, die Wechselwirkungen komplexen Zell-Zell- und Zell-Matrix beinhaltet. Dreidimensionale (3D) Zellkulturtechniken sind eine neue Innovation entwickelt, um die Mängel der adhärenten Zellkultur zu adressieren. Während verschiedene Techniken zur Gewebe Analoga in vitro Erzeugung entwickelt wurden , sind diese Verfahren häufig komplex, teuer herzustellen, erfordern spezielle Ausrüstung und durch Kompatibilität mit nur bestimmte Zelltypen beschränkt. Hier beschreiben wir eine schnelle und flexible Protokoll für Zellen in vielzelligen 3D Sphäroide konsistenter Größe aggregieren, die mit Wachstum einer Vielfalt von Tumor- und normalen Zelllinien kompatibel ist. Wir verwenden verschiedene Konzentrationen von Serum und Methylcellulose (MC) verankerungsunabhängigen Sphäroid Erzeugung und verhindern die Bildung von Zell-Monoschichten in einer hoch reproduzierbaren Weise zu fördern. Optimale Bedingungen für indivIdual Zelllinien kann durch Einstellen MC oder Serumkonzentrationen in der Sphäroidbildung Medium erreicht werden. Die 3D-Sphäroiden erzeugt wird, kann für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gesammelt werden, einschließlich Zellsignalisierung oder Genexpressionsstudien, Kandidat Wirkstoff-Screening oder bei der Untersuchung von zellulären Prozessen wie Tumorzellinvasion und Migration. Das Protokoll wird auch klonale Sphäroide aus einzelnen Zellen zu erzeugen, ohne weiteres angepasst und angepasst werden kann, verankerungsunabhängiges Wachstum und anoikis Beständigkeit zu bewerten. Insgesamt bietet unser Protokoll eine leicht modifizierbare Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von 3D - Zell Sphäroide, um die 3D - Mikroumgebung von Geweben und modellieren das in vivo Wachstum von normalen und Tumorzellen zu rekapitulieren.

Wir beschreiben eine flexible und effiziente Methode diskreten Sphäroiden zu erzeugen, unter Verwendung von zellabstoßenden Platten und Sphäroidbildung Medien mit MC ergänzt. Unter den geeigneten Bedingungen von MC und Serum, siedeln einzelnen Zellen und halten uns zusammen in der Mitte des Brunnens Sphäroiden zu bilden, mit minimaler Einhaltung des Näpfchenboden. Unter Verwendung dieses Protokolls, Sphäroide wurden aus einer Vielzahl von Zelllinien (2B) erzeugt wird . Titration von MC und Serumkonzentrationen für jede Zelllinie erforderlichen optimalen Bedingungen zu ermitteln, in denen nur eine einzige Sphäroid gebildet wird, die robust genug ist, Manipulation zu ermöglichen, ohne fragmentieren. Optimal ist die Sphäroide lagen zwischen 200 bis 500 &amp; mgr; m im Durchmesser, und bestand aus dicht anhaftenden Zellen mit minimaler Zelltrümmer. Sphäroide überlebt schonende Behandlung ohne Schaden zu, so dass sie in einer Vielzahl von Assays gesammelt und verwendet werden. (3A) beeinträchtigt werden könnte, die in Aggregaten von toten Zellen führte. In Gegenwart von Staub oder anderen Faser Kontamination, Mehrfach- oder unregelmäßig geformte Zellhaufen, die nur schwach aggregiert gebildet wurden und die resultierende Sphäroide leicht auseinander brach bei der Handhabung. Sphäroid - Bildung wurde auch durch suboptimale Konzentrationen von MC oder Serum in der Sphäroidbildung Medium (3B) berührt. In unseren Tests waren viele Zelllinien können zellabweisenden Platten in Abwesenheit oder bei geringen Konzentrationen von MC und führte zur Bildung eines Sphäroids mit einer Zellmonoschicht (3B-ii) umgeben zu haften. BxPC-3-Zellwachstum suboptimal MC Bedingungen wird als ein Beispiel gezeigt. Im allgemeinen höhere Konzentrationen von MC verhindert Zellen zum gut anhaftende, aber eine zu hohe Konzentration von MC reduziert Zell-Zell-Adhäsion und verhindert Zellen auszum Boden des Bohrlochs Absetzen, zur Bildung von losen Aggregaten und zahlreichen Satelliten Sphäroide (3B-i) führt. Die Konzentration des Serums auch das Überleben der Zelle beeinflusst und Zell-Zell- und Zell-Kunststoff-Adhäsions- und benötigt für verschiedene Zelllinien optimiert werden. Für Zelllinien wie HCT-116 und PANC-1, eine zu hohe Serumkonzentration führte zu einer übermäßigen Zellproliferation und der Produktion von übergroßen Sphäroiden, die durch die Handhabung leicht beschädigt wurden oder die Zelladhäsion an dem Kunststoff gut gefördert und die Bildung einer Monoschicht ( 3B-iii). Interessanterweise unterschieden sich die Wirkungen nicht ausreichend Serum zwischen Zelllinien. HCT-116 wurde das Überleben der Zelle reduziert und die gebildeten Sphäroiden klein waren, einen großen Anteil an toten Zellen in niedrigen Serum enthält. Im Gegensatz dazu waren lebensfähig PANC-1 - Zellen in Abwesenheit von Serum, jedoch wurde mehr adhärenten und bildeten mehrere Aggregate sowie eine Zell - Monoschicht (3B-iv, v). <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; In Invasionsassays, vorgeformten Sphäroide wurden in neutralisierter Kollagen resuspendiert , um eine starre extrazellulären Matrix (Abschnitt 2.2, 4) zu erzeugen. Anschließende Zugabe von einzelnen Zellen induzierten chemoattractant vom Sphäroid nach außen zu bewegen , und dringt in die umgebenden Matrix (4B). Die Anzahl der eindringenden Zellen und Entfernung fallen kann in Gegenwart einer lebenden Zelle stain wie DAPI oder Calcein AM (Abschnitt 3, 4) durch Hellfeldmikroskopie oder durch Fluoreszenz-Mikroskopie quantifiziert werden. In unseren Tests morphologische Veränderungen, wie die Bildung von Vorsprüngen, sichtbar waren innerhalb von 6 h nach der Behandlung mit chemoattractant und zahlreichen Zellen vollständig aus dem Sphäroid Ablösen beobachtet werden können, und innerhalb von 18 bis 48 Stunden in die Kollagen eindringen. Für unsere Experimente fanden wir, dass 12 bis 18 h der Invasion war ideal, da längere Inkubationszeiten führten in Zellen zu weit von der sich bewegendenspheroid für eine optimale Bildgebung. Festkollagen eingebettet Sphäroide könnte durch Hellfeld- abgebildet werden, um den Abstand und die Anzahl der Zellen zu quantifizieren eindringenden oder Immunfluoreszenzmikroskopie (Abschnitte 3-5), zur Sichtbarmachung invasiver Strukturen durch die Zellen gebildet (Figuren 5B, 5C). Eine Modifikation der Sphäroidbildung Protokoll beschrieben, bei dem einzelne Zellen in höherer Konzentration MC suspendiert (30 mg / mL) verwendet werden anoikis Widerstand zu überwachen. Bei diesen MC-Konzentrationen Medium kann noch mit einer Pipette, während kühl übertragen werden, aber bei 37 ° C in ein festes Gel verdickt. Anoikis beständig in dieses Medium resuspendierten Zellen blieben in Suspension proliferiert und über einen Zeitraum von 2-4 Wochen, suspendiert Sphäroide unterschiedlicher Größe (6B) bildet. Verankerungsabhängigen Zellen bilden keine Sphäroide unter diesen Bedingungen. Wir waren in der Lage anoikis-Resistenz zu quantifizieren, indem die taub Zählener von Sphäroiden in jeder Vertiefung gebildet wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig1.jpg" /> Abbildung 1: Überblick über die 3D - Sphäroidformation Protokoll. Zellen in Monolayer-Kultur gezüchtet werden dissoziiert, gezählt, pelletiert und in Sphäroidbildung Medium mit Methylcellulose (MC) und Serum (i-iv) ergänzt resuspendiert. Die Suspension wird ausgesät in eine U-bottom zellabweisenden Platte an gewünschten Dichte Bildung von Sphäroiden mit der gewünschten Größe zu ermöglichen, (v), und die Platte wird in jede Vertiefung (vi) eine einzelne, diskrete Zell-Sphäroiden zu erzeugen inkubiert. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig2.jpg" /> Abbildung 2: Optimierte Sphäroidformation Bedingungen.(A) Sphäroidformation unter optimalen Bedingungen für SH-SY5Y - Zellen. 1000 Zellen ausgesät in U-Boden zellabweisenden Platten in Medium mit 5% Serum ergänzt und 1 mg / ml MC aggregiert in kompakte Sphäroide innerhalb von 24 h. (B) Repräsentative Bilder von verschiedenen Zelllinien unter optimalen Bedingungen gebildet Sphäroiden in Tabelle 1 gezeigt <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig3.jpg" /> Abbildung 3: Sphäroidformation unter suboptimalen Bedingungen. (A) Sphäroide in Gegenwart von Verunreinigungen gebildet. Die mikrobielle Kontamination führte zu Zelltod und lose aggregiert Sphäroiden. In Anwesenheit von unlöslichen Verunreinigungen, wie beispielsweise Staub oder Fasern, auf diese Materialien adhärierten Zellen und nicht AGGREGaß. (B) Sphäroidbildung in suboptimal Sphäroidbildung Medium. BxPC-3 ausgesäten Zellen in Gegenwart von überschüssigem MC (10 mg / mL) zahlreiche Satelliten Sphäroide (i) gebildet, während unzureichende MC (0 mg / ml) führte zu Zellaggregaten, die mit dem Vertiefungsboden geklebt und eine Monoschicht gebildet wird (ii ). Ähnliche Ergebnisse wurden für die anderen getesteten Zelllinien beobachtet (nicht gezeigt). Überschüssiges Serum (20%) führte zu einer erhöhten HCT-116-Zellproliferation und der Monoschichtbildung (iii). Unzureichend Serum (0%) hatten Zellleitungsspezifische Effekte reichen von Zelltod in HCT-116 (iv) zur Bildung von Satelliten Sphäroide in PANC-1 (v). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig4.jpg" /> Abbildung 4: Invasion Assay Sphäroiden Verwendung. (A) Overview von Sphäroid Invasionstest. Das Abbildungsgefäß vorbeschichtet mit einer Schicht aus neutralisiertem Kollagen und inkubiert, um das Kollagen (i-ii) zu polymerisieren. Vorgeformte Sphäroide werden in 1,5 ml-Röhrchen pelletiert und in neutralisiert Kollagen (iii-vi) gesammelt. Das Sphäroid-Kollagen-Mischung wird auf das Kollagen Basisschicht überschichtet und inkubiert, um das Kollagen (vii-viii) zu polymerisieren. Wachstumsmedium gewünschten Verbindungen enthält, wird dann auf die polymerisierten Sphäroid-Kollagenschicht überschichtet und inkubiert, um die Zellinvasion (ix-x) ermöglichen. (B) in Gegenwart eines chemoattractant werden die Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten Invasion in das umgebende Kollagenmatrix aus einem eingebetteten PANC-1 Sphäroid gezeigt. Jedes Panel zeigt ein Phasenkontrastbild ein 10X-Objektiv erworben werden. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig5.jpg" /> Abbildung 5: Immunfluoreszenzanfärbung von Collagen-embedded Sphäroiden. (A) Übersicht Protokoll für Immunfluoreszenzanfärbung von Sphäroiden. Eingebettete Sphäroide werden gewaschen, fixiert (NBF) und blockiert (BSA) direkt in dem Bilderzeugungsgefäß. Sphäroide können in einem kleineren Volumen, wie beispielsweise ein 1,5-ml-Röhrchen direkt oder ausgeschnitten und gefärbt gefärbt werden. Sphäroiden sollte mit einem Überschuss an Puffer nach jedem Fleck gewaschen werden Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Befleckten Sphäroide können direkt in den Behälter oder montiert unter einem Deckglas für die Bildgebung und Lagerung abgebildet werden. (B) Immunofluoreszenz Bilder eines TPC-1 - Zell - Sphäroiden in Kollagen eingebettet und für 24 h eindringen gelassen. (C) Bilder Phalloidin gefärbten Zellen typisch für Regionen in B angedeutet zeigt Jedes Panel zeigt eine 20 &amp; mgr; m Z-Projektion (0,2 &amp; mgr; m - Schritten) erwarb ein 60X Ziel mit: Zellen innerhalb der Sphäroid body etwa 20 um von der Oberfläche (1), Zellen in Kollagen hervorstehenden (2) und durch Kollagen eindringenden Zellen (3). Maßstabsbalken = 25 um. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig6.jpg" /> Abbildung 6: Sphäroidformation Anoikis Assay. (A) Übersicht Protokoll für anoikis Assays. Zellen werden hergestellt, wie in Figur 1 beschrieben, jedoch werden in Sphäroidbildung Medium, das mindestens 30 mg / ml MC, die eine dicke Schicht einzelnen Zellen in Suspension zu halten bildet resuspendiert und Zellaggregation (i-ii) zu verhindern. Die Zellsuspension wird ausgesät in U-Bodenzelle abweisenden Platten und inkubiert (III-iv). Die suspendierten Zellen können für Sphäroidbildung durch Proliferation überwacht werden, anoikis Widerstand anzeigt. ( <strong&gt; B) Repräsentative Bilder der Koloniebildung während anoikis Assays. TPC-1-Zellen wurden in Suspension mit 30 mg / mL MC und abgebildet zu den angegebenen Zeitpunkten statt. Zellen, die fähig sind anoikis zu wider proliferieren Sphäroide zu bilden. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zelllinie </td><td> MC (mg / mL) </td><td> Serum (%) </td><td> Ungefähre Inkubation Zeit </td></tr><tr><td> SH-SY5Y </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 24 Stunden </td></tr><tr><td> BxPC-3 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 bis 5 Tage </td></tr><tr><td> PANC-1 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 bis 7 Tagen </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> 3</td><td> 10 </td><td> 2 bis 4 Tagen </td></tr><tr><td> TT </td><td> 1 </td><td> 10 </td><td> 7 bis 10 Tage </td></tr><tr><td> TPC-1 </td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 1 bis 2 Tage </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Optimale Sphäroidformation Medium Zusammensetzung und Inkubationszeiten für validierte Zelllinien.

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production at JoVE.com

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

an-efficient-flexible-cell-aggregation-method-for-3d-spheroid

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Aufrufe.  Queen's University Cancer Research Institute. Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions. 

Serie: An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Forschung

Biotechnik

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

Biochemie

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the living body than two-dimensional cell culture. In this study, we fabricated an electrical motor-driven lab-on-a-CD (compact disc) platform, called a centrifugal microfluidic-based spheroid (CMS) culture system, to create three-dimensional (3D) cell spheroids implementing high centrifugal force. This device can vary rotation speeds to generate gravity conditions from 1 x g to 521 x g. The CMS system is 6 cm in diameter, has one hundred 400 &#956;m microwells, and is made by molding with polydimethylsiloxane in a polycarbonate mold premade by a computer numerical control machine. A barrier wall at the channel entrance of the CMS system uses centrifugal force to spread cells evenly inside the chip. At the end of the channel, there is a slide region that allows the cells to enter the microwells. As a demonstration, spheroids were generated by monoculture and coculture of human adipose-derived stem cells and human lung fibroblasts under high gravity conditions using the system. The CMS system used a simple operation scheme to produce coculture spheroids of various structures of concentric, Janus, and sandwich. The CMS system will be useful in cell biology and tissue engineering studies that require spheroids and organoid culture of single or multiple cell types.

We present a motor-powered centrifugal microfluidic device that can cultivate cell spheroids. Using this device, spheroids of single or multiple cell types could be easily cocultured under high gravity conditions.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Skalierbare Erzeugung von einheitlichen Zell-Sphäroiden mit Hilfe eines 3D-Akustik-Montagegeräts

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer gerüstfreien akustischen Assemblierungsmethode für hochwertige 3D-Zell-Sphäroid-Kulturen 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

Multizelluläre Sphäroidbildung für FLIM-basierte Stoffwechsel- und Hypoxieanalytik

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Autor im Rampenlicht: Standardisierung von Methoden zur Sphäroidbildung für die Stoffwechsel- und Oxygenierungsanalyse mittels Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden