Der Autor dankt Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) für die Nasslaborfläche Bereitstellung von Infrastruktur und zur Durchführung Experimente und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Förderung der Arbeit durch ein Forschungsstipendium (LI 2402 / 2-1).

1. Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten (und Asymmetrisch Modified) Schwester Histone Hinweis: Das aktuelle Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen mit unterschiedlich isotopenmarkierten Histon H3. Zu diesem Zweck wurden zwei Pools von Histon H3 verwendet wird; war 15 N-markierte und enthielt einen 6xHis-Tag am N-Terminus und die zweite war 13 C-markiertem und enthielt die Strep - Peptid (WSHPQFEK) am N-Terminus fusioniert ist . Beide Tags wurden von der nativen H3-Sequenz mit einer Tabakätzvirus (TEV) Protease-Erkennungsstelle getrennt. Zur Herstellung von Nukleosomen zusätzliche asymmetrisch geändert, einer der beiden H3-Pools in einem vormodifizierter Form enthalten. Premodification eines Histon - Pool kann durch die Umsetzung des isotopenmarkierten Histon von Interesse mit dem jeweiligen histonmodifizierende Enzym in Gegenwart der notwendigen für jede Art von Reaktions Cofaktoren / PTM Spender 1 durchgeführt werden ,6. Die effiziente Platzierung des jeweiligen PTM kann durch NMR-Spektroskopie oder Massenspektroskopie beurteilt werden. Die Mengen an Histone / DNA hier verwendet, sind grobe Empfehlungen eine Nukleosomen-Präparation mit einer ungefähren Konzentration von 10 uM zu erhalten (gemessen als DNA-Konzentration bei 260 nm) .Diese Endausbeute ist ausreichend, um gute Qualität NMR-Spektren mit relativ kurzen Erfassungszeiten aufzeichnen. <ol><li> Rekonstitution eines Histonoktamer mit unterschiedlich isotopenmarkierten (und asymmetrisch modifiziert) Histon H3 HINWEIS: Recombinant Histon - Proteine können in mg - Mengen in BL21 (DE3) pLysS - Zellen 14 hergestellt werden. An isotopenmarkierten Histonen, der gleiche Ausdruck / Reinigungsprotokoll wird gefolgt mit der Ausnahme , daß für das Bakterienwachstum einem Minimalmedium , das 15 NH 4 Cl und / oder 13 C-Glucose als Stickstoff- und Kohlenstoffquellen, beispiels 15 N- oder 13 erhalten C-Kennzeichnung respectively. Gereinigtes Histone sind gegen 5 mM β-Mercaptoethanol dialysiert und vor der Verwendung lyophilisiert gelagert. <ol><li> Auflösen lyophilisierten Histon Aliquots, enthaltend ~ 5 mg jedes Histon in 1 ml Entfalten Puffer (7 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Fügen Sie beide Arten von Histon H3. Mischen durch Pipettieren und nicht vortexen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis für 30 min zu ermöglichen vollständige Entfaltung. </li><li> Bestimmen die genaue Konzentration jedes Histon durch die Absorption bei 280 nm gemessen wurde gegen Puffer Entfalten und Verwenden Extinktionskoeffizienten berechnet mit dem ProtParam Werkzeug des ExPASy-Portal. 15 </li><li> Mischen Sie die Core-Histone zu äquimolaren Verhältnissen, unter Berücksichtigung von 50% jeder der beiden Histon H3-Pools gehören. Beginnen Sie mit den ganzen Inhalt der weniger konzentrierten Histon verwenden und dementsprechend alle anderen hinzuzufügen. </li><li> Einstellen endgültige Proteinkonzentration auf ungefähr 1 mg / ml unter Verwendung von Puffer Entfalten. </li><li> transfer die Mischung auf eine 6 kDa-Cutoff-Dialysemembran und dialysiert gegen 1-2 L gekühlter Rückfaltungspuffer (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) bei 4 ° C. Ändern des Puffers mindestens einmal nach der Dialyse für mindestens 3 h fortgeschritten ist. Führen Sie eine abschließende Dialyse O / N bei 4 ° C. </li><li> Sammeln Sie dialysierte Material und entfernen Sie alle Niederschläge durch Zentrifugation in einer Mikrofuge für 5 min bei 4 ° C auf maximale Geschwindigkeit (in der Regel sollte kein Niederschlag beobachtet werden). Bestimmen Octamer Konzentration durch die Extinktion bei 280 nm gemessen wird. In den Berechnungen verwenden die zusätzlichen Extinktionskoeffizienten von Histonen, unter Berücksichtigung der doppelten jeden Wert. </li><li> Konzentrat zu einem Endvolumen von ~ 2 ml einer 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter Einheit. Neu berechnen Oktamers Konzentration und Schätzung Verlust. An diesem Punkt wird ein Octamer Konzentration zwischen 50 bis 100 &amp; mgr; M erhalten werden sollte. </li><li> Schließen Sie das Gelfiltrationssäule (angegeben in der Tabelle der Materialien) zu einemFPLC-System und ins Gleichgewicht mit 2 Säulenvolumina (CV) von 0,22 um filtriert und entgast bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min und einem Druck von 0,5 MPa Grenze Rückfaltungspuffer. HINWEIS: Die Gelfiltrationslauf sollte im Kühlraum oder in einem kalten Schrank durchgeführt werden. </li><li> Spritzen Sie konzentrierte Material eine Durchflussrate von 1 ml / min und 1,0 sammeln - 1,5-ml-Fraktionen. </li><li> Folgen Sie das chromatographische Profil und beobachten Histonoktamer Elution bei ~ 65-68 ml. HINWEIS: Eine kleine Schulter des Elutionspeak und ein Peak bei ~ 80 ml weist auf die Existenz von freien H3-H4 - Tetramere und H2A-H2B Dimere sind. </li><li> Laufen 20 ul jeder gesammelten Fraktion in einer 18% SDS-PAGE-Gel. HINWEIS: Verdünnen Sie die Proben mit einem Faktor von mindestens 2 mit Wasser , bevor sie auf das Gel laden die hohe Salzkonzentration und damit Vermeidung von Wettbewerbsverzerrungen zu verringern. Gleiches gilt für die anschließende SDS-PAGE Analysen von Proben in Puffer Neufaltung. </li><li> Pool relevant fractions mit reinem Octamere durch die gleichmäßige Verteilung der 4 Histone auf dem gefärbten Gel beurteilt und bestimmen Konzentration nach wie vor (Schritt 1.1.7). </li><li> Verbinden einer 1 - ml - Ni-NTA - Säule (Table of Materials) mit einem FPLC - System und Äquilibrieren mit 10 CV von 0,22 um filtriert und entgast Puffer Neufaltung bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min. HINWEIS: Die Ni-NTA - Chromatographie sollte im Kühlraum oder in einem kalten Schrank durchgeführt werden. </li><li> Passieren gereinigter Octamer durch die Ni-NTA eine Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml / min verwendet wird. </li><li> Sammeln Sie Flow-Through und halten Proben für SDS-PAGE / WB-Analyse (20 &amp; mgr; l und 4 &amp; mgr; l, beziehungsweise). Anschließend waschen Säule mit 10 CV eines Basissignals erreicht wird, Puffer oder bis Neufaltung. </li><li> Eluieren mit 10 CV von Rückfaltungspuffer, enthaltend 250 mM Imidazol eine Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml / min verwendet wird. Halten Proben für SDS-PAGE / WB-Analyse (20 &amp; mgr; l und 4 &amp; mgr; l, jeweils). </li><li> Äquilibrieren eine 1 ml-Affinitätssäule von acommercial Streptavidin (Table of Materials) mit 10 CV Umfaltungspufferkomponenten 250 mM Imidazol enthält eine Charge / Schwerkraftfluss Setup. HINWEIS: Diese chromatographischen Schritt sollte im Kühlraum durchgeführt werden. </li><li> Pass Ni-NTA Elution durch die kommerzielle Streptavidin-Affinitätssäule. </li><li> Sammeln Sie Fluss durch und halten Proben für SDS-PAGE / WB-Analyse (20 &amp; mgr; l und 4 &amp; mgr; l, beziehungsweise). Anschließend waschen mit 10 CV von Puffer Neufaltung. </li><li> Eluieren mit 10 CV von Umfaltungspufferkomponenten 2,5 mM Desthiobiotin enthält. Halten Sie Proben für die SDS-PAGE / WB-Analyse (20 und 4 &amp; mgr; l jeweils). </li><li> Messen Sie Oktamers Konzentration, mit 10-mal weniger TEV-Protease und lassen Reaktion gehen über Nacht bei 4 ° C in einer Standard-Kunststoff-Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die notwendige Menge an TEV zu erhalten vollständigen Verdau (Entfernung der Affinitätstags) abhängig von der Herkunft (Konstrukt) und der Aktivität (frisch hergestellt wird rekombinantes TEV mehraktiv im Vergleich zu dem für längere Zeiträume bei gespeichert - 80 ° C). Versuchen Sie zunächst die Zugabe von 10-mal weniger TEV zum Oktamers verglichen (geschätzt als Proteinkonzentrationen) und entsprechend anpassen. </li><li> Check für den effizienten Verdau von 20 &amp; mgr; l des Gemisches ausgeführt wird vor und nach der Zugabe TEV auf einem 18% SDS-PAGE-Gel. Wenn die Verdauung nicht vollständig ist, mehr TEV-Protease hinzufügen und weiter Inkubation für eine weitere 3-4 h. </li><li> Dialysiere Probe gegen Puffer Neufaltung eine 50 kDa-Cutoff-Dialysemembran mit TEV-Protease zu entfernen und Pufferzusammensetzung anzupassen. </li><li> Konzentriere das gereinigte asymmetrische Octamer eine 10 kDa-Cutoff Zentrifugalfiltereinheit verwendet (dieselbe Filtereinheit aus Schritt 1.1.7 können auch verwendet werden) auf ein Volumen von 1,0-2,0 ml. Messen Sie die Endkonzentration. Verwenden Sie entweder kurz nach der für Nukleosomen Rekonstitution oder anpassen, um 50% (v / v) Glycerin für einen längeren Zeitraum bei -20 ° C zu lagern. An dieser Stelle und mindestens 70% Verlust in den vorangegangenen Schritten erwartet, th50 uM - e Octamer-Konzentration im Bereich von 20 sein sollte. </li></ol></li><li> Nucleosome Rekonstitution <ol><li> Wenn Octamer in 50% Glycerin gelagert wurde, dialysiert über Nacht bei 4 ° C gegen Puffer Neufaltung bevor mit Nukleosomen Rekonstitution fortfahren. </li><li> Passen DNA Salzkonzentration auf 2 M NaCl unter Verwendung einer 5 M NaCl-Stammlösung (eine Nukleosomen-Positionierung Sequenz enthält). HINWEIS: Die gereinigte DNA entweder isoliert nach Reinigung eines Plasmids , das mehrere Kopien der gewünschten Sequenz synthetisiert oder durch PCR - Amplifizierung enthält konzentriert werden sollte speichernden ~ 50 &amp; mgr; M in Wasser oder in einem Standard - Tris-EDTA - Puffer. </li><li> Mischungs Octamer und DNA unter Verwendung des optimalen Verhältnisses bestimmt von einem kleinen Test. Verwenden Rückfaltungspuffer das Endvolumen auf ~ 3,0 ml einzustellen. Fügen Sie immer die Oktamers letzte jede Möglichkeit zu verhindern, dass von der Octamer und die DNA bei &lt;2 M Salzkonzentrationen zu mischen. <ol><li> Mit den ersten kleinen scDNA-Verhältnis, das zu einer optimalen Nukleosomen Ausbeuten führt: ale Rekonstitutionen die Oktamers zu bestimmen. Dazu montieren drei Reaktionen von 0,9: 1,0, 1,0: 1,0 und 1,1: 1,0 DNA: Oktamers Verhältnisse in einem Volumen zwischen 50 bis 100 &amp; mgr; l. Typischerweise wird eine Konzentration von 5 &amp; mgr; M DNA verwenden. </li><li> Fahren Sie mit der Rekonstitution wie unten (Schritte 1.2.4-1.2.8) beschrieben und am Ende, schätzen die Menge an löslichen und gute Qualität wiederhergestellt Nukleosomen durch die DNA-Konzentration bei 260 nm gemessen und durch eine 6% nativer PAGE DNA Gel läuft , mit Ethidiumbromid gefärbt, bzw. (5A). </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Mischung auf eine 6 kDa-Cutoff-Dialysemembran und dialysiert gegen 1 l Puffer über Nacht bei 4 ° C Neufaltung. </li><li> Reduzieren die Salzkonzentration des Dialysepuffers in einem stufenweise von 2 auf 0,85, 0,64 und 0,2 M NaCl auf. Halten Probe in jedem Puffer für mindestens 3 h. Manchmal Niederschlag wird nach dem letzten Übergang gebildet. In diesem Fall continue Dialyse wie geplant und zu entfernen Präzipitat durch Zentrifugation Mikrofuge am Ende des nächsten Schritts. </li><li> Transfer Dialysemembran in einem Becherglas mit 1 l Assaypuffer (25 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 pH 6,8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) und Dialyse O / N bei 4 ° C fortgesetzt. </li><li> Sammeln Probe, entfernen Sie alle Niederschlag bei Schritt 1.2.5 durch Zentrifugation in einer Mikrofuge für 5 min bei 4 ° C auf maximale Geschwindigkeit gebildet und konzentriert unter Verwendung eines 30 kDa-Cutoff-Zentrifugalfiltereinheit zu einem endgültigen Volumen von ~ 300 &amp; mgr; l. </li><li> Messen Sie DNA-Konzentration bei 260 nm, führen Sie eine 18% SDS-PAGE-Protein-Gel (4 ul der Probe) und einer 6% nativer PAGE DNA-Gel (0,2 ul der Probe) und speichern Probe bei 4 ° C für mehrere Wochen. Die Endkonzentration im Bereich von 10-20 &amp; mgr; M sein sollte. </li></ol></li></ol> 2. NMR-Analyse der Modifikationsreaktionen auf die beiden Schwester Histone HINWEIS: Zuordnung2D - 1 H- 15 N - Korrelationsspektren von nukleosomalen Histonschwänze können Referenzen 16, 17, 18 zu finden. Zusätzlich Zuweisungen von CH - Gruppen von Lysine x, Serine und Threonine auf 2D - 1 H- 13 C - Korrelationsspektren können bei Referenz 16 zu finden. <ol><li> NMR - Einrichtung und Aufzeichnung von Referenzspektren HINWEIS: Enzymatische Assays wurden durchgeführt unter Verwendung von 140 &amp; mgr; l der Probe in Nucleosomen Assaypuffer in ein 3-mm - NMR - Röhrchen bei 300 K. Verschiedene NMR - Röhrchen mit anderen Probenvolumina verwendet werden können. Die oben erwähnte Temperatur ist angemessen guter Qualität zu erhalten 1 H- 15 N - Korrelationsspektren von nukleosomalen Histonschwänze und gute enzymatischen Aktivitäten. 2D-SOFAST-HMQC 1 H- 15 N und 2D-HSQC 1 H- 13 C - Spektren wurden jeweils mit einem Setup - tHut verleiht ähnliche Erfassungszeiten. Typische Aufnahmeparameter sind 128 Transienten mit 1,024 (1 H) x 128 (15 N) Komplexpunkten und 32 Transienten mit 1,024 (1 H) x 64 (13 C) komplexe Punkte für die beiden verschiedenen Typen von Korrelationsspektren. Für beide 2D-Spektren war die Akquisitionszeit ~ 30 min. <ol><li> Auf 300 K als die Probentemperatur in dem Spektrometer. Fügen Sie 10% D 2 O (v / v) auf die Probe für das Spektrometer Frequenzverriegelung verwendet werden. </li><li> Legen Sie die Probe in das Spektrometer und führen Sie die Grundoperationen (Verriegelung, Tuning, Shim). Darüber hinaus bestimmen die optimale Pulslängen und allgemeine Erfassungsparameter. </li><li> Nehmen Sie 1D- und 2D - 1 H- 15 N und 1 H- 13 C - Referenzspektren. </li><li> Prozessreferenzspektren und sicherzustellen, daß die Signale zum Abbilden der Modifizierungsreaktionen verwendet werden, werden gut aufgelöst und haben gute Intensitäten. </li><li> Recover Probe und gibt it zu einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Aufbau der enzymatischen Reaktion, NMR - Kontrolle und quantitative Analyse <ol><li> Kopieren und vereinbaren Sie eine Reihe von verschachtelten 2D - 1 H- 15 N und 1 H- 13 C - Spektren. Ziel für eine Gesamterfassungszeit von mehreren Stunden und entsprechend anpassen, in einem neuen Durchlauf auf der Basis der enzymatischen Raten aus der ersten Reaktion erhalten. </li><li> In der Probe , die notwendigen Cofaktoren für die jeweilige Art der Modifizierungsreaktion (1 mM ATP / 2 mM MgCl 2 für die Phosphorylierung, 1 mM Acetyl-CoA für die Acetylierung, 1 mM SAM für Methylierung, etc.). </li><li> Fügen Sie das Enzym von Interesse, mischen durch Pipettieren, übertragen Sie die Probe wieder in das NMR-Röhrchen und anschließend in das Spektrometer (führen diese Operationen schnell). HINWEIS: Wenn es keine Daten über die zu erwartende Enzymaktivität ist, passen die Substrat-zu-Enzym - Molverhältnis 10: 1. Führen Sie eine erste Probelauf und entsprechend anpassen, fürder eigentliche Lauf. </li><li> Führen Sie eine schnelle automatische Shim und den Rest von Parametern aus den Referenzspektren verwendet werden. </li><li> Starten Sie die Serie der verschachtelten 2D - 1 H- 15 N und 1 H- 13 C - Spektren. </li><li> Folgen Sie dem Verlauf der Reaktion in Echtzeit und der Erwerb stoppen, wenn die Beendigung der Reaktion oder eine gewünschte Niveau erreicht. </li><li> Verfahren Spektren wie zuvor mit genau denselben Parametern. </li><li> Wiederholen Sie den gesamten Lauf eine andere Erfassungsreihenfolge für die beiden Arten von Korrelationsspektren. Wenn im ersten Versuch ein 1 H- 15 N Korrelation erste in der Reihe war, beginnen jetzt mit einem 1 H- 13 C - Korrelation. Durch diese und für beide Spektren gleiche Erfassungszeit ist, ist es möglich, PTM Reaktionen auf beiden unterschiedlich isotopenmarkierten Histonen auf der gleichen Zeitskala zu planen und zu vergleichen. Darüber hinaus ist es möglich, Mittelwerte und Plot Fehlerbalken zu berechnen. HINWEIS: Ein thorough Beschreibung der Methoden für die NMR - Signalanalyse und anschließende Quantifizierung der enzymatischen Reaktionen können hier 19 zu finden. </li><li> Wählen NMR Signale von jedem der Zeitverlauf-NMR-Spektrum, die das Fortschreiten der Reaktion berichten und berechnen ihre relativen Signalintensitäten eine Visualisierung und Analyse-Software für die NMR-Spektren verwendet wird. Tun Sie dies für Signale, die die unmodifizierte sowie den modifizierten Zustand melden. Extrahieren Sie Modifikationsstufen. </li><li> Zeichnen Sie die berechneten Werte der Modifikationsstufen gegen die Reaktionszeit. </li></ol></li></ol>

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The author has nothing to disclose.

Für Nukleosomen Rekonstitution verwendet das aktuelle Protokoll , um eine 165 bp lange DNA - Vorlage , um die 601-Widom Nukleosomen Positioniersequenz 20, aber eine ähnliche Leistung wird erwartet , dass mit verschiedenen Längen von DNA - Matrizen enthalten. Das Protokoll wurde entworfen und verwendet unter Verwendung asymmetrischer Arten von Histon H3. Mit dem gleichen Prinzip kann das Verfahren auch für die anderen Core-Histone angewendet werden und zusätzlich verwendet werden können Komp...

Eukaryotische DNA ist eng in die Zellkerne in Chromatin verpackt. Der grundlegende Baustein des Chromatins ist die Nukleosomen Kernteilchen, die ~ 147 bp DNA um einen oktameren Komplex, bestehend aus zwei Kopien jeder der vier Core-Histone (H3, H4, H2A, H2B) gewickelt enthält. Histon-Proteine ​​beherbergen eine Vielzahl von Post-translationale Modifikationen (PTM). Diese kovalente Substitutionen induzieren Veränderungen in der Chromatinstruktur, sowohl direkt durch die physikalische Chemie des Systems zu beeinflussen und indirekt durch die Einstellung von Chromatin-Remodeling - Aktivitäten 1, 2, 3. Durch diese Mittel steuern Histon PTMs Chromatin Zugänglichkeit und damit regeln alle DNA-basierten zellulären Funktionen 4. PTM werden von Histon-modifizierenden Enzymsysteme vor allem auf die unstrukturierte N-terminalen Segmente (Schwänze) von Nukleosomen-Kern integriert histo installiertang. Aufgrund der vielen Modifikationsstellen auf der relativ kurzen Sequenz von Histon - tails beeinflussen PTMs einander durch Induzieren oder nachfolgenden Modifikationsreaktionen zu blockieren, eine Wirkung als Modifikationsübersprechens 5 bekannt. Aufgrund der insgesamt symmetrischen Architektur der Nukleosomen, Modifikationsreaktionen und Übersprechmechanismen wurden gedacht, um in ähnlicher Weise auf die zwei Kopien von jedem nukleosomalen Histon (Schwester Histone) auftreten. Dieses Konzept wurde vor kurzem in Frage gestellt und später widerlegt. Insbesondere zeigten in vitro enzymatische Tests auf freien Histon H3 Schwanz Peptide und auf Nukleosomen , dass eine Reihe von H3 - Kinasen 6 - Phosphorylierung in asymmetrischer Weise eingeführt. Zusätzlich Affinitätsreinigung basierten LC-MS / MS - Analyse zeigte das Vorhandensein von unsymmetrisch H3-methylierten Nukleosomen in verschiedene Arten von eukaryotischen Zellen 7. Somit bilden asymmetrisch modifizierten Nukleosomen neuartige Arten undWerkzeuge nötig sind, um die Mechanismen aufzudecken, die ihre Bildung steuern und die Übersprecheffekte zu analysieren, dass diese Asymmetrie ausüben könnten. Üblicherweise wurden Western Blot (WB) und Massenspektrometrie (MS) -Analyse verwendet Histon PTMs zu detektieren. Trotz seiner einfachen Anwendung, leidet WB aus Spezifität / Kreuzreaktivität Probleme. Hinzu kommt, dass ist es nicht in der Lage 8 simultane Multi-PTM Analyse und direkte Quantifizierung der Modifikationsreaktionen durchzuführen. Auf der anderen Seite beschäftigt MS - Analyse ausgefeilte Instrumentierung , die Ausbildung auf hohem Niveau erfordert, bietet aber eine hohe Spezifität sowie gleichzeitige Kartierung und Quantifizierung von mehreren PTM 9. &#160; Jedoch sind beide Verfahren disruptive und die nukleosomalen Komplexe vor der Analyse dissoziiert, zu einer Mischung von Histonen und / oder Histon abgeleiteten Peptiden führt. Diese Manipulation entfernt die Möglichkeit, unabhängig zu unterscheidenModifikationsreaktionen, die auf jeder der beiden Schwester Histone auftreten und die Kopie spezifischen Modifikation Status der nukleosomalen Histone zu melden. Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie als alternative Methode entwickelt PTM Reaktionen zuzuordnen. NMR ist eine unterbrechungsfreie und ermöglicht so die Kontrolle der PTM Ereignisse in einer Echtzeit - Weise in rekonstituierten Mischungen und sogar in intakten Zellen 10, 11. Die Entwicklung von Routinen zur schnellen Datenerfassung sowie für hochauflösende Abbildung basierend auf 2D heteronuklearen Korrelationsverfahren von isotopenmarkierten (15 N und / oder 13 C) Proben 12 erlaubt die gleichzeitige Abbildung von verschiedenen Arten von PTMs, beispiels als Serin / Threonin / Tyrosin - Phosphorylierung, Acetylierung Lysin / Methylierung und Arginin Methylierungs 13. In Abhängigkeit von der PTM untersuchten 15 N- oder 13 C-Kennzeichnung protocols kann das Protein funktionelle Gruppe zu markieren, die verwendet werden als eine Modifikation Reporter dient. Folglich kann PTM-Mapping durch Befolgen der charakteristischen chemischen Verschiebung Verschiebung der entsprechenden funktionellen Gruppe durchgeführt werden &quot;Erfassen&quot;, um die Änderung in der chemischen Umgebung. In den meisten Fällen sowohl NH und CH chemischen Gruppen können die Entwicklung des PTM von Interesse zu berichten, verwendet werden. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Erzeugung von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Es kombiniert die Flexibilität der NMR - Spektroskopie PTM zur Karte sowohl 1 H- 15 N und 1 H- 13 C - Korrelationsspektren mit der Nutzung von verschiedenen Protein - Affinität - Tags für die Reinigung der rekonstituierten ausgewählten Histon - Komplexen. Bemerkenswert ist, verwendet das Protokoll, das zwei verschiedene Pools eines bestimmten Histon für Nukleosomen Rekonstitution. Diese Pools sind unterschiedlich isotopenmarkierten (eins mit <sup&gt; 15 N, die andere mit 13 C), und sie sind mit einem Polyhistidin fusionierte und einem Streptavidin Affinitätstag, respectively. Ein Tandem - Affinitätsreinigung Schema mit Ni-NTA und Streptavidin-basierte Chromatographie zunächst von Voigt et al. 7 verwendet wird , aus symmetrischen Pendants (1A) asymmetrische Spezies zu reinigen. Asymmetrische Histon Octamere werden anschließend zu rekonstituieren äquivalente nukleosomalen Komplexe (1B), unter Verwendung des Standardsalzdialyseverfahren 14 verwendet. Zusätzlich wird durch das gleiche Verfahren und durch eine der Histon-pools vormodifizierten aufweist, kann eine PTM asymmetrisch auf die resultierende Nukleosomen eingearbeitet werden. Die Umsetzung dieser Substrate mit Histon-modifizierende Enzyme und anschließender NMR-mapping Modifikations Ereignisse ermöglichen die Charakterisierung von Übersprechmechanismen sowohl in-cis (vormodifiziert Histon - copy) und in-trans (unmodified Histon - Kopie) (Abbildung 1C).

<table><tbody><tr><td>Guanidinium HCl</td><td>Applichem</td><td>A14199</td><td>Use high quality Gu-HCl</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>4855.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Applichem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR chemicals</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Applichem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Applichem</td><td>A3902</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Applichem</td><td>A1073</td><td></td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin</td><td>Sigma</td><td>D1411</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>1034557</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin Superflow</td><td>IBA</td><td>2-1207-001</td><td></td></tr><tr><td>His-probe antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8036</td><td></td></tr><tr><td>Strep-tactin conjugated HRP</td><td>IBA</td><td>2-1502-001</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-35</td><td></td></tr><tr><td>6 - 8 kDa dialysis membrane</td><td>Spectrumlabs</td><td>spectra/por 1, 132650</td><td></td></tr><tr><td>50 kDa dialysis membrane</td><td>Spectrumlabs</td><td>spectra/por 7, 132129</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa centrigugal filter unit</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa centrigugal filter unit</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Solution-state NMR spectrometer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffer name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Component&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unfolding Buffer</td><td>7 M Guanidinium HCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>20 mM Tris, pH 7.5</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>10 mM DTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refolding Buffer</td><td>10 mM Tris, pH 7.5</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 M NaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 mM DTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay Buffer</td><td>25 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 6.8</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>25 mM NaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 mM DTT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones

Asymmetrisch modifizierte Nukleosomen enthalten die beiden Kopien eines Histon (Schwester Histone) dekoriert mit unterschiedlichen Mengen von Post-translationale Modifikationen (PTM). Sie sind neu Spezies mit unbekannten Mitteln Niederlassungs- und funktionelle Auswirkungen identifiziert. Aktuelle analytische Methoden sind unzureichend, um die Kopie spezifische Auftreten von PTM auf die nukleosomalen Schwester Histone zu erkennen. Dieses Protokoll stellt ein biochemisches Verfahren zur in vitro Rekonstitution von Nukleosomen differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Der erzeugte Komplex kann auch asymmetrisch modifiziert werden, nachdem ein vormodifizierter Histon-Pool auch während der Histon Subkomplexe Neufaltung. Diese asymmetrischen Nukleosom Zubereitungen können leicht umgesetzt werden, mit Histon-modifizierende Enzyme Modifikation Übersprechens Mechanismen durch die asymmetrisch vorge eingebaut PTM unter Verwendung der kernmagnetischen Resonanz (NMR) -Spektroskopie auferlegt zu studieren. Insbesondere sind die Modifizierungsreaktionen inEchtzeit kann durch die Durchführung verschiedener Arten von NMR-Korrelationsexperimente, zugeschnitten für das jeweilige Isotop Typ unabhängig von den beiden Schwester Histone abgebildet werden. Diese Methode liefert die Mittel Übersprechmechanismen zu untersuchen, die zur Bildung und Ausbreitung von asymmetrischen PTM Muster auf nukleosomalen Komplexe beitragen.

Richtig rückgefaltetem oktamere Arten werden nach einem Durchlauf der Rekonstitution Mischung durch eine Gelfiltrationssäule (Abbildung 2) isoliert. Die gebrauchsfertige oktameren Pool die drei verschiedenen Arten von Octamere enthält, wird auf dem Tandem-Affinitätsreinigung Schema unterworfen. Proben werden aus allen Schritten und durch SDS-PAGE und anschließend WB gesammelt. Überprüfung der korrekten Ausführung des Protokolls , das bei der Isolierung von asymme...

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Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.0K Aufrufe.  Leibniz Institute of Molecular Pharmacology (FMP-Berlin).  Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie. 

Serie: Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Forschung

Biochemie

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) and its cognate tRNA (tRNAPyl) to assemble reconstituted mononucleosomes with site specific acetylated histones. MmAcKRS1 and tRNAPyl deliver AcK at an amber mutation site in the mRNA of choice during translation in Escherichia coli. This technique has been used extensively to incorporate AcK at H3 lysine sites. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) can also be easily evolved to incorporate other noncanonical amino acids (ncAAs) for site specific protein modification or functionalization. Here we detail a method to incorporate AcK using the MmAcKRS1 system into histone H3 and integrate acetylated H3 proteins into reconstituted mononucleosomes. Acetylated reconstituted mononucleosomes can be used in biochemical and binding assays, structure determination, and more. Obtaining modified mononucleosomes is crucial for designing experiments related to discovering new interactions and understanding epigenetics.

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Here we present a method to express acetylated histone proteins using genetic code expansion and assemble reconstituted nucleosomes in vitro.

Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of chromatin, show most DNA repair enzymes remove DNA damage at reduced rates as compared to free DNA. The molecular details on how base excision repair (BER) enzymes recognize and remove DNA damage in nucleosomes have not been elucidated. However, biochemical BER data of nucleosomal substrates suggest the nucleosome presents different structural barriers dependent on the location of the DNA lesion and the enzyme. This indicates the mechanisms employed by these enzymes to remove DNA damage in free DNA may be different than those employed in nucleosomes. Given that the majority of genomic DNA is assembled into nucleosomes, structural information of these complexes is needed. To date, the scientific community lacks detailed protocols to perform technically feasible structural studies of these complexes. Here, we provide two methods to prepare a complex of two genetically fused BER enzymes (Polymerase &#946; and AP Endonuclease1) bound to a single-nucleotide gap near the entry-exit of the nucleosome for cryo-electron microscopy (cryo-EM) structural determination. Both methods of sample preparation are compatible for vitrifying quality grids via plunge freezing. This protocol can be used as a starting point to prepare other nucleosomal complexes with different BER factors, pioneer transcription factors, and chromatin-modifying enzymes.

This protocol outlines in detail the preparation of nucleosomal complexes using two methods of sample preparation for freezing TEM grids.

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

<meta charset="utf8"></head><body>In situ Nukleosomenrekonstitution für Einzelmolekülstudien

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Effiziente Nukleosomenrekonstitution für Einzelmolekültechniken

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

<meta charset="utf8"></head><body>2D-Geltrennung für die Anreicherung von Histon-Isoformen und die PTM-Charakterisierung

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which control nucleosome dynamics and determine cell fate. The nucleosome, which is the functional unit of chromatin, comprises DNA, four pairs of histones (H3, H4, H2A, and H2B) making up the globular core, and the linker histone H1, which stabilizes the chromatin structure. The amino (N)-terminal tails of the histones protrude from the globular core domains and undergo distinct PTMs that influence the chromatin landscape. Some evidence suggests that histone PTM homeostasis is crucial for preserving all physiological activities. The deregulation of histone PTMs is the primary cause of abnormal cellular proliferation, invasion, and metastasis. Therefore, developing methods for characterizing histone PTMs is crucial. Here, we describe an effective technique for isolating and analyzing histone isoforms. The method, based on the combination of two orthogonal separations, allows the enrichment of histone isoforms and the following mass spectrometry identification. The technique, originally described by Shechter et al., combines acid-urea polyacrylamide gels (TAU-GEL), which can separate basic histone proteins based on size and charge, and Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE), which can separate proteins by molecular weight. The result is a two-dimensional map of histone isoforms, suitable for in-gel digestion followed by mass spectrometry identification and western blot analysis. The result is a two-dimensional map of histone isoforms, suitable for both in-gel digestion followed by mass spectrometry identification and western blot analysis. This proteomic approach is a robust method that allows the enrichment of a single histone isoform and the characterization of new histone PTMs.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Epigenetische Modifikationen und metabolische Neuverdrahtung als Ziele für die Krebstherapie

This method describes a simple and fast strategy for histone proteoform characterization and investigation.

Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Zusammenfassung

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Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese