Name: scaling of engineered vascular grafts using 3d printed guides and the ring stacking method
Uploaded: 2017-03-27T11:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
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Die Autoren möchten sich unsere Kolleginnen und Lam Labor Kollegen mit einigen der Histologie und Zellkultur Ammar Chishti und Bijal Patel für die freundliche Unterstützung danken. Die Finanzierung wurde von der Wayne State University Nano Fellowship (CBP) zur Verfügung gestellt, Start-up-Fonds und Cardiovascular Research Institute Seed Grant (MTL).

1. Zellkultur Vorbereitung <ol><li> Nutzen Sie die menschliche Aorta-Glattmuskelzellen im Handel erworben. </li><li> Pflegen Zellen in Glattmuskelzellwachstumsmedium, bestehend aus 88,6% 231 Medien, jeweils 0,1% von rekombinantem Humaninsulin (rh-Insulin), rekombinanten humanen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (rH-FGF), rekombinanten humanen epidermalen Wachstumsfaktor (rH-FGF), und Ascorbinsäure; und jeweils 5% fötales Rinderserum (FBS) und L-Glutamin; und 1% Antibiotikum / Antimykotikum. HINWEIS: Jeder Wachstumsfaktor, FBS und L-Glutamin als Gefäß Medien Wachstum Kit erworben. </li><li> Ändern Medien alle 48 Stunden, bis die Zellen sind etwa 90% konfluent und bereit für die Gewebe Aussaat. </li><li> Shop-Zellen in einem Inkubator in zwischen Medienwechsel für die Expansion. </li></ol> 2. Herstellung von 3D-Druckeinsätze und kundenspezifische Silikon geformten Platten <ol><li> Verwenden Sie einen kommerziellen 3D - Drucker (zB Replicator Mini) für 3D - Druck der Platteneinsätze. <ol><li> Verwenden Sie op3D-Design-Software en Quelle wie Blender die 3D-Modelle der bedruckten Außenschalen und Beiträge zu erstellen. </li><li> Exportieren Sie die Treiberdatei des Modells über eine .stl Format für die Portabilität für die Software des 3D-Druckers ermöglicht. </li><li> Produzieren gedruckt Pfosten und Außenschalen unter Verwendung von Poly (milchsäure) Filament (PLA) in den Drucker geladen 3D. </li><li> Nach dem Drucken, führen eine 30-minütige in einer 70% -100% Ethanollösung einweichen jeder Einsatz zu sterilisieren. </li></ol></li><li> Vorbereiten eines Härtungsmittels 01.10 Polymermischung aus Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Siliconpolymer zu stützen und um die Mischung zu entgasen bei Raumtemperatur für 10 min ermöglichen. <ol><li> Definieren Petrischale Größen verwendet als kleine (35 mm), Zwischenprodukt (60 mm) und große (100 mm). </li><li> In 2 ml, 4 ml und 6 ml nicht gehärteten Silikon auf jeder kleinen, mittleren und großen Platte, bzw., und erstellen Sie eine dünne Schicht über den gesamten Boden der Petrischale. </li><li> Erstellen Sie Beiträge für die kleine Platte von PDMS in ein Eingießen100 mm Platte auf eine Höhe von 7 mm und ermöglichen für etwa 2-3 Stunden bei 60 ° C auf einer heißen Platte zu härten. Dann mit einem 5 mm Biopsiestanze zylindrischen Pfosten auszuzustanzen. Verwenden, um eine kleine Menge an ungehärtetem PDMS zu sichern jeden PDMS Zylinder und zu der Mitte jeden Plättchens. </li><li> Für die Zwischen- und großen Platten vor an der Unterseite der Platte Härtung der PDMS vervollständigen, Ort, um die 3D-Druckstifte 10 mm und 20 mm im Durchmesser zentrisch in jeder Zwischen und großen Platten, respectively. Für die großen Platten, legen zusätzlich eine 3D-gedruckten Außenschale etwa 66,7 mm im Durchmesser Äquidistanz von der Post. <ol><li> Erlauben Jedes Gericht im Freien auf einer heißen Platte zu härten bei 60 ° C für etwa 2-3 Stunden, für 18 Stunden zur Entgasung des Polymers. Fix gedruckten Komponenten auf die Platte in dem richtigen Bereich und die Orientierung , wie in Abbildung 1 zu sehen ist . </li></ol></li><li> Eine Lösung aus 70% Ethanol mit 30% destilliertem Wasser 30 Minuten lang auf die Innenseite aller plates für die Sterilisation und dann decken jede Platte. </li><li> aspirieren vorsichtig das Ethanol aus jeder Platte und an der Luft trocknen lassen. </li><li> Ordnen Sie jede Platte in einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) neben dem Deckel, dem Gesicht nach oben. Expose Platten und Deckel mit UV-Licht unter dem BSC 30 Minuten Sterilisation zu vervollständigen. Sterile Technik wird bei jedem Schritt nach UV-Bestrahlung durchgeführt. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Fibrinhydrogels, mit glatten Muskelzellen und Wartung von Platten Seeding <ol><li> Mischen Sie eine Lösung von Fibrin-Gel mit Wachstumsmedium + 0,01% TGF-β1 in den Mengen von 0,5 ml, 1,1 ml und 1,81 ml für kleine, mittlere und große Plattengrößen sind. <ol><li> Werden 40 &amp; mgr; l, 88,4 &amp; mgr; l und 145 &amp; mgr; l Thrombin, aus einem Vorrat von 100 U / ml, zu den Medien jedes kleinen, mittleren und großen Platte, respectively. Vorsichtig schwenken jede Platte mit der Hand, dass Thrombin, um sicherzustellen, gleichmäßig in den Medien gemischt wird. </li><li> Als Nächstes fügen 1601 L, 354 &amp; mgr; l und 580 &amp; mgr; l Fibrinogen, aus einem Vorrat von 20 mg / ml, tropfenweise kreisförmig auf die Thrombin-Medien-Gemisch zu jedem kleinen, mittleren und großen Platte auf. Vorsichtig schwenken Mischen von Hand und Verteilung des Hydrogels in einer gleichmäßigen Schicht zu gewährleisten. </li><li> Erlauben Hydrogel für 10-15 Minuten bei Raumtemperatur aushärten. </li></ol></li><li> Trypsinize glatten Muskelzellen in 150 mm-Zellkulturplatten und zentrifugieren erweitert nach Standardprotokollen. Das resultierende Pellet sollte in 3 ml Differenzierungsmedium resuspendiert werden, bestehend aus 98% - 231 Medien, 1% FBS und 1% Antibiotikum / Antimykotikum. <ol><li> Energisch Zellen mischen durch Titration nach oben und unten mit einer 2-ml-Pipette alle Zellklumpen aufzubrechen. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und schaffen eine Zellsuspension von 2 x 10 6 Zellen / ml, 1,0 x 10 7 Zellen / ml und 1,4 x 10 7 Zellen / ml für kleine, mittlere und große Platten, respectively. </li><li> 1 ml jeder Zellsuspension intoa 50 ml konischen entsprechend markierten kleinen, mittleren und großen. Legen Sie zusätzlich 50 ml konischen auf diese Weise für jeden weiteren Gewebering gewünscht werden. </li><li> In jeder konischen Differenzierung Medien bis zur endgültigen Aussaat Volumen von 2 ml zu erhalten, 4 ml und 5 ml für jeden kleinen, mittleren und großen Gefäße sind. Dann Pipettieren vorsichtig die Zelllösung tropfenweise auf der Oberseite des hergestellten Hydrogels in jeder entsprechenden Platte. </li><li> Ort Platten in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Ändern Differenzierung Medien alle 48-72 Stunden für jede Platte. Bei der größeren Platte, Medien zunächst nach 24 Stunden ändern, dann alle 48 bis 24 Stunden für die große Zelle Aussaatdichte zu kompensieren ändern. <ol><li> Nach 2-4 Tagen wie die Ringe vollständig in Richtung der Post unter Vertrag haben wird, mit 10 &amp; mgr; l, 20 &amp; mgr; l und 35 &amp; mgr; l von TGF-β1 zu jedem kleinen, mittleren und großen Ring sind. Nach Exposition gegenüber TGF-β; 1 für mindestens 24 Stunden, Ringe sind bereit behandelt werden. </li></ol></li></ol> 4. Montage von Vascular Konstruieren und Wartung <ol><li> Vor der Herstellung des endgültigen Gefäßkonstrukt ist ein spezialisierter Container erstellt den fertigen Behälter zu halten. <ol><li> Für den kleinen Schiff, ein großer Teller für Ringstapel erstellen, indem ein 2-Zoll-Abschnitt von der Spitze eines 50-ml-Polycarbonat konische Röhrchen schneiden und dann PDMS die Schnittkante in eine 35-mm-Platte kleben. Verwenden Sie den konischen Deckel als Plattendeckel. </li><li> Für die Zwischen- und großen Behälter hoch Ringplatten stapeln, schneiden Sie ein 1,75-Zoll Durchmesser Polycarbonatrohr in 2,5-Zoll-Abschnitte in Längsrichtung als die hohen Plattenwände zu dienen. Für die hohen Plattenboden, geschnitten, um eine 0,125 Zoll dicke Polycarbonatfolie in 2-Zoll-Durchmesser-Kreis Stücke. Mit Acryl-Klebe, binden das Polycarbonat Rohrabschnitt an dem kreisförmigen Schnittstück. Verwenden Sie den Deckel aus einer 60 mm Petrischale als Deckel für die hohe Platte. </li><li> 3D-pRINT Beiträge 5, 10 und 20 mm im Durchmesser und 50 mm in der Länge. </li><li> 10 ml ungehärtetem Silikon zu jedem Behälter. Vor der vollständigen Aushärtung des PDMS, legen Sie zentral jeden in Schritt geschaffene 4.1.3 in jedem kleinen, mittleren und großen Behälter. </li><li> Lassen Sie auf einer heißen Platte Set für 2-3 Stunden auf 60 ° C zu heilen. </li><li> Sterilisieren mit einer Lösung von 70% Ethanol mit 30% destilliertem Wasser für 30 Minuten. </li><li> aspirieren vorsichtig das Ethanol aus jedem Behälter und lassen Sie in der BSC an der Luft trocknen. Als nächstes wird mit jeder Platte neben dem Deckel, dem Gesicht nach oben platziert, um die Behälter in der Motorhaube anordnen. Expose Behälter mit UV-Licht unter der BSC für weitere 30 Minuten für die weitere Sterilisation. Verwenden Sie sterile Technik bei jedem Schritt nach der UV-Exposition. </li></ol></li><li> Mit sehr feinen Pinzette vorsichtig entfernen sich eng gerollte glatten Muskulatur Hydrogel Ring von seinem Posten und Transfer zu seinem entsprechenden größeren Behälter mit den hohen Beiträgen. <ol><li> Verwenden Sie ein Paarin jeder Hand Zange und heben Sie eine Seite des Rings von der Post, und dann die andere. Achten Sie darauf, zu schützen und das Lumen aufrechtzuerhalten. </li><li> Führen Sie die Übertragung mit diesem zweihändige Verfahren wird zunächst eine Seite schieben und dann auf der anderen Seite des Rings auf den hohen Beitrag. Durch sanfte, schrittweise Bewegungen, und am Umfang arbeiten, drücken Sie langsam den Ring nach unten auf den hohen Beitrag. Anschließend Ringe stapeln Gewebe, bis die gewünschte Schiffslänge erhalten wurde, wobei jeder Ring Zusatz von ca. 1-2 mm Länge bis zum fertigen Konstrukt. </li></ol></li><li> Mit dem Ring-Stack auf den hohen 3D-gedruckten Pfosten positioniert ist, drehen Sie die Platte, so dass die Post parallel mit der Arbeitsfläche ist. <ol><li> Mit einer Mikropipette, dann werden 40, 80 und 160 &amp; mgr; l Thrombin in einer Konzentration von 100 U / mL sanft auf die Außenfläche jeder kleinen, mittleren und großen Gefäße, respectively. Während die Thrombin Zugabe langsam drehen die Platte Abdeckung aller Oberflächen des Konstrukts, um sicherzustellen, sogar.Dadurch wird die Basis für die Fibrinkleber sein, den Ringstapel Konstrukt in den ersten Tagen nach dem Bau verwendet zu sichern. </li><li> Anschließend fügen in einer Konzentration von 20 mg / mL 40, 80 und 160 &amp; mgr; l Fibrinogen in jedem kleinen, mittleren und großen Konstrukt jeweils mit einer Mikropipette, während das Konstrukt schnell dreht. Das Thrombin und Fibrinogen schnell in ein festes Gel gesetzt einmal gemischt. Aufgrund der Zeit kurzen Aushärtezeit, wenden Sie das Fibrinogen so schnell und gleichmäßig wie möglich. </li></ol></li><li> 20 ml Differenzierungsmedium zu jedem Behälter, die das Konstrukt halten. Platz Gefäße in einen 37 ° C Inkubator ° bis benötigt. Ändern Medien alle 3-5 Tage. </li></ol>

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	<li>Luciani, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operative+risk+and+outcome+of+surgery+in+adults+with+congenital+valve+disease.">Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease.</a> ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).</li><li>Lawson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+acellular+vessels+for+dialysis+access+in+patients+with+end-stage+renal+disease:+two+phase+2+single-arm+trials.">Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials.</a> Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).</li><li>Wystrychowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+use+of+an+allogeneic+tissue-engineered+vascular+graft+for+hemodialysis+access.">First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access.</a> J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).</li><li>Konig, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery.">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+tissue-engineered+small-diameter+vascular+grafts+in+fibrin+scaffolds+in+30+days.">Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days.</a> Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).</li><li>Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+vascular+graft+engineered+using+human+embryonic+stem+cell-derived+mesenchymal+cells.">Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells.</a> Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).</li><li>Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+human+tissue-engineered+blood+vessel.">Allogeneic human tissue-engineered blood vessel.</a> J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).</li><li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).</li><li>Dahl, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+available+tissue-engineered+vascular+grafts.">Readily available tissue-engineered vascular grafts.</a> Sci Transl Med. 2 (68), (2011).</li><li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+completely+biological+engineered+grafts+following+decellularization+into+the+sheep+femoral+artery.">Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery.</a> Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).</li><li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantable+arterial+grafts+from+human+fibroblasts+and+fibrin+using+a+multi-graft+pulsed+flow-stretch+bioreactor+with+noninvasive+strength+monitoring.">Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring.</a> Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).</li><li>Meier, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+outgrowth+endothelial+cells+alter+remodeling+of+completely+biological+engineered+grafts+implanted+into+the+sheep+femoral+artery.">Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery.</a> J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).</li><li>Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+engineered+blood+vessels+using+3D+printed+inserts.">Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts.</a> Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).</li><li>Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Pick,+Place,and+Perfuse:+A+New+Instrument+for+Three-Dimensional+Tissue+Engineering.">Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Fearon, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+coronary+arterial+dimensions+early+after+cardiac+transplantation.">Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation.</a> Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).</li><li>Erbel, R., Eggebrecht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+dimensions+and+the+risk+of+dissection.">Aortic dimensions and the risk of dissection.</a> Heart. 92 (1), 137-142 (2006).</li><li>Ha, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+1+produced+by+vascular+smooth+muscle+cells+predicts+fibrosis+in+the+gastrocnemius+of+patients+with+peripheral+artery+disease.">Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease.</a> J Transl Med. 14, 39 (2016).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin,+a+differentiation+marker+of+smooth+muscle+cells,+is+present+in+microfilamentous+bundles+of+pericytes.">Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes.</a> J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).</li><li>von der Ecken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Ring Stapelverfahren stellt mehrere Vorteile gegenüber aktuellen Gefäßgewebe manipulierten Konstrukts Techniken. Die RSM können menschliche Gefäße jeder Größe durch einfaches Anpassen der Post und Außenschale Abmessungen zu schaffen angepasst werden. Unsere Methode ermöglicht die Entwicklung von polymerfreien konstruierte Schiffe, die ausschließlich aus menschlichen Zellen zusammengesetzt und schnell Trägermaterial in der körpereigenen natürlichen Wundheilungsprozess gefunden zu verschlechtern. Polymer-Transplantate sind dafür bekannt, eine Restenose in der Klinik zu verursachen und könnte problematisch werden, wenn in engineered Transplantate enthalten. Zellaussaat Nummer muss für jede unterschiedliche Größe Gewebering modifiziert werden. Eine graphische Darstellung der Zellzahl in den Bereich seeding Oberfläche ist in Abbildung 5 , von dem die Anzahl seeding gezeigt , angenähert und / oder extrapoliert werden. Es sollte beachtet werden, dass der Zelltyp hier sind menschliche Aorta-Glattmuskelzellen verwendet. Um die RSM an verschiedene Zelltypen anpassen, Zellgröße und Proliferationsrate werden müssen, um inRücksichtnahme und optimale Aussaatdichte bestimmt. Zum Beispiel haben wir auch menschliche Fibroblasten Ringe mit dem RSM erzeugt und haben gefunden, daß mindestens die Anzahl der Zellen 2x benötigt wird im Vergleich zu SMCs. Jede gewünschte Länge des Behälters kann durch den Zusatz von Ringen aufgebaut werden. Ring Stapel wurden für bis zu 2 Monate kultiviert und blieb stabil. Zwischen- und großer Ringe sind sowohl auf der geeigneten 1,500 &amp; mgr; m Wandstärke gehalten, obwohl sie in einer 60 mm und 100 mm Platte jeweils aufgebaut sind, jeweils durch Platzierung einer Außenschale in der 100-mm-Platte. Dies zeigt den Nutzen der äußeren Hülle für die Steuerung und die entsprechende Wanddicke für ein bestimmtes Schiff zu erhalten. In Schritt 3.3.1 wird TGF-β1 hinzugefügt , weil es bekannt ist , um die Produktion von Kollagen und 19 hat die beobachtete Wirkung Anziehen der Ringe stimulieren. Nachdem die Ringe vollständig gerollte, eine Dosis von TGF-β1 wird im letzten Schritt hinzugefügt, und die Ringe sind bereit für eine spätere Verwendung 1 Tag.<html> TGF-β1 macht die Produktion von Kollagen in den Ringen zu verbessern, wie es in den Trichrom Bilder (Abbildung 2) zu sehen. Zellen in den kleinen Ringe sind rund und kompakt, während in den 2 größere Größen Zellen entlang der Außenkanten mit der Gewebekante einen Ausrichtungsgrad anzeigen und zusammen mit anderen ausgerichteten Zellen. Letzteres kann eine spätere Stufe der Zell Reife zeigen, von höheren Zellinhalt in den größeren Ringen entwickelt und somit ein größerer Grad an interzellulärer Signalisierungs Reife zu fördern. Fibringelstruktur Einstreuung in größeren Ringen kann darauf hindeuten, dass größere Zellschichten leicht zu falten neigen, wie sie rollen. Die histologischen Bilder dieses Phänomen zeigen, wurden 1 Tag nach der vollständigen Ringwalze genommen Up- so ist es verständlich, dass das Fibrin-Gel, das nimmt 2 Wochen in Kultur abzubauen, noch vorhanden sein würde. Züchten der Ringe für mindestens 2 Wochen sollte das Fibrin-Gel, Zurücklassung einer vollständig zellulären Konstrukt verschlechtern. nt &quot;&gt; Alpha-Glattmuskelaktin (SMA) stellt die dünnen Fäden , die Kontraktion und Tropomyosin erleichtern , ist ein Kontraktions Protein. 20, 21 beide SMA und Tropomyosin in allen Größen Ringe vorhanden waren, mit dem stärksten, gleichmäßig verteilte Signal in dem Zwischen Ringe. zu einem höheren Grad der Zelldichte und Organisation, Stimulierung einer Erhöhung der kontraktilen oper Entwicklung zurückzuführen sein Dieses Phänomen kann. Elastizitätsmodul zeigt die Elastizität der Ringe und die zunehmende E von kleinen zu großen Ringen schlägt eine Erhöhung der Produktion von Kollagen und Elastin. Die Zugfestigkeit ist die höchste Festigkeit durch die Ringe ausgehalten, ohne zu brechen. Bruchfestigkeit ist der Punkt, der Gewebeversagen. Für den Ringen gleich UTS FS. Für die Gefäße ist UTS größer als FS, die die Bruchfestigkeit des Schiffes zeigt, dass von allen Ringen der Kombination von mechanischen Beitrag zugeschriebenim Behälter, und die Fehlerstelle ist aufgrund der schwächste Ring. Die Stärke unserer technisierten Schiffe lagen im Bereich kPa, während nativen menschlichen Gefäße haben Stärken im Bereich MPa. Um unsere Schiffe in Richtung der von nativem Gefäße zu stärken, untersuchen wir Techniken der extrazellulären Matrix-Produktion zu erhöhen, nämlich die von Kollagen und Elastin. Wachstumsfaktoren, die Kollagen und Elastin-Produktion zu fördern sind derzeit auf unsere Ringe angewendet werden, zu untersuchen, ob die Zugeigenschaften zu erhöhen. Neben den mechanischen Eigenschaften, funktionale Maßnahmen der Muskelkontraktion zu Schiffsleistung relevant. Muskelstimulation und Kontraktion durch Faktoren wie Acetylcholin und Epinephrin kann verwendet werden, Muskelkontraktionskraft zu testen. Solche Experimente werden für unsere zukünftigen Studien berücksichtigt. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass der Ring Stapelverfahren kann leicht skaliert werdeneine Reihe von technischen Gefäßgewebe Größen zu erreichen. Skalierung zu den größten menschlichen Gefäße, wie die 40 mm Lumendurchmesser Aorta, erfordern würde wahrscheinlich Entwicklung eines Vasa vasorum, die microvasculature natürlich vorhanden in großen große Schiffe, die unser Labor entwickelt derzeit. Darüber hinaus ist die endotheliale Zellschicht (dh der Intima) , die typischerweise Linien das Lumen der Medienschicht zur Schaffung der richtigen Hämodynamik in einem Behälter von Bedeutung ist. Unser Labor arbeitet derzeit bei der Erstellung der Intima in unserem SMC Ringstapel menschlichen vaskulären endothelialen Zellen. Mit diesen kombinierten Technologien würden engineered Schiffe haben eine größere Anwendbarkeit in die Klinik.

Bei der Behandlung der koronaren Herzkrankheit (KHK), eine eigene Blutgefäße des Patienten werden als Implantatmaterial für Bypass-Operation entnommen wurden. Doch oftmals, kranke Patienten haben keine tragfähige Schiffe selbst zu spenden, und in Fällen, in denen sie das tun, bewirkt, dass der Spenderstelle erheblichen zusätzlichen Schaden und hat ein ernsthaftes Risiko für eine Infektion. 1 Engineered Gefäßtransplantaten könnte diesen Bedarf zu füllen. Skalierbarkeit ist von größter Bedeutung für das Engineering Schiffe, um die breite Palette von Patienten Gefäßgröße Anforderungen zu erfüllen. vorliegenden Verfahren für technische Gefäße sind jedoch nicht leicht skalierbar und erfordern in der Regel remanufacture von komplexen Formen oder Polymergerüsten. Die meisten engineered Transplantate entweder ein Polymer Rohrgerüst verwenden, die mit vaskulären Fibroblasten, glatten Muskelzellen oder Endothelzellen ausgesät wird; oder eine Zelle Blechrollen um einen Dorn einer Geweberohr zu schaffen. Zwei engineered Gefäßtransplantate in klinischen Studien basieren auf einer Dezellularisierend Polymer-ECM-Plattform. 2, 3, 4 Polymer - Transplantate zur Verwendung in der Gefäßreparatur verfügbar sind bereits zu haben Probleme mit der Durchgängigkeit bekannt, die als ein wichtiges Thema mit langfristigen Anwendung eines Transplantats mit einer anhaltenden Polymer Präsenz entstehen könnten. Rohrformen verwendet wurden vollständig zelluläre Gefäße herzustellen, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , die Verfahren der zusätzlichen Entwurfs- und Werkzeugherstellung für individuelle Formen benötigen , um würde Gefäße in einer Vielzahl von Größen zu produzieren . Das beschriebene Verfahren umfasst hier eine neue Technik für leicht skalierbar engineered vaskulären SchaffungTransplantate anpassbare 3D-Druckplatten und traditionellen Kulturplatten verwendet wird. 14 Zellen werden in Platten mit Einsätzen aus einem zentralen Pfosten und Außenschale. Die post-Kontrollen Lumendurchmesser und ermöglicht die Zellschicht zur Selbstorganisation zu einem Ring von Gewebe. Die Außenschale steuert Dicke des Rings und somit Wandstärke des fertigen Behälters. Abgeschlossene Gewebe Ringe werden dann mit einem rohrförmigen, Gefäßtransplantat zu bilden, gestapelt. Der Vorteil dieser Methode, bezeichnet als die &quot;Ring Stapelverfahren&quot;, ist, dass jede adhärenten Zelltyp in den Plattenaufbau und Gewebe Ringe oder Rohre jeder Größe, die für die gewünschte Anwendung ausgesät werden können, können durch einfaches Modifizieren Führungseinsätzen erzeugt werden. Vergleichstechniken im Tissue Engineering schaffen Ringe des Gewebes bleiben schwierig zu Skala, 15, 16 erfordern remanufacture von Formen für jede gewünschte Größe. Zusätzlich machte Gefäßtransplantate mit dieser Methode produzieren werden könnend in 2-3 Wochen, mehrere Wochen schneller im Vergleich zu anderen engineered Gefäßen. 6 Für die Klinik, diesmal Diskrepanz kann einen wesentlichen Unterschied in der Behandlung eines Patienten verschlechtert machen.

<table><tbody><tr><td>Human Aortic Smooth Muscle Cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td>vascular smooth muscle cells</td></tr><tr><td>Medium 231</td><td>Gibco (Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>M-231-500</td><td>media specific to vascular smooth muscle cells</td></tr><tr><td>Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PSC-100-042</td><td>growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability</td></tr><tr><td>Replicator Mini 3D printer&amp;nbsp;</td><td>MakerBot&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)</td><td>MakerBot&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D printer filament</td></tr><tr><td>Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)</td><td>Ellworth Adhesives&amp;nbsp;</td><td>3097358-1004</td><td>polymer for gluing plate parts</td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Hyclone Labratories, Inc.</td><td>SH30256.01</td><td>fibrin gel component</td></tr><tr><td>Thrombin&amp;nbsp;</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>F3879-5G</td><td>fibrin gel component</td></tr><tr><td>Tranforming Growth Factor-Beta 1&amp;nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>growth factor for stimulating collagen production</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Polycarbonate tubing&amp;nbsp;</td><td>US Plastics&amp;nbsp;</td><td>PCTUB1.750X1.625</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Polycarbonate sheet&amp;nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>409497</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Adhesive polymer solvent&amp;nbsp;</td><td>SCIGRIP</td><td>10799</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Instron 5940</td><td>Instron</td><td>N/A</td><td>tensile testing machine</td></tr><tr><td>U-Stretch</td><td>Cell Scale</td><td>N/A</td><td>tensile testing machine</td></tr><tr><td>Smooth Muscle Actin&amp;nbsp;</td><td>MA5-11547</td><td>Thermo Fisher</td><td>antibody</td></tr><tr><td>Tropomyosin</td><td>MA5-11783</td><td>Thermo Fisher</td><td>antibody</td></tr></tbody></table>

scaling of engineered vascular grafts using 3d printed guides and the ring stacking method

Koronare Herzkrankheit bleibt eine Haupttodesursache, Millionen von Amerikanern beeinflussen. Mit dem Mangel an autologe Gefäßtransplantate zur Verfügung, bietet entwickeln Transplantate großes Potenzial für die Behandlung des Patienten. Allerdings sind dazu entworfen Gefßtransplantate im Allgemeinen nicht leicht skalierbar, erfordern Herstellung von kundenspezifischen Formen oder Polymerrohren, um verschiedene Größen anzupassen, eine zeitraubende und kostspielige Praxis bilden. Menschliche Arterien erstrecken sie im Lumendurchmesser von etwa 2,0 bis 38 mm und in der Wandstärke von etwa 0,5-2,5 mm. Wir haben ein Verfahren geschaffen, das „Ring-Stacking-Methode“ bezeichnet wird, in der variable Größe Ringe von Geweben der Zelltypen gewünscht wird, hier gezeigt mit vaskulären glatten Muskelzellen (SMCs), kann unter Verwendung von Führungen der Führungsstangen erzeugt wird Lumendurchmesser zu steuern, und Außenschalen Gefäßwanddicke zu diktieren. Diese Geweberinge werden dann mit einem rohrförmigen Konstrukt zu erzeugen gestapelt, um die natürliche Form eines Blutgefäßes nachahmt. Die Fahrzeuglänge kann be durch einfaches Stapeln der Anzahl der Ringe zugeschnitten erforderlich benötigt, um die Länge zu bilden. Mit unserer Technik, Gewebe von röhrenförmigen Formen, ähnlich einem Blutgefäß, kann leicht in einer Vielzahl von Abmessungen und Längen hergestellt werden, um die Bedürfnisse der Klinik und Patienten gerecht zu werden.

Nachgewiesene hier ist die Herstellung von 3 verschiedenen engineered Gefäßimplantat Größen (Abbildung 1), die zeigen , dass der Ring Stapelverfahren (RSM) skalierbar ist. Um zu beweisen , Anwendbarkeit, die 3 verschiedene Gefäßgrößen Korrelat tatsächlichen menschlichen Gefäßgröße für den linken vorderen absteigenden Arterie gewählt (klein; Lumendurchmesser = 4 mm) 17, absteigend Aorta (Zwischen; Lumendurchmesser = 10 mm) und aufsteigende Aorta (groß; Lumendurchmesser = 20 mm) 18. Die Wanddicke beträgt etwa 500 &amp; mgr; m für die kleinen Ringe und etwa 1500 &amp; mgr; m sowohl für die Zwischen- und große Ringe. Jeder Behälter nachgewiesen wird durch Stapeln 6 Ringen aufgebaut, was einer Länge von etwa 6 mm für die kleinen Behälter und 9 mm für die mittlere und große Schiffe. Länge basiert auf der Wanddicke jedes einzelnen Rings. Die histologische Analyse zeigte,hohe Zellularität in allen Ringen Größen (Abbildung 2). Red Material abgrenzt Fibrin-Gel. In kleinen Ringen wird eine kleine Menge an restlichem Fibrin-Gel auf der äußeren Kante des Rings gesehen. In den größeren Ringen wurde etwas Fibrin-Gel mit dem zellulären Inhalt setzt. In der Trichromfärbung des Masson, Hinweise auf die Produktion von Kollagen (von blau markiert) in den mittleren und großen Ringen zu sehen. Um zu bestimmen , wurden Zell - Phänotyp folgenden Ringbildung, Geweberinge mittels Immunofluoreszenz analysiert für Antikörper gegen alpha-Aktin der glatten Muskulatur (SMA) und Tropomyosin (Abbildung 3). Alle Ringgrößen waren positiv für beide Antikörper, Überprüfung, ob der glatten Muskulatur Phänotyp gehalten wurde. Zugversuch wurde an verschieden große Ringe ausgeführt ihre mechanischen Eigenschaften (4) zu bestimmen. Die U-Stretch, einem mechanical Testgerät wurde verwendet, um Test kleine und Zwischenringen und Gefäße auf Zug, während ein Instron Zugversuch große Ringe und Gefäße verwendet wurde. Der Elastizitätsmodul (E), Reißfestigkeit (UTS) und Bruchfestigkeit (FS) Daten wurden gesammelt. Eine konsequente Trend wurde mit zunehmender Stärke Korrelation zu vergrößernden Ring und Gefäßgröße beobachtet. Die Zellzahl für die Erstellung der verschiedensten Größe Ringe benötigt Aussaat erhöht annähernd linear mit der Aussaat Oberfläche (Abbildung 5). Um größere Ringe zu schaffen, mindestens 14 Millionen Zellen wurden benötigt, um die Bauchaorta große Ringe zu schaffen. Sechsringstapeln oder Schiffen, wurden auf ihre Fähigkeit getestet Strömung zu widerstehen. Konstrukten wurden geladen in einen speziell angefertigten Perfusionssystem (Figur 6) und einer für strömen bis zu 5 min bei Strömungsraten von 100 bis 417 ml / min. Die Schiffe warenLage Strömung zu widerstehen. Leichtes Tropfen wurde bei den Anschlüssen an das Perfusionssystem an den Gefäßenden, beobachtet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55322/55322fig1.jpg" /> Abbildung 1: Aufbau der skalierten konstruierte Schiffe. A) Schematische Darstellung des Verfahrens von technischen Schiffe Skalierung, beginnend mit Plattenvorbereitung, Zellaussaat und Gefäß Gebäude. Nachgewiesene sind drei unterschiedlich großen B) Ringe und C) Schiffe. D) Vertreter großer Behälter ist vollständig biologisch und ähnelt natürlichem Gewebe. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55322/55322fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die histologische Analyse. </st<html> rong&gt; H &amp; E und Trichrom Flecken des Masson zeigen für alle Ringgrößen in der gesamten Ringdicke tragfähige Zellularität. TRICHROM Flecken zeigen Bereiche der Produktion von Kollagen durch blaue (blaue Pfeile) angezeigt. Große Ringe zeigten Fibrin-Gel durchsetzt, wahrscheinlich wegen der Faltung der relativ größeren Oberfläche des Zellrasens. Maßstabsbalken: kleine Ringe = 200 &amp; mgr; m; Zwischenringe = 200 &amp; mgr; m; und große Ringe = 0,5 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55322/55322fig3.jpg" /> Abbildung 3: Immunfluoreszenz - Analyse für glatte Muskulatur Marker. Alle Ringgrößen waren positiv für glatte Muskulatur kontraktilen Proteine ​​α-Glattmuskelaktin (SMA) und Tropomyosin (Tm). Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; m.Last / 55322 / 55322fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55322/55322fig4.jpg" /> Abbildung 4: Zugversuch Analyse. Spannungs-Dehnungs-Kurven für alle Größen von Ringen und Gefäße zeigten einen allgemeinen Trend einer Erhöhung der Festigkeit mit der Zunahme der Ring / Behältergröße korreliert. Ringe und Gefäße wurden in Umfangsrichtung gestreckt. Die Parameter aus den Graphen beurteilt wurden Elastizitätsmodul, Reißfestigkeit und Bruchfestigkeit (in Tabelle 1). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55322/55322fig5.jpg" /> Abbildung 5: Zellaussaat Zahl Korrelation zu Impfen surfenace-Bereich. Basierend auf menschliche Aorta-Glattmuskelzellen. Die Oberfläche wird als der Bereich in den Ringbildung Platten zwischen dem Mittelpfosten und der Plattenwand oder Außenschale definiert. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55322/55322fig6.jpg" /> Abbildung 6: Sechs-Ring Gefäß Perfusions - Analyse unterzogen. A) Maßgeschneiderte Perfusionssystem für Flow - Tests. B) Engineered Gefäß in das Perfusionssystem geladen. Drei Gefäße wurden Perfusion auf Lecks bis zu 5 min unter Strömungsbedingungen getestet. Die Gefäße blieben stabil unter Strömung, mit geringfügigen Undichtigkeit an den Gefäßende-Anschlüsse an das System Schläuche angebracht. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322fig6large.jpg" target="_blank">um</a>eine größere Version dieser Figur. <img alt="Animierte Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55322/55322vid1.jpg" /> Animierte Abbildung 1: Demonstration der Perfusionsströmung durch eines konstruierten Schiff. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322RSM_Engineered_Vessel_Perfusion.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322RSM_Engineered_Vessel_Perfusion.mp4" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55322/55322RSM_Engineered_Vessel_Perfusion.mp4" target="_blank">.)</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> Klein </td><td colspan="2"> Mittlere </td><td colspan="2"> groß </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ringe </td><td> Elastizitätsmodul (kPa) </td><td> 13,6 ± 2,25 </td><td rowspan="3"> (N = 6) </td><td> 14,5 ± 1,2 </td><td rowspan="3"> (N = 3) </td><td> 17,2 ± 2,2 </td><td rowspan="3"> (N = 4) </td></tr><tr><td> Bruchfestigkeit (kPa) </td><td> 34,5 ± 10,2 </td><td> 39,6 ± 2,98 </td><td> 50,9 ± 10,6 </td></tr><tr><td> Bruchfestigkeit (kPa) </td><td> 34,5 ± 10,2 </td><td> 39,6 ± 2,98 </td><td> 50,9 ± 10,6 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Schiffe </td><td> Elastizitätsmodul (kPa) </td><td> 49,7 ± 2,80 </td><td rowspan="3"> (N = 3) </td><td> 59,8 ± 3,90 </td><td rowspan="3"> (N = 2) </td><td> 79,8 ± 10,1 </td><td rowspan="3"> (N = 2) </td></tr><tr><td> Bruchfestigkeit (kPa) </td><td> 115 ± 6.90 </td><td> 137 ± 12,0 </td><td> 192 ± 86,9 </td></tr><tr><td> Bruchfestigkeit (kPa) </td><td> 96,2 ± 12,2 </td><td> 60,7 ± 12,1 </td><td> 173 ± 92,2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zugeigenschaften der skalierten Ringe und Gefäßen.

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Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Skalierbare engineered Blutgefäße würde klinische Anwendbarkeit zu verbessern. Mit leicht ansehnliche 3D-gedruckte Führer, Ringe der glatten Gefäßmuskulatur wurden in eine röhrenförmige Form erstellt und gestapelt, ein Gefäßtransplantat zu bilden. Die Transplantate können so bemessen sein, um den Bereich der menschlichen Koronararterie Dimensionen gerecht zu werden, indem einfach die 3D-gedruckten Führungsgröße zu verändern.

Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

scaling-engineered-vascular-grafts-using-3d-printed-guides-ring

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K Aufrufe.  Wayne State University.  Skalierbare engineered Blutgefäße würde klinische Anwendbarkeit zu verbessern. Mit leicht ansehnliche 3D-gedruckte Führer, Ringe der glatten Gefäßmuskulatur wurden in eine röhrenförmige Form erstellt und gestapelt, ein Gefäßtransplantat zu bilden. Die Transplantate können so bemessen sein, um den Bereich der menschlichen Koronararterie Dimensionen gerecht zu werden, indem einfach die 3D-gedruckten Führungsgröße zu verändern. 

Serie: Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Forschung

Biotechnik

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, structures, phenotypes, and performance depending on each specific perfused tissue. The field of tissue engineering, which aims to repair or replace damaged or missing body tissues, relies on controlled angiogenesis to create a proper vascularization within the engineered tissues. Without a vascular system, thick engineered constructs cannot be sufficiently nourished, which may result in cell death, poor engraftment, and ultimately failure. Thus, understanding and controlling the behavior of engineered blood vessels is an outstanding challenge in the field. This work presents a high-throughput system that allows for the creation of organized and repeatable vessel networks for studying vessel behavior in a 3D scaffold environment. This two-step seeding protocol shows that vessels within the system react to the scaffold topography, presenting distinctive sprouting behaviors depending on the compartment geometry in which the vessels reside. The obtained results and understanding from this high throughput system can be applied in order to inform better 3D bioprinted scaffold construct designs, wherein fabrication of various 3D geometries cannot be rapidly assessed when using 3D printing as the basis for cellularized biological environments. Furthermore, the understanding from this high throughput system may be utilized for the improvement of rapid drug screening, the rapid development of co-cultures models, and the investigation of mechanical stimuli on blood vessel formation to deepen the knowledge of the vascular system.

Engineered tissues heavily rely on proper vascular networks to provide vital nutrients and gases and remove metabolic waste. In this work, a stepwise seeding protocol of endothelial cells and support cells creates highly organized vascular networks in a high-throughput platform for studying developing vessel behavior in a controlled 3D environment.

Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Standardized Technique of Aortic Valve Re-implantation for Valve-sparing Aortic Root Replacement

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures prevents a number of cardiac surgeons from incorporating them into their practice. The aim of this protocol is to describe a simplified and user-friendly technique of an aortic valve-sparing root replacement (VSRR) procedure by re-implantation of the aortic valve. Proper selection of patients and limitations of the technique are discussed.
In 54 consecutive patients, normal appearing aortic valves were re-implanted in a commercially available polyester prosthesis with pre-shaped sinuses by a simplified and standardized technique. Placement of the first row of the proximal suture line, choice of the prosthesis size, and adjustment of the height of the commissures of the patient to the fixed height of the sinus portion of the prosthesis were slightly modified from the reference techniques with the aim of increasing its feasibility for use by other cardiac surgeons. Early mortality and morbidity as well as 5-year survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were collected in all patients.
Thirty-day mortality, re-sternotomy for bleeding, re-sternotomy for mediastinitis, and the incidence of stroke were very low, 1.8% for each (1 of 54). No patient required permanent pace-maker implantation. At 5 years, survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were 97.5%, 95.2%, and 91.6%, respectively.
Mid-term results of our standardized technique of re-implantation of the aortic valve for valve-sparing aortic root replacement are very good and compare with more complex techniques reported by experienced surgeons. By following the present protocol of the standardized re-implantation technique, a greater number of cardiac surgeons can perform this procedure with comparable good results.

Valve-sparing aortic root replacement has the advantage of preserving the patient&#39;s own aortic valve. The complexity of the reported techniques to date restricts their use to a limited number of cardiac surgeons. This protocol describes step-by-step a standardized technique reproducible by a greater number of cardiac surgeons.

Standardisierte Technik der Aortenklappe erneute Implantation für Ventil-sparing Aortic Root Ersatz

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures ...

Medizin

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

Herstellung von technischen Gefäßklappen mit 3D-Drucktechnologien

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

Drei-dimensionale Druck einer komplexen Aorten Anomalie

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...