Name: a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
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Diese Forschung wurde von T32 (CA 9686-18) und TL1 (TL1TR001431) Postdoc-Stipendium Auszeichnungen (LT), DOD PC140268 (CA) unterstützt, W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) sowie U01 PAR-12-095 (Kumar) und P30 CA051008-21 (Weiner). Beispiel Fixierung, Schneiden und Färben wurde in der Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologie und Tissue Shared Resource ausgeführt. Wir danken Richard Schlegel für hilfreiche Diskussionen. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health vertreten.

1. Aufbau des 3D-Zellkultur Insert System <ol><li> Platzieren 2 Polycarbonat Zellkultureinsätze in einer umgekehrten Ausrichtung (Filterseite nach oben) nach unten in einer 6 - Well - Platte (1A). </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht von 0,1% Gelatine in Wasser auf die Unterseite des Einsatzes und erlauben (10-20 min) in einem biologischen Sicherheitsschrank trocknen Sterilität aufrecht zu erhalten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male für insgesamt 3-Anwendungen von 0,1% Gelatine auf die Einsätze. HINWEIS: Die Gelatinebeschichtung Grenze Diffusion zwischen den Kammern helfen. </li><li> Um die primäre CRCs von Standardkulturbedingungen sammeln, 5 ml PBS, die Kulturflasche zu waschen. <ol><li> Trypsinize die Zellen unter Verwendung von (1 ml für eine T-25 und 2 ml für eine T-75) 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht auf die Seite des Kolbens in Verdrängen der Zellen zu unterstützen. Dann gehen die Trypsin Reaktion zu stoppen und die Zellen zu sammeln, indem 5 ml komplettem DMEM. </li><li> Sammeln<html> die Zellen in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 ° C und 188 xg und zählen eine automatisierte Zellzähler oder eine Zählkammer. </li><li> Re-suspend 600.000 CRCs in 250 &amp; mgr; l konditioniertes Medium (CM) und zu der richtig ausgerichtet (Filterseite nach unten) Kultureinsatz (Abbildung 1B). Dies wird bezeichnet als die innere Kammer. Anmerkung: CM ist F-Medien durch bestrahlte J2 - Zellen konditioniert und enthält 10 &amp; mgr; m Y-27632 , wie vorstehend beschrieben , 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Bewerben 2 ml CM in die äußere Kammer des 6-Well-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C (für mindestens 18 h). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die CM auf der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette und langsam Differenzierungsmedium (DM) in die innere Kammer mit einer 1-ml-Pipette bis zur vollständigen hinzuzufügen. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Zellschicht stören. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Wartung von 3D-Kulturen <ol><li> Überprüfen Sie jeden Tag die Kulturen. Gesunde Zellen erscheinen , wie in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Ändern des CM in der äußeren Kammer jeden Tag oder jeden zweiten Tag in Abhängigkeit vom Stoffwechsel der Zellen. </li><li> Wenn die Medien der inneren Kammer ändert sich die Farbe (gelb), sorgfältig die Medien auf der inneren Filterkammer zu entfernen mit einem 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette. </li><li> Saugen Sie das Medium in der Kammeraußen 6-Well-Platte mit einem saugenden Spitze. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Pipette gelten langsam frisch DM in die innere Kammer bis zur vollständigen. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen oder auf andere Weise die Zellschicht entfernen. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in die äußere Kammer mit 2 ml frischem CM. </li><li> Pflegen die Kulturen für 2 Wochen und dann die Verarbeitung für die gewünschte Isolations bimolekularen fortzufahren. HINWEIS: Jede Zeile in der 6 - Well - Platte, insgesamt sechs Einsätze (Abbildung 1B), sollte pro Experiment verarbeitet werden , um genügend Zellen für die DN zu erwerbenA, RNA oder Protein, für die Analyse. </li><li> Aspirat Medien in der äußeren Kammer und Spülen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Sorgfältig Medien aus der inneren Kammer mit einer 1 ml Pipette oder 200 &amp; mgr; l zu entfernen und 500 &amp; mgr; l PBS hinzu. Vermeiden Abkratzen oder anderweitig stören die Zellen auf der Membran. </li><li> Aspirat PBS von der äußeren Kammer und vorsichtig PBS aus der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette entfernen. Sobald die PBS entfernt wurde, gehen direkt an die entsprechende Anwendung weiter unten beschrieben. Nicht in die Membran austrocknen. Die Kultur kann kurz in der PBS gehalten werden, bis die Anwendung bereit ist, zu beginnen. </li></ol> 3. Die Verarbeitung der Filter für die Pellet-Banking <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Innenkammer und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Kurz und vorsichtig rühren / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer 200 &amp; mgr; l Pipette beim Pipettieren nach oben und unten (vermeiden puncTuring die Membran). Inkubieren für 1 min bei 37 ° C. </li><li> Fügen Sie 250 ul von CM zu der ersten inneren Kammer und Pipette nach oben und unten vorsichtig den Filter zu spülen. </li><li> Transfer-Zellen zu der benachbarten Filterkammer resuspendiert, die dieselben Medienbedingungen enthält und wiederholen Auf- und Abpipettieren. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der Einsätze aus einem einzigen Zustand. Sammeln und zu transferieren Zellen in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spülen jede innere Kammer mit einer zusätzlichen 100-200 uL CM alle verbleibenden Zellen zu sammeln. In den 1,5 ml Zentrifugenröhrchen in Schritt 3.5. </li><li> Dreh die Zellen bei 423 · g in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren und waschen einmal das Zellpellet mit 1000 ul PBS. </li><li> Spin wieder bei 423 xg in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Absaugen PBS und Einfrieren bei -80 ° C für die spätere Verwendung. </li></ol> 4. Die Verarbeitung der Filter für die RNA oder DNA-Isolierung <ol&gt; <li> Mit 200 &amp; mgr; l Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform oder ähnlichen Extraktionsreagens zu der inneren Kammer und kurz auf die Zellen auf der Membranoberfläche agitieren durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Inkubieren in dem Extraktionsreagenz für 5 min bei Raumtemperatur mit der äußeren Kammer trocken. <ol><li> Da der Filter aus dem Einsatz distanzieren kann, waschen Sie die distanzierte Filtermembran durch Auf- und Abpipettieren der Extraktionslösung. Sammeln Sie so viel des Extraktionsreagenz wie möglich durch die 6-Well-Platte Kippen und Restflüssigkeit abgesaugt. </li></ol></li><li> Folge dem Protokoll des Herstellers zur Reinigung und Rückgewinnung von DNA, RNA oder Protein. </li></ol> 5. Die Verarbeitung der Filter für die Proteinisolierung <ol><li> Setzen Sie den Filtereinsatz in der 6-Well-Platte auf Eis. Zu der inneren Kammer, mit 10 ul Puffer Protein Lyse, supplementiert mit 1 mM Natriumfluorid (NaF), 1 mM Natriumvanadat (NaV), 100 mM dithiothreITOL (DTT) und 100 &amp; mgr; l anti-Protease-Cocktail. </li><li> Rühre / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer Pipette 20 ul beim Pipettieren nach oben und unten. Vermeiden Blasen in dem Lysepuffer erzeugen. </li><li> Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit Filtereinsätzen auf Eis für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie kratzen und dann spülen Sie die Membranoberfläche mit dem Lysepuffer. </li><li> Sammeln Sie die Lysate aus den 6-Einsätze und Transfer in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Spülen der ersten Membran mit zusätzlichen 10 &amp; mgr; l Lysepuffer und Transfer zum nächsten Filter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.6 für alle Einsätze, restliche Lyse-Pufferlösung zu sammeln und zu der 1,5 ml-Röhrchen (Schritt 5.5). </li><li> Inkubieren Sie die Probe auf Eis für weitere 5 min. </li><li> Spin bei maximaler Geschwindigkeit (16.873 xg in einer Tischzentrifuge) für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Pipette Lysatüberstand in ein frisches 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Fahren Sie mit der Analyse der Proteinkonzentration oder store Lysate bei -80 ° C. </li></ol> 6. Verarbeitung für H &amp; E und Immuno-Färbung <ol><li> Fügen 500 ul und 1 ml 10% NBF (neutral gepuffertes Formalin) zu der inneren und der äußeren Kammer und ließ über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Absaugen NBF von der äußeren Kammer und 1 mL hydroxyethyl Agarose (HEA) Verarbeiten Gel auf eine 1,5-ml-Zentrifuge. Langsam schmelzen die Agarose in einem Mikrowellen niedriger Leistung mit und 10-20 s Impulse wiederholt, bis die Agarose geschmolzen ist. </li><li> Halten Sie die HEA in einem 37 ° C warmen Bad Erstarrung zu verhindern, bis sofort einsatzbereit. </li><li> Entfernen Sie die NBF aus der inneren Kammer und anzuwenden 25 ul geschmolzenes HEA in die innere Kammer und damit die Agarose für 2-5 min verfestigt. </li><li> Wet 2 Schaum Histologie Pads in 10% NBF und legen Sie ein Pad in einer Einbettungskassette (siehe 3D). </li><li> Verwenden Sie ein # 11 Klinge Skalpell (was eine sehr scharfe hat, fein spitzer Klinge), um den Filter von der Unterseite des Einsatzes zu punktenKammer, indem Sie sie teilweise aus der Kunststoffeinsatz Kammer. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge (100-200 ul) NBF in einer Petrischale und tauchen Sie den teilweise verdrängt Filter in der NBF (3A). </li><li> Mit einem # 10 Skalpellklinge, drücken leicht gegen die Mitte des Filters, von der Innenseite des Einsatzkammer, um vollständig den Filter aus dem Einsatz barrel (3B) entfernen. Wenn es irgendein Teil des Filters ist, die noch an der Trommel angebracht ist, trennen sie mit dem Skalpell. </li><li> Schneiden Sie die HEA-beschichteten Filter in der Hälfte mit dem # 10 Klinge Skalpell (3C). </li><li> Platzieren Sie jede Hälfte des Filters auf das Schaumstoffpolster in der Kassette Histologie vorbereitet in Schritt 6.4 (3D). </li><li> In den zweiten 10% NBF getränkten Schwamm in die Kassette, zwischen denen die Filter. </li><li> Snap-Siegel der Kassette, in NBF und über Nacht inkubiert. </li><li> Prozessfilter in Paraffinblöcke für das Schneiden und Färben alszuvor beschrieben 12. </li></ol>

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	<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis.">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li><li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development.">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li><li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+stem+cells.">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li><li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells.">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li><li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells.">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li><li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogs+of+the+Novel+Phytohormone,+Strigolactone,+Trigger+Apoptosis+and+Synergy+with+PARP1+Inhibitors+by+Inducing+DNA+Damage+and+Inhibiting+DNA+Repair.">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868 (2015).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Primäre Zelllinien sind ein wichtiges und sich schnell entwickelnde Plattform für die Krebsforschung. Die Kultureinsatz-basierte 3D-Kultursystem unterstützt die Differenzierung von primären Prostata CRCs innerhalb einer zweiwöchigen Frist. Der CRC-Filter-Methode stellt eine neue, mittlere Durchsatzverfahren für Prostata-Forschung. Bestehende Maus PDX-Modelle sind zeitaufwendig und extrem teuer, und viele der PDX Proben nicht in Kultur gezüchtet werden, Forschern initiierte Experimente und ihre Nützlichkeit begre...

Die Identifizierung und Nutzung von Krebstherapien, die auf Einzelpersonen personalisiert sind ein vorrangiges Ziel in der Krebsforschung. Kürzlich wurden neue Konzepte entwickelt, die in die Einrichtung von primären Zellkulturen für größere Leichtigkeit ermöglichen, möglicherweise Weisen sowohl die Identifizierung und Prüfung personalisierten Therapien bieten. Zum Beispiel kann der R-spondin Basis Prostata organoiden Ansatz 1 für dreidimensionale (3D) Kultivierung von normalen und metastatischen Prostatakrebszellen in einer kommerziellen extrazellulären Matrix (beispielsweise Matrigel), während die Bedingter Reprogrammierung von Zellen (CRC) Verfahren an der Georgetown 2 entwickelt, nutzt 3 weitere Standard - 2D - Kulturbedingungen. Insbesondere führen die Kombination aus einem Rho - Kinase - Inhibitor (Y-27632) und bestrahlten J2 Maus - Fibroblasten - Feeder - Zellen auf unbestimmte Zeit Kultivierung von Keratinozyten CRCs 2. Die CRC-Methodik istextrem robust, mit primären Zelllinien erfolgreich etabliert und auf unbestimmte Zeit aus der Prostata und viele andere normalen und malignen epithelialen Geweben 3 gehalten. Wichtig ist, dass unsere CRC-Technologie für die schnelle Identifizierung der ursächlichen Basis für rezidivierende Atemwegs Papillomatose bei einem Patienten erlaubt, die eine Reihe von früheren medikamentösen Behandlungen versagt hatte. Darüber hinaus mit normalen und tumorabgeleiteten CRCs genehmigte die erfolgreiche Identifizierung eines FDA Droge, Vorinostat, wurde innerhalb von zwei Wochen nach der anfänglichen Gewebebiopsie gemacht. Der Patient wurde auf vorinostat platziert, in der erfolgreichen Behandlung ihrer Erkrankung 4 führt. Die normale Prostata wird von Luminal, basal umfasste und den seltenen neuroendokrinen Zellen 5. Luminalen Zellen bilden die säulen Epithelschicht der Drüse und drücken den Androgen-Rezeptor (AR), sowie andere luminalen Marker wie Zytokeratine 8 und 18 und Prostate-spezifischen Antigens (PSA) 6. Im Gegensatz dazu sind die basale Zellen unterhalb der luminalen Schicht lokalisiert und Zytokeratin 5 und p63 exprimieren, aber geringe Mengen des AR 5. Wir haben 7, 8, 9 und andere 10 haben erfolgreich Prostata CRCs in präklinischen mechanistischen Arzneimittelempfindlichkeit Untersuchungen verwendet. Wenn jedoch unter Standard - 2D - Gewebekulturbedingungen gezüchtet, versagen diese Zellen vollständig AR Signalisierung 10 zu beteiligen. Wichtig ist gesetzt, wenn sie unter die Nierenkapsel von immungeschwächten Mäusen, gewann die CRCs normalen Prostatadrüsen Architektur und Funktion anzeigt, dass Prostata CRCs ihre Abstammung Engagement beibehalten, wenn sie in einer permissiven Umgebung platziert. Die Entwicklung des Filtereinsatzes basierenden Zellkultur hier beschriebene System ermöglicht eine schnelle (2 Wochen) in vitro Differenzierung von Prostata CRCs als belegt by die erhöhte Expression des AR und AR Zielgene sowie verringerte Mengen an p63. Die Filtereinsätze verwendet werden, enthalten Polycarbonatmembranen (Porengröße 0,4 &amp; mgr; m), die die Kultivierung von Säugetierzellen zu unterstützen. Das System, wie entwickelt, macht Gebrauch von normalen und malignen Prostata CRCs, 6-Well-Kulturschalen und die Filtereinsätze. Zellkulturmedien bedingt durch J2 - Zellen 11 ist in der unteren Kammer und der Prostata Differenzierungsmedien in der oberen Kammer angeordnet. Die hierin beschriebenen Techniken Prostata luminalen Zelldifferenzierung innerhalb einer 2-wöchigen Zeitraum, im Einklang mit den Zielen der personalisierten Medizin zu unterstützen. Es war auch zwingend notwendig, die Methoden zu entwickeln, die für die umfassende molekulare, genetische und zelluläre Profilierung der Kulturen ermöglichen. Ansätze zur Isolierung von DNA, RNA und Protein aus Zellen von der Filteroberfläche gelöst wurden für eine genaue Wiederholungsprobenverarbeitung entwickelt und rationalisiert. Finally, Einbettung zu ermöglichen, die Methode zum Entfernen des Filters erforderlich ist, Schneiden und für H &amp; E, immunhistochemischen und Immunfluoreszenzfärbung wird vollständig beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Inserts</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 Well</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin 0.1% in water</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Standard Scalpel 11 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Vanadate</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Nutrient Mix Media</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Non-Adherent Dressing</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation

Bedingtes umprogrammiert Zellen (CRCs) eine nachhaltige Methode zur primären Zellkultur und die Fähigkeit, umfangreiche &quot;living Biobanken&quot; von Patienten abgeleiteten Zelllinien zu entwickeln. Für viele Typen von Epithelzellen, verschiedene dreidimensionale (3D) Kultur Ansätze beschrieben worden, die eine verbesserte differenzierten Zustand unterstützen. Während CRCs ihre Abstammung Engagement für das Gewebe zu halten, aus dem sie isoliert sind, versagen sie viele der Differenzierungsmarker mit dem Ursprungsgewebe assoziiert auszudrücken, wenn sie unter normalen zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet. Um die Anwendung von Patienten stamm CRCs für Prostatakrebs Forschung verbessern, ein 3D-Kultur-Format definiert wurde, die eine schnelle (2 Wochen insgesamt) luminalen Zelldifferenzierung in normalen und Tumor-abgeleitete Prostata-Epithelzellen ermöglicht. Hierbei wird ein Filtereinsatz basierten Format wird sowohl für die Kultivierung und Differenzierung von normalen und malignen Prostata CRCs beschrieben. A dedetaillierte Beschreibung der Zellenerfassung und -verarbeitung für immunhistochemischen und Immunfluoreszenzanfärbung erforderlichen Verfahren für vorgesehen sind. Zusammengefasst das 3D-Kultur-Format beschrieben, mit den primären CRC-Linien kombiniert wird, liefert einen wichtigen mittel- Durchsatz Modellsystem für High- Bioprobe-basierte Prostata Forschung.

Der Zellkultureinsatz basiertes System ist ein relativ einfaches und schnelles Verfahren für die 3D-Kulturen von Prostata-CRCs produzieren, die luminale Zelldifferenzierung unterstützt. Eine schematische Darstellung des Systems gezeigt (Abbildung 1A) , die Anwendung der Gelatinebeschichtung an der unteren Oberfläche des Filtereinsatzes hervorhebt. Die Einsätze sind nur für die Anwendung der Gelatine umgeworfen. In 1B sind die Filter in der geeignete...

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A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Serie: A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement membrane (BM) during age-related pathologies and metabolic disorders (e.g. cancer, diabetes, microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy). The premise of the model is non-enzymatic crosslinking of reconstituted BM (rBM) matrix by treatment with glycolaldehyde (GLA) to promote advanced glycation endproduct (AGE) generation via the Maillard reaction. Examples of laboratory techniques that can be used to confirm AGE generation, non-enzymatic crosslinking and increased stiffness in GLA treated rBM are outlined. These include preparation of native rBM (treated with phosphate-buffered saline, PBS) and stiff rBM (treated with GLA) for determination of: its AGE content by photometric analysis and immunofluorescent microscopy, its non-enzymatic crosslinking by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) as well as confocal microscopy, and its increased stiffness using rheometry. The procedure described here can be used to increase the rigidity (elastic moduli, E) of rBM up to 3.2-fold, consistent with measurements made in healthy versus diseased human prostate tissue. To recreate the biophysical microenvironment associated with the aging and diseased prostate gland three prostate cell types were introduced on to native rBM and stiff rBM: RWPE-1, prostate epithelial cells (PECs) derived from a normal prostate gland; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by benign prostatic hyperplasia (BPH); and PC3, metastatic cells derived from a secondary bone tumor originating from prostate cancer. Multiple parameters can be measured, including the size, shape and invasive characteristics of the 3D glandular acini formed by RWPE-1 and BPH-1 on native versus stiff rBM, and average cell length, migratory velocity and persistence of cell movement of 3D spheroids formed by PC3 cells under the same conditions. Cell signaling pathways and the subcellular localization of proteins can also be assessed.

Here we explain a protocol for modelling the biophysical microenvironment where crosslinking and increased stiffness of the basement membrane (BM) induced by advanced glycation endproducts (AGEs) has pathological relevance.

Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Forschung

Krebsforschung

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are a rigorous method for studying mammalian development and disease. Our laboratory has developed several GEMMs of prostate cancer (PCa) that lack expression of one or multiple tumor suppressor genes using the site-specific Cre-loxP recombinase system and a prostate-specific promoter. In this article, we describe our method for necropsy of these PCa GEMMs, primarily focusing on dissection of mouse prostate tumors. New methods developed over the last decade have facilitated the culture of epithelial-derived cells to model organ systems in vitro in three dimensions. We also detail a 3D cell culture method to generate tumor organoids from mouse PCa GEMMs. Pre-clinical cancer research has been dominated by 2D cell culture and cell line-derived or patient-derived xenograft models. These methods lack tumor microenvironment, a limitation of using these techniques in pre-clinical studies. GEMMs are more physiologically-relevant for understanding tumorigenesis and cancer progression. Tumor organoid culture is an in vitro model system that recapitulates tumor architecture and cell lineage characteristics. In addition, 3D cell culture methods allow for growth of normal cells for comparison to tumor cell cultures, rarely possible using 2D cell culture techniques. In combination, use of GEMMs and 3D cell culture in pre-clinical studies has the potential to improve our understanding of cancer biology.&#160;

We show a method for necropsy and dissection of mouse prostate cancer models, focusing on prostate tumor dissection. A step-by-step protocol for generation of mouse prostate tumor organoids is also presented.

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Genetik

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Bewertung der Differenzierungskapazität von Mausprostataepithelzellen mithilfe der organoiden Kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate organoids are androgen responsive, three-dimensional (3D) cultures grown in a defined medium that resembles the prostatic epithelium. Prostate organoids can be established from wild-type and genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer. Importantly, patient derived organoids closely resemble tumors in genetics and in vivo tumor biology. Moreover, organoids can be genetically manipulated using CRISPR/Cas9 and shRNA systems. These controlled genetics make the organoid culture attractive as a platform for rapidly testing the effects of genotypes and mutational profiles on pharmacological responses. However, experimental protocols must be specifically adapted to the 3D nature of organoid cultures to obtain reproducible results. Described here are detailed protocols for performing seeding assays to determine organoid formation capacity. Subsequently, this report shows how to perform drug treatments and analyze pharmacological response via viability measurements, protein isolation, and RNA isolation. Finally, the protocol describes how to prepare organoids for xenografting and subsequent in vivo growth assays using subcutaneous grafting. These protocols yield highly reproducible data and are widely applicable to 3D culture systems.

Presented here is a protocol to study pharmacological responses in prostate epithelial organoids. Organoids closely resemble in vivo biology and recapitulate patient genetics, making them attractive model systems. Prostate organoids can be established from wildtype prostates, genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer.

Prostataorganoidkulturen als Werkzeuge zur Übersetzung von Genotypen und Mutationsprofilen in pharmakologische Reaktionen

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

Etablierung und Analyse von dreidimensionalen (3D) Organoiden, abgeleitet von Patienten prostatakrebs Knochenmetastasen Proben und ihre Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process involves seeding of epithelial cells sparsely in a 3D matrix gel on a 96-well microplate with media changes to cultivate expansion into organoids. Morphology is then assessed by whole-well capturing of z-stack images. Compression of z-stacks creates a single in-focus image from which organoids are measured to quantify a variety of outputs, including circularity, roundness, and area.DNA, RNA, and protein can be collected from organoids recovered from the matrix gel. Cell populations of interest can be assessed by organoid dissociation and flow cytometry. Formalin-fixation-paraffin-embedding (FFPE) followed by sectioning is used for the histological assessment and antibody staining. Whole-mount immunofluorescent staining preserves organoid morphology and facilitates observation of protein localization in organoids in situ. Commercial assays that are traditionally used for 2D monolayer cells can be modified for 3D organoids. Used together, the techniques in this protocol provide a robust toolbox to quantify prostate organoid growth, morphologic characteristics, and expression of differentiation markers.

Here, we present a protocol to guide human primary prostate organoid handling then suggest endpoints to assess phenotype. Seeding, culture maintenance, recovery from matrix gel, morphologic quantification, embedding and sectioning, FFPE sectioning, whole-mount staining, and application of commercial assays are described.

Bearbeitung und Bewertung der menschlichen primäre Prostata organoide Kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Biotechnik

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls and restrict access to the brain parenchyma. However, with the development of nanotechnologies, large panels of new nanomaterials were developed to improve drug delivery, highlighting the need for reliable in vitro microsystems to predict brain penetration in the frame of preclinical assays. Here is a straightforward method to set up a microphysiological system to model the BBB using solely human cells. In its configuration, the model consists of a triple culture including brain-like endothelial cells (BLECs), pericytes, and astrocytes, the three main BBB cellular actors necessary to induce and regulate the BBB properties in a more physiological manner without the requirement of tightening compounds. The model developed in a 12-well plate format, ready after 6 days of triple culture, is characterized in physical properties, gene, and protein expressions and used for polymeric nanogel transport measurement. The model can be used for an extensive range of experiments in healthy and pathological conditions and represents a valuable tool for preclinical assessments of molecule and particle transport, as well as inter-and intracellular trafficking.

This protocol describes a method to establish a human blood-brain barrier (BBB) in vitro model. The endothelial cells and pericytes are seeded on each side of an insert filter (blood compartment), and astrocytes are seeded in the bottom well (brain compartment). The model characterized was used for nanoparticles transport experiments.

Ein Dreifachkulturzellsystem, das die menschliche Blut-Hirn-Schranke modelliert

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Biologie

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

Ein innovativer 3D-gedruckter Einsatz, der für einfache 2D- und 3D-Zellkulturen entwickelt wurde

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...