Name: observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus at JoVE.com

Najie Zhu und Liqun Bai trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch den Sonderfonds für Forstwirtschaft Wissenschaftliche Forschung in der öffentlichen Wohlfahrt (201204501) und der National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688 und 31570638) unterstützt. Wir danken Dr. Holighaus Gerrit und Dr. Danielle Hickford für ihre hilfreichen Anregungen auf Englisch schreiben.

1. Erwerb von Virgin Adult Nematoden <ol><li> Pinewood Nematoden - Isolat und Kulturbedingungen Hinweis: Um die B. xylophilus isolieren Nxy61 ursprünglich von einem erkrankten Pinus massoniana im Ningbo Gebiet der Provinz Zhejiang in China extrahiert wurde. <ol><li> Bereiten Sie Kartoffel - Dextrose - Agar (PDA, siehe Tabelle der Materialien) Platten für den Anbau von Botrytis cinerea. </li><li> Zur Inokulation ein Stück Pilz-Matte mit einem Durchmesser von 10 mm aus einem B. cinerea Matte Punsch und es in der Mitte eines neuen PDA - Platte setzen. Kultur der B. cinerea für 5 d bei 25 ° C im Dunkeln. </li><li> Kultur die pinewood Nematoden in die vorbereitete Petrischale mit B. cinerea bei 25 ° C im Dunkeln. </li></ol></li><li> Erwerb von B. xylophilus Eier <ol><li> Legen Sie eine geklemmt Gummischlauch unter einen Trichter und halten Sie die vorbereiteten Trichter in einem Rack die zusammenBaermann Trichtervorrichtung. Platzieren zwei Schichten von Filterpapier anstelle von Gaze in den Mund des Trichters. </li><li> Übertragen Sie die Pilzkulturen auf den Trichter Setup und Wasser hinzufügen, bis die Pilzmatte eingetaucht ist. Warten Sie 2 h, und Nematoden aus der Pilzkultur herauskommen wird, kreuzen Sie das Filterpapier, und sich in den untersten Teil des Baermann-Trichter nach unten. </li><li> Sammeln Sie die ersten paar Tropfen Wasser aus dem Boden des Röhrchens in ein 15 ml-Röhrchen und sammeln Nematoden langsam auf dem Rohr die Klemme freigegeben wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die oben Sammlungen bei 3000 × g für 2 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die obere Schicht aus Wasser mit einer Pipette und resuspendieren es mit 1 ml sterilem doppelt destilliertem (dd) H 2 O. </li><li> Mit einer Pipette die oben Aufwirbelung auf ein neues Glas-Petrischale (6 cm Durchmesser). 3 ml steriler dd H 2 O in die Petrischale , um sicherzustellen , dass die Nematoden frei schwimmen können. </li><li> Halten Sie die Nematoden im Glass Petri bei 25 ° C im Dunkeln für 10 min Schale. Eier werden von schwangeren Frauen gelegt werden. Aufgrund ihrer Glykoprotein Oberfläche, klebt die Eier an der Unterseite der Glaspetrischale. </li><li> Entfernen Sie das Wasser und Würmer vorsichtig, ohne die Eier zu stören. 3 ml steriler dd H 2 O auf die Glaspetrischale unmittelbar um die Eier zu verhindern , vor dem Austrocknen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2.8 3x zu entfernen Sie alle Larven und Erwachsene, und erhalten die reinen Eier. Fügen Sie eine zusätzliche 2 ml (5 ml insgesamt) steriler dd H 2 O zu der Petrischale. </li></ol></li><li> Der Erwerb der vierten Stufe Jugendlichen (J4 Larven) <ol><li> Hatch die gesammelten Eier für 24 h im Dunkeln bei 25 ° C J2 Larven zu erhalten. </li><li> Übertragen Sie die J2-Larven mit einer Pipette in ein 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 3000 × g für 2 min, und entfernen Sie die obere Wasserschicht. </li><li> Resuspendieren J2 - Larven mit 200 ul steriler dd H 2 O, und dann übertragen zudie PDA - Platte B. cinerea enthält. </li><li> Kultur der J2-Larven für 52 h bei 25 ° C im Dunkeln. Zu diesem Zeitpunkt werden die meisten J2-Larven in der frühen Phase der J4 Larven entwickelt. </li></ol></li><li> Erwerb von nativem erwachsenen Nematoden <ol><li> Bereiten Sie eine Nadel für Nematoden Aufnehmen durch eine Glaskapillare zeichnen, nachdem sie über einen Spiritusbrenner erhitzt wird. HINWEIS: Die Spitze dieses Kapillarnadel benötigt normalerweise 50 &amp; mgr; m im Durchmesser sein, etwa der Körperbreite eines erwachsenen Nematoden, so daß sie als Werkzeug zum Aufnehmen eines einzelnen Nematoden verwendet werden kann. </li><li> Bauen Sie eine Baermann-Trichter und extrahieren Nematoden aus den Pilzkulturen für 2 h, wie 1.2.1 in den Schritten - 1.2.3. </li><li> Übertragen Sie die J4 mit Wasser in eine saubere Petrischale. </li><li> Beachten Sie die Nematoden unter einem Stereomikroskop und zu unterscheiden zwischen Männern und Frauen von Genitalmorphologie, wie von Mamiya und Kiyohara 8 (Abbildung 1 </strong&gt;). Pick-up eine Nematode des gewünschten Geschlechts mit der vorbereiteten Kapillarnadel und übertragen sie an den entsprechenden Pilz-Kulturplatte für Männer oder Frauen. HINWEIS: Es gibt mehr Frauen als Männer, wobei der Anteil der Frauen bei 60 bis 70%. Die weibliche Vulva ist offensichtlich von dem männlichen spicule. Im Vergleich zu den Erwachsenen ist die spicule oder Vulva in der Frühphase J4 kleiner, aber sie können immer noch leicht zu erkennen und zu unterscheiden. Die Nematoden bewegt sich immer im Wasser, die manchmal die Schwierigkeit erhöht sich bei Männern und Frauen unterscheiden. </li><li> Kultur der J4 Larven für weitere 24 h bei 25 ° C im Dunkeln. Hinweis: Alle Nematoden zu Erwachsenen entwickeln sollte, aber da sie nicht zusammengefügten sind, werden sie als Jungfrau Erwachsene angesehen. </li><li> Montieren Sie zwei Baermann-Trichter und extrahieren Sie die jungfräuliche Erwachsene aus den Pilzkulturen für 2 h, wie in den Schritten 1.2.1 - 1.2.3, und übertragen Sie die Jungfrau erwachsenen Männern und Frauen in zwei getrennte, saubere Petrischalen. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Beobachtung und Videoaufzeichnung von Paarungsverhalten <ol><li> Bereiten Sie mehrere konkave Dias und mit 200 &amp; mgr; l sterilem dd H 2 O zu jedem ihrer Brunnen. </li><li> Pick-up die vorbereitete Jungfrau erwachsenen männlichen oder weiblichen und mit einer Kapillare Nadel und stellen nur eine Nematode in das Wasser jedes konkaven Folie. </li><li> Halten Sie die Jungfrau Erwachsene im Inneren des gut 1 h, damit sie auf die neue wässrige Umgebung anzupassen. </li><li> Paar eine Jungfrau männlich und weiblich von einem von ihnen von einer Vertiefung zur anderen zu übertragen mit einer Pipette. </li><li> Beobachten Sie das Paarungsverhalten der 1♀ + 1♂ Kombination in der konkaven Objektträger unter einem Stereomikroskop. </li><li> Um die Paarungseffizienz von nativem Erwachsene analysieren, berechnen ihre Paarungserfolgsrate (R) und vergleichen Sie es mit dem von zufällig ausgewählten Erwachsenen-Paare. Berechnen R als der Prozentsatz von Replikaten in denen Kopulation beobachtet wurde, verglichen mit der Gesamtzahl der untersuchten Replikaten. </li><li1♀ + 3♂ und 3♀ + 1♂:&gt; Um Paarung Wahl und intra Wettbewerb, Gruppen- und beobachten virgin Nematoden von zwei verschiedenen Kombinationen untersuchen. </li><li> Um Daten für die qualitative und quantitative Analyse zu sammeln, zu filmen das Paarungsverhalten Videomikroskopie. Normalerweise, wenn die ganze Paarungsprozess, von der Zeit, die Nematoden in der Vertiefung des konkaven Schlitten auf den Moment gestellt werden, wenn sie weg nach der Kopulation bewegen, wird innerhalb von 2 h abgeschlossen. Daher nehmen Sie das passende Verfahren kontinuierlich für mindestens 2 h als eine Replikation. Komplette mindestens 30 Wiederholungen insgesamt für jede Kombination. HINWEIS: In steriler dd H 2 O ( in der Regel 50 &amp; mgr; l) alle 0,5 h auf die gut für die Verdampfung während des Aufzeichnungsprozesses zu kompensieren. </li></ol> 3. Datenerfassung <ol><li> Alle Videos sorgfältig auf einem Computer-Bildschirm und zeichnen die Unter Verhaltensweisen qualitativ. </li><li> Messen Sie die Dauer der Paarung mit the Frame-by-Frame-Funktion des Videorecorders. Manuell subtrahieren von dem Endpunkt der Startzeit. </li><li> Für die 1♀ + 1♂ Kombination, analysieren jede Videoaufzeichnung und messen die Dauer der folgenden Ereignisse: <ol><li> Messen Sie die Dauer der Suche (dh die Zeit aus , wenn die weiblichen und männlichen sind in den Brunnen des konkaven Schlitten eingeführt zu dem Moment , sie begegnen und einander berühren). </li><li> Messen der Dauer des In- Kontakt (dh die Zeit vom ersten Kontakt bis zu dem Moment , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist zum ersten Kopulation). </li><li> Messen der Dauer der Kopulation (dh die Zeit von , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist , bis er aus dem weiblichen Körper nach der Ejakulation gleitet nach unten). Hinweis: Einige Nematoden mehrmals in 2 h kopulieren können. In solchen Fällen messen die Dauer der Kopulation von der ersten Kopulation bis zum Ende des last ein, einschließlich der Zeit dazwischen. </li><li> Messen Sie die Dauer des Verweilens (dh die Zeit nach der Kopulation , bis die männlichen und weiblichen Bad voneinander entfernt und sind durch einen Abstand von mehr als der Nematoden Körperlänge ( in der Regel 1 mm) getrennt). </li></ol></li><li> Zählen Sie die Kopulation Häufigkeit und Dauer jeder Kopulation und die durchschnittliche Dauer aller Paarungen in 2 h für jede der verschiedenen Kombinationen (dh 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂). </li><li> Berechne den Paarungserfolgsrate für den ersten Kontakt (P) für die verschiedenen Kombinationen als die Erfolgsrate der Paarung nach dem ersten Kontakt, der unmittelbar und ohne Unterbrechung durchgeführt wird. In der Kontaktphase kann mehrere Kontakte vor der eigentlichen Kopulation beobachtet werden. <ol><li> Wenn der Abstand zwischen zwei Individuen mehr als die Körperlänge ist, sollten einen Kontakt über sein. Für ein Replikat, Rekord P als 100%, wenn der Kopulation is beobachtet unmittelbar nach dem ersten Kontakt, ohne Pause, oder 0,00%, wenn keine Kopulation beobachtet wurde oder wenn es Kopulation aber nach zwei oder mehrere Kontakte. HINWEIS: Es wurden 30 Wiederholungen für jede Kombination hier beschrieben. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Verhaltenstests sind ein grundlegender Aspekt der chemischen Ökologie, Neurobiologie, Molekularbiologie und Genetik. Nematoden und insbesondere C. elegans, sind für ein Studium in diesen Bereichen intensiv genutzt. Das Paarungsverhalten von C. elegans wurde zuvor 10-11 untersucht. Allerdings ist B. xylophilus gonochoristic und unterscheidet sich von den Zwitter C. elegans und seine Paarung hat verschiedene Verhaltensmerkmale 9. Vor kurzem wurde das Paarungsverhalten von Bursaphelenchus okinawaensis, Zwitter - Schwesterarten von B. xylophilus, 12 berichtet. Obwohl verschiedene experimentelle Methoden verwendet wurden, zeigten diese Zwitter Spezies ähnlich Geschlecht Attraktion B. xylophilus, und Interspezies-Anziehung zwischen ihnen beobachtet. Diese Zwitterschwesterarten könnten als Modell verwendet werden , weitere Untersuchungen über die Biologie von Bursaphelenchus zu führen. Dieses Protokoll bietet einen Leitfaden, wie Sie die Verhaltensmerkmale von B. zu beobachten und zu untersuchen xylophilus während der Paarung. Unsere Ergebnisse zeigten , dass virgin erwachsenen Nematoden unter Verwendung kritisch ist die Wahrscheinlichkeit erfolgreich zur Erhöhung des Paarungsprozesses (Abbildung 1) beobachten. J4 Larven Gewinnung und genau zu unterscheiden, ihre Geschlechter sind zwei wichtige Grundschritte für den Erwerb von nativem Erwachsene. Unter unseren experimentellen Bedingungen (dh bei 25 ° C im Dunkeln), die Dauer von 52 h ist die richtige Zeit von J4 J2 Larven zu erhalten. Doch am frühen J4 Stadium unterscheiden Sex hängt vor allem von persönlichen Erfahrungen. Um die Genauigkeit ist es notwendig, für verschiedene Menschen nochmals zu überprüfen, das Geschlecht Zuweisung. Die Verhaltensmerkmale B. xylophilus während des Paarungsprozesses kann qualitativ und quantitativ durch Aufzeichnung der Dauern der vier analysierten beschrieben abweichender Prozentsatz der Paarungserfolg nach dem ersten Kontakt, der Kopulation Frequenz und die Dauer der Kopulation von verschiedenen Kombinationen ent Phasen. Interessanterweise zum ersten Mal beobachteten wir passende Wahl von Frauen und starke inner sexuellen Wettbewerb in beiden Männern und Frauen. Keine Promiskuität wurde beobachtet; Dies könnte jedoch in unserer Untersuchung verwendet, um die begrenzte Anzahl von Nematoden fällig. Dieses Protokoll kann nicht nur für die Untersuchung der Paarungsverhalten von B. xylophilus verwendet werden, aber es kann auch als Referenz für andere Nematoden nützlich und wertvoll sein.

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity. 
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;B. xylophilus&lt;/em&gt; isolate &lt;em&gt;Nxy61&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Extracted from &lt;em&gt;Pinus massoniana&lt;/em&gt; in Ningbo area of China</td></tr><tr><td>Grey mold strain</td><td></td><td></td><td>Obtained from Forestry Academy of China</td></tr><tr><td>Baermann funnels</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon tubes</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterile dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>Sterilized by high pressure of steam at 121 &amp;deg;C for 30 min.</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA medium</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass capillary</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>inverted stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>concave slides</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

Ein Verfahren zur Beobachtung und das Paarungsverhalten des Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus Quantifizierung wurde unter einem Stereomikroskop etabliert. Um die Paarungseffizienz von B. Xylophilus verbessern und die Chancen der Paarung Beobachtung zu erhöhen, waren virgin Erwachsene kultiviert und verwendet für die Untersuchung. Die Eier wurden, indem sie die Nematoden in Wasser erhalten und damit die Weibchen für 10 min Eier zu legen. Die zweite Stufe Jugendliche (J2) wurden im Dunkeln, und die frühe J4 erhalten wurden bei 25 ° C für 24 h durch Inkubation der Eier synchronisiert durch die J2 Kultivierung mit Grauschimmel Botrytis cinerea, für eine weitere 52 h. Zu diesem Zeitpunkt konnten die meisten J4 Nematoden klar unterschieden werden als männlich oder weiblich ist, ihre Genital Morphologie verwendet wird. Die männlichen und weiblichen J4 wurden gesammelt und kultiviert getrennt in zwei verschiedenen Petrischalen für 24 h virgin erwachsenen Nematoden zu bekommen. Eine Jungfrau männliche und eine jungfräuliche Weibchen wurden in einem Tropfen wat gepaarter in die Vertiefung einer konkaven Folie. Das Paarungsverhalten wurde mit einem Videorecorder unter einem Stereomikroskop gefilmt. Die ganze Periode des Paarungsprozesses war 82,8 ± 3,91 min (Mittelwert ± SE) und konnte in 4 verschiedene Phasen unterteilt werden: die Suche, Kontaktaufnahme, Kopulation und lang anhaltend. Die mittleren Minuten Dauer waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 und 7,2 ± 0,5. Elf Unter Verhaltensweisen wurden beschrieben: kreuzen, nähern, begegnen, berühren, hooping, Ortung, Befestigung, ejakulieren, trennen, quiescence und Roaming. Interessanterweise offensichtlich intra sexuellen Wettbewerb wurde beobachtet, wenn ein Weibchen mit 3 Männchen oder ein Männchen mit drei Frauen gruppiert wurde. Dieses Protokoll ist nützlich und wertvoll, nicht nur das Paarungsverhalten von B. xylophilus bei der Untersuchung, sondern auch als Referenz für ethologischer Studien anderer Nematoden in wirken.

Die Paarungserfolgsrate (R) von nativem Erwachsenen war 86,67% im Durchschnitt, was die deutlich höher war als der zufällig ausgewählten Erwachsenen: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Abbildung 2). Dieser Befund legt nahe , dass es einfacher ist , das Paarungsverhalten von B. xylophilus mit nativem Erwachsenen als bei zufällig ausgewählten Erwachsenen zu beobachten. Wenn ein Männchen mit einem Weibchen gepaart wurde, dauerte die gesamte Paarung 82,8 min im Durchschnitt. Der gesamte Prozess könnte durch vier verschiedene Phasen beschrieben werden: die Suche, Kontaktaufnahme, Kopulation und lang anhaltend. Die Dauer für diese vier Phasen waren 21,8 ± 2,0 min, 28,0 ± 1,9 min, 25,8 ± 0,7 min und 7,2 ± 0,5 min (Abbildung 3). In einer kürzlich erschienenen Publikation beschrieben wir die 11 Unter Verhaltensweisen wie Kreuzen, nähern, encountering, berühren, hooping, Ortung, Befestigung, ejakulieren, trennen, quiescence und Roaming - 9. Wenn ein Männchen erfüllt zwei oder mehr Weibchen gleichzeitig schien die männlichen zufällig zu paaren mit einem von ihnen, ohne Selektion. Es wurde jedoch offensichtlich Paarung Wahl für weibliche B. xylophilus beobachtet. Wenn eine Frau, die einen männlichen Kontakt, neigten die Weibchen das Männchen Kopf, Körper, Schwanz und Genitalbereich sanft mit dem Kopf zu berühren und erschien ihr potentieller Partner zu evaluieren. Wenn die Frau nicht das männliche akzeptieren, verließ die Frau ihn schnell und schwamm für die nächste Auswertung zu einem anderen Mann. Einer der Männchen zur Paarung wurde dann durch das weibliche ausgewählt. Mating Erfolgsraten nach dem ersten Kontakt (P) von der 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂ Kombinationen waren 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4% und 23,4 ± 7,4% bzw. und die Unterschiede zwischen ihnen were signifikant (F = 8.21, df = 2, P = 0,0124) (Abbildung 4). Intra Wettbewerb wurde in beiden Männchen und Weibchen beobachtet. Wenn eine jungfräuliche Weibchen mit 3 Jungfrau Männer gemischt wurde, versuchten die Männchen das Weibchen so viel wie möglich zu nähern und kontaktieren Sie die Chance, mit ihrer Paarung zu bekommen. Wenn der Vulva durch ein Männchen besetzt war, versuchten die anderen Männchen durch die Verwendung heftigen Körper schwingt die Paarung Männchen zu stören oder zu ziehen, sie zu trennen. Weiblich intra Wettbewerb wurde gesehen mehr oder weniger ähnlich wie männliche intra Wettbewerb zu sein. Paarungserfolg vor allem auf die weibliche abhing. Wenn eine Frau, die einen männlichen akzeptiert, zog der Mann langsamer und gewellt oder gebildet sogar einen Reifen, und das Weibchen nach vorne bewegt, sich aktiv für die es leichter machen das Männchen ihre Vulva zu lokalisieren und zu Störungen von anderen Männchen zu vermeiden. Wenn eine Frau nicht akzeptieren, einen männlichen,die Frau versuchte, ihn abzuschütteln, auch wenn das Männchen bestiegen hatte und positioniert sich durch ihre Vulva. Aufgrund der intra Wettbewerbs Kopulation Frequenzen des 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂ Kombinationen waren 1,43 ± 0,091 1,17 ± 0,074 und 1,83 ± 0,074, bzw., und die Unterschiede zwischen ihnen waren signifikant (F = 14,50, df = 2, P = 0,0001) (Abbildung 5). In unserer Untersuchung variierte die Dauer der Kopulation mit einem Minimum von 20 s und maximal 42 min stark. Kurzzeit-Paarungen, die weniger als 5 min dauerte, und langfristige Paarungen, die länger als 10 min dauerte: Nach unseren Daten könnte die Dauer der Kopulation offensichtlich in zwei Gruppen unterschieden werden. Offensichtliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen für die durchschnittliche Dauer der kurzfristigen Kopulation (F = 3,81, df = 2, P beobachtet </em&gt; = 0,0296), langfristige Kopulation (F = 179.52, df = 2, P = 0,0001), und alle Paarungen (F = 2.93, df = 2, P = 0,0367) (Abbildung 6). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig1.jpg" /> Abbildung 1: Genitalien von männlichen und weiblichen B. Xylophilus. (A) spicule der männlichen (blauer Pfeil). (B) Vulva der weiblichen (roter Pfeil). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig2.jpg" /> Abbildung 2: Mating Erfolgsrate von Virgin für erwachsene Paare und Randomly Ausgewählte für erwachsene Paare von B. xylophilus. Die berechneten Mittelwerte aus 30 Wiederholungen. Der vertikale Balken zeigens der Standardfehler. Die verschiedenen Kleinbuchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P &lt;0,05, wenn sie von Tukey-Test verglichen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig3.jpg" /> Abbildung 3: Dauer der 4 Phasen in der Paarung von B. xylophilus. Die berechneten Mittelwerte aus 30 Wiederholungen. Der vertikale Balken zeigt den Standardfehler. Die verschiedenen Kleinbuchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P &lt;0,05, wenn sie von Tukey-Test verglichen. Die durchschnittliche Dauer der kopulierenden Phase ist 25,80 ± 0,71 min, was 31,17% des gesamten Paarung ist. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieses Bild zu sehen</a>ure. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig4.jpg" /> Abbildung 4: Paarungserfolg für den ersten Kontakt von B. xylophilus. Die berechneten Mittelwerte aus 30 Wiederholungen ± SE. Mittel mit demselben Kleinbuchstaben in jeder Spalte sind nicht signifikant verschieden bei P &lt;0,05, wenn sie von Tukey-Ehrlich signifikanten Unterschied Test verglichen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig5.jpg" /> Abbildung 5: Kopulation Häufigkeit von B. xylophilus in verschiedenen Gruppen. Die berechneten Mittelwerte aus 30 Wiederholungen ± SE. Mittel mit demselben Kleinbuchstaben unterscheiden sich nicht signifikant bei p &lt;0,05 als compared durch Test Tukey-Ehrlich signifikanten Unterschied. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig6.jpg" /> Abbildung 6: Kopulation Dauer von B. xylophilus. Mittel mit demselben Kleinbuchstaben innerhalb jeder Gruppe von Spalten unterscheiden sich nicht signifikant bei p &lt;0,05, wenn sie von Tukey-Ehrlich signifikanten Unterschied Test verglichen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

9.3K Aufrufe.  Zhejiang Agricultural & Forestry University. A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Serie: Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Eine nichtinvasive Methode zur<em&gt; In situ</em&gt; Bestimmung des Gegen Erfolg im Frauen amerikanischen Hummer (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Forschung

Umwelt

Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify the pollination effectiveness of each pollinator for visited flowers. Pollinator observations have been one of the most common methods to identify pollinators, and bagging and cage experiments have been conducted to show the effectiveness of specific pollinators. In a previous study of Lycoris sanguinea var. sanguinea, its effective pollinators, the visitation frequencies of each floral visitor, and its reproductive strategies were not identified. This study reports the observation that small bees visited flowers that were partially opened (breaking buds). To the best of our knowledge, this phenomenon has not been reported previously. Further, this study investigates the hypothesis that small bees can pollinate at that flowering stage. This study demonstrates the basic methods of field experiments in pollination ecology using L. sanguinea var. sanguinea. Pollinator observations and digital video showed the visitation frequencies of each floral visitor. Bagging and cage experiments revealed that these flowers could be pollinated fully and that breaking-bud pollination could be important for the pollination of this plant species. The advantages and disadvantages of each method are discussed, and recent developments, including laboratory experiments, are described.

Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

To reveal the pollinator effectiveness of a given plant species, multiple methods of field experiments have been developed. This study demonstrates the basic methods of field experiments for pollination ecology using the case study of Lycoris sanguinea var. sanguinea and the novel pollination mechanism, breaking-bud pollination.

Feldexperimente von Bestäubungsökologie: Der Fall<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify ...

Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi

The genetic and molecular components of the sex-determination cascade have been extensively studied in the honeybee, Apis mellifera, a hymenopteran model organism. However, little is known about the sex-determination mechanisms found in other non-model hymenopteran taxa, such as ants. Because of the complex nature of the life cycles that have evolved in hymenopteran species, it is difficult to maintain and conduct experimental crosses between these organisms in the laboratory. Here, we describe the methods for conducting inbreeding crosses and for evaluating the success of those crosses in ant Vollenhovia emeryi. Inducing inbreeding in the laboratory using V. emeryi, is relatively simple because of the unique biology of the species. Specifically, this species produces androgenetic males, and female reproductives exhibit wing polymorphism, which simplifies identification of the phenotypes in genetic crosses. In addition, evaluating the success of inbreeding is straightforward as males can be produced continuously by inbreeding crosses, while normal males only appear during a well-defined reproductive season in the field. Our protocol allow for using V. emeryi as a model to investigate the genetic and molecular basis of the sex determination system in ant species.

Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi

In this protocol, methods for conducting inbreeding crosses, and for evaluating the success of those crosses, are described for the ant Vollenhovia emeryi. These protocols are important for experiments aimed at understanding the genetic basis of sex determination systems in Hymenoptera.

Induktion und Bewertung von Inzucht Kreuze mit Ant, Vollenhovia Emeryi

The genetic and molecular components of the sex-determination cascade have been extensively studied in the honeybee, Apis mellifera, a hymenopteran model ...

Genetik

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors remains poorly understood. In Drosophila melanogaster, environmental cues, such as food availability, affect mating activity offering a tractable system to investigate the mechanisms modulating sexual behavior. In D. melanogaster, environmental cues are often sensed via the chemosensory gustatory and olfactory systems. Here, we present a method to test the effect of environmental chemical cues on mating behavior. The assay consists of a small mating arena containing food medium and a mating couple. The mating frequency for each couple is continuously monitored for 24 h. Here we present the applicability of this assay to test environmental compounds from an external source through a pressurized air system as well as manipulation of the environmental components directly in the mating arena. The use of a pressurized air system is especially useful to test the effect of very volatile compounds, while manipulating components directly in the mating arena can be of value to ascertain a compound's presence. This assay can be adapted to answer questions about the influence of genetic and environmental cues on mating behavior and fecundity as well as other male and female reproductive behaviors.

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

We demonstrate an assay to analyze the environmental and genetic cues that influence mating behavior in the fruit fly Drosophila melanogaster.

Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

Verhalten

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a potential mate to form a pair. While this phenomenon has attracted interest of researchers, methods for its analysis have not been well described. Here we describe procedures for: 1) individual culturing and staging of Tigriopus juveniles and adults, and 2) video-based analysis of their mate-guarding behavior. The culturing method enables experimental control of paring experience of animals as well as the ability to track their development before behavioral tests. The analysis method allows quantitative evaluation of several aspects of the mate-guarding behavior, including capturing attempts by males and swimming trajectory of mate-guarding pairs. Although these methods were originally established for ethological studies on Tigriopus, with proper modifications they can also be applied to studies of other zooplankton in different research fields, such as physiology, toxicology, and ecological genetics.

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Mate-guarding behavior plays an important role in reproduction of intertidal copepods of the genus Tigriopus. However, methods for studying this behavior have not been well described. Here we describe methods for: 1) individual culture of virgin Tigriopus animals, and 2) quantitative analysis of their mate-guarding behavior.

Individuelle Kultivierung von Copepoden Tigriopus und Quantitative Analyse ihres Verhaltens Mate-Bewachung

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neurowissenschaften

Dissektion zur Identifizierung wandernder Insekten mittels ovarieller Reproduktionsanalyse

Dissection and Grading of Ovarian Development in Wild-Type Female Insects

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using searchlight traps. One of the most important techniques for migratory pest forecasting is to identify the migratory species. However, in most cases, it is difficult to get the information just by appearance. Therefore, using knowledge acquired by systematic analysis of the female reproductive system can help to understand the combined anatomic morphology of the ovarian mating sac and ovary developmental grading of wild-type migratory insects captured with searchlight traps. To demonstrate the applicability of this method, ovarian development status and egg grain development stages were directly assessed in Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura, and Spodoptera exigua for the ovarian anatomy, and the ovarian mating sacs were studied in Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae, and Spodoptera exigua, to explore their relationships. This work shows the specific dissection method to predict wild-type migratory insects, comparing the unique reproductive system of different migratory insects. Then, both tissues, namely, the ovary and mating sacs, were further investigated. This method helps to predict the dynamics and the structural development of reproductive systems in wild-type female migratory insects.

Autor im Rampenlicht: Analyse der Anatomie der Eierstöcke bei wandernden Insekten zur Bewältigung experimenteller Herausforderungen 

The protocol demonstrates a simple and easy dissection method, suitable for wild-type migratory female insects captured with searchlight traps. This technique can significantly clarify the same species by comparing both reproductive tissues, namely the mating sac and ovarian development of wild-type female insects.

Dissektion und Einstufung der Ovarialentwicklung bei weiblichen Wildtyp-Insekten

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode,

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Eine nichtinvasive Methode zur

Feldexperimente von Bestäubungsökologie: Der Fall

Induktion und Bewertung von Inzucht Kreuze mit Ant, Vollenhovia Emeryi

Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen

Individuelle Kultivierung von Copepoden Tigriopus und Quantitative Analyse ihres Verhaltens Mate-Bewachung

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Dissektion und Einstufung der Ovarialentwicklung bei weiblichen Wildtyp-Insekten

Dissektion und Einstufung der Ovarialentwicklung bei weiblichen Wildtyp-Insekten

Dissektion und Einstufung der Ovarialentwicklung bei weiblichen Wildtyp-Insekten

Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten