Name: studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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1. Zellpräparation <ol><li> Wachsende Zellen <ol><li> Wachsen D. discoideum Zellen in AX - Medium bei 23 ° C unter Licht in Gewebekulturplatten. Vermeiden Sie Zellen in hoher Dichte über 75% Konfluenz zu halten. Hinweis: Für eine optimale Reaktion auf Hitzestress, müssen Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase zu sein und nicht die stationäre Phase erreicht haben sollte. </li><li> Am Tag vor der Bildgebung, aufgeteilt Zellen in niedrige Fluoreszenzmedium (LFM) bis 1 x 10 4 Zellen / ml. HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, durch die AX Medium verursachte Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Die Inkubationszeit kann auf ein Minimum von 2 Stunden reduziert werden. Doch in AX-Medium aufgenommen Bläschen können noch einige Hintergrundsignal nach 2 h erzeugen. </li></ol></li><li> Vorbereitung Zellen für die Mikroskopie <ol><li> Vor Bildgebung, Ernten der Zellen aus dem Gewebeplatte in LFM und übertragen eine ausreichende Anzahl von Zellen in Glasbodenschalen. HINWEIS: In der Regel,1 x 10 5 Zellen / ml reicht; Wenn jedoch die Versuchsaufbau lange Abbildungsperioden (mehr als 8 h) erfordert, müssen die Zellzahlen sorgfältig eingestellt werden, wie D. discoideum Zellen werden dem Entwicklungszyklus übergehen und beginnen zu streamen und zu aggregieren , wenn die Zellzahlen hoch sind , während Nährstoffe niedrig sind. </li><li> Lassen Sie die Zellen für 20 min absetzen. Entfernen Sie nicht abgesetzten Zellen durch vorsichtiges das verwendete Medium durch frisches Medium ersetzt. </li></ol></li></ol> 2. Imaging HINWEIS: sowie in der konfokalen Mikroskopie-Setups Das Protokoll kann auf Weitfeld-Systemen verwendet werden. Die Verwendung eines temperaturgesteuerten Inkubation Box in denen die Ziele und den Mikroskoptisch ist hilfreich, aber nicht unbedingt notwendig für die Temperaturregelung. Die Temperatur der Inkubation Kasten wird auf die höchste Temperatur in dem Experiment verwendet gesetzt, beispielsweise auf 40 ° C , wenn Wärmespannung durchgeführt wird. Andernfalls wird die Temperatur auf 25 eingestellt6; C. Temperaturänderungen sollten im Voraus erfolgen, damit das System anzupassen, wie Veränderungen in der Temperatur während der Abbildung des Fokus beeinflussen können. HINWEIS: Während der Bilderzeugung wird die Temperatur gesteuert, um eine Kühlkammer verwendet wird. Die Standardtemperatur für die Bildgebung nicht gestressten Zellen beträgt 23 ° C. Für die Wärmebelastungsbedingungen wird die Temperatur entsprechend auf das gewünschte Niveau erhöht. Das Piezoelement in der Kühlkammer kann sehr schnell auf die Temperaturverschiebung reagieren. Allerdings wird der Fokus der Bilder leicht ändern (es auf bis zu 20 &amp; mgr; m in Abhängigkeit von der Temperaturverschiebung kann abweichen). Somit manuelle Refokussierung wird innerhalb der ersten Minuten der Bildaufnahme erforderlich ist, es sei denn, das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist. <ol><li> Bildaufnahme unter unbelasteten Bedingungen <ol><li> Bildzellen unter unbelasteten Bedingungen bei 23 ° C, mindestens 6 Sichtfelder (FOVs) erwerben. HINWEIS: Nicht-Spannungszustand kann visualized entweder durch eine kurze Time-Lapse (5-30 min) oder dem Erwerb von repräsentativen Standbilder aufnehmen. Für jede Bedingung oder Zelllinie ein Minimum von 6 Sichtfelder (FOVs) erwerben. HINWEIS: Sollten einzelne Zellen von Interesse sind, positionieren Sie die entsprechenden Zellen in der Mitte des FOV und eine 3 x 3 Fliesenserie mit dem FOV notieren Sie die Zellen von Interesse in der Mitte enthält , D.. discoideum Zellen sind frei beweglich und kann aus dem FOV migrieren. Jedoch erhöht die 3 x 3 Fliesenserie den Bereich möglicherweise durch die Zelle von Interesse untersucht und es bleibt nachvollziehbar für Zeitraffer-Perioden von ~ 6 Stunden. </li><li> Erwerben z-Stapel von höchstens 7 &amp; mgr; m in 1 bis 0,25 &amp; mgr; m vor, um das gesamte Volumen der Zelle zu erfassen. </li><li> Erwerben Bild eines Referenzhellfeld die Gesamtzahl der Zellen zu beurteilen. </li></ol></li><li> Bildaufnahme für Hitzestress <ol><li> Die Temperatur der Kühlkammer auf 30 ° C gemäß den Anweisungen des Herstellers. &lt;/ Li&gt; <li> Nachdem die Temperaturanzeige den gewünschten Wert ein, neu auszurichten manuell im Hellfeldkanal und überprüfen Sie alle aufgezeichneten FOVs vor dem Start des Zeitraffer erreicht hat. </li><li> Starten Sie eine Zeitraffer 4 Stunden von Hitzestress mit einem Zeitintervall von 5-10 Minuten zwischen den Zeitpunkten. Überprüfen Sie die korrekte während der Erfassung der ersten beiden Zeitpunkte zu konzentrieren. </li></ol></li><li> Bildaufnahme während der Wiederherstellung <ol><li> Nach dem Hitzestress zu reduzieren für die Temperaturanzeige auf 23 ° C, warten, bis die Temperatur wieder manuell anzupassen und neu auszurichten. </li><li> Nehmen Sie Zeitrafferfilme in der Erholungsphase für 8-10 Stunden in 10-20 Minuten Zeitintervallen. Überprüfen Sie die korrekte während der Erfassung des ersten Zeitpunkt zu konzentrieren. </li></ol></li></ol> 3. Bildanalyse ANMERKUNG: Um die Anzahl der Zellen beherbergen cytosolischen Foci, Beurteilung der Gesamtzahl der Zellen und die Anzahl der Zellen mit cytosolischen Foci in jedem Zeit quantifizierenRahmen. Aufgrund der Schwierigkeit von Zellen aus Hellfeld- Bilder Segmentieren, muss die Quantifizierung manuell durchgeführt werden. Im Folgenden wird die Datenanalyse für die freie Bildverarbeitungspaket beschrieben ((http://fiji.sc/Fiji). Es erfordert das Plugin &quot;Zellzähler&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Beurteilung der Gesamtzahl der Zellen <ol><li> Legen Sie das Hellfeld-Bildstapel (XYT), indem Sie auf &quot;Datei&quot; und &quot;Öffnen&quot;. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Zellzähler&quot; Plugin ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Zellzähler&quot;). Laden Sie das Bild Stapel von &quot;initialisieren&quot; klicken. </li><li> Wählen Sie die geeignete Art von Zählern durch Ankreuzen des entsprechenden Kästchens. Hinweis: Verwenden Sie Typ 1 als Zähler für die Gesamtzahl der Zellen und Typ 2 als Zähler für Zellen, die mit zytosolischen Brennpunkte. Zählen Sie alle Zellen. </li><li> Speichern Sie die Markierungen, indem Sie auf &quot;Save Markers&quot;. </li></ol></li><li> Die Beurteilung der Anzahl der Zellen mit zytosolischen Brennpunkte <ol> &lt;li&gt; Legen Sie das Fluoreszenzbild Hyperstack (XZYT) ( &quot;Datei&quot; - &quot;Open&quot;) und eine maximale Intensitätsprojektion der &quot;Z-Projector&quot; (Bild / Stacks) mit machen. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Zellzähler&quot; Plugin. Legen Sie das resultierende Bildstapel (XYT), indem Sie auf &quot;initialisieren&quot;. </li><li> Legen Sie die Markierungen, indem Sie auf &quot;Load Marker&quot;. ACHTUNG: Die Dateinamen des Referenzbildes und der Fluoreszenz-Stack müssen identisch sein. Benennen Sie gegebenenfalls entsprechend vor dem Bildstapel initialisiert. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden Marker-Typ (siehe 3.1.3) und Zellen mit zytosolischen Brennpunkten zählen. Die bestehenden Marker können als Richtlinien für die Lage einzelner Zellen verwendet werden. </li><li> Rufen Sie die Anzahl der Zählungen pro Scheibe durch einen Klick auf &quot;Ergebnisse&quot; und die Zählungen an anderer Stelle für weitere Berechnungen zu speichern. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das hier beschriebene Protokoll kann das Verhalten eines bestimmten Proteins von Interesse in Reaktion auf die wärmeinduzierten Belastungen Studie verwendet werden. Temperaturerhöhung auf 30 ° C wurde berichtet Wärmebelastungsantwort auszulösen , und unter diesen Bedingungen die Lebensfähigkeit von D. discoideum ist deutlich reduziert. Änderungen Das Protokoll kann modifiziert werden, um das Verhalten verschiedener Proteine ​​unter den gleichen Belastungsbedingungen zu vergleichen. Dazu verschiedene Proteine ​​mit dem gleichen Fluoreszenzmarker exprimierenden Zellen werden in Multi-Well-Platten transferiert, wie vier Kammerschalen (Abschnitt 1.3.1). Das Protokoll kann auch auf Zellen co-exprimierenden Proteine ​​mit verschiedenen Markern, wie GFP oder RFP angewendet werden. Dies kann beispielsweise verwendet, um das Verhalten verschiedener Komponenten der Proteinqualitätskontrolle (PQC) System überwachen. Zellen, die GFP-markierten Aggregation Marker und andere RFP-markierte PCQ Komponenten exprimieren, können unter Verwendung von Multi-Well beobachtet werdenKlöpper für die Bildgebung. Dies gewährleistet den gleichen Belastungsbedingungen (Geschwindigkeit der Temperaturzunahme / abnahme, der Dauer der Temperaturerhöhung / Verringerung) und ermöglicht eine vergleichende Studien. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um den Einfluss des PQC System auf der Wärmebelastungsantwort zu untersuchen. Die Aktivität der Komponenten kann durch Ändern Expressionsniveaus unter Verwendung von genetischen Werkzeugen wie knock-out oder Überexpression oder durch Verwendung von handelsüblichen spezifische Inhibitoren 6 moduliert werden. Das Proteasom kann durch Zugabe von MG132 (100 uM) oder Lactacystin (10 uM) zu dem Wachstumsmedium inhibiert werden. Das Chaperon Hsp90 kann verhindert werden, indem Geldanamycin (6 uM) oder Radicicol (10 &amp; mgr; M). Das Chaperon Hsp70 kann mit VER-155088 gehemmt werden, obwohl wir nicht die Wirksamkeit der Hemmung in unserer experimentellen Einstellungen bestätigen konnten bisher. Inhibitoren sollten 14 Stunden einen Tag vor der Bildgebung und die Zellen werden inkubiert werden. Criti<html> cal Schritte im Rahmen des Protokolls Der entscheidende Schritt für die Beurteilung der wärmeinduzierte Störung ist der Zustand der Zellen vor dem Bildgebungsexperiment. Studien in Hefe zeigten , dass Zellen Resistenz gegen eine Vielzahl von Umwelteinflüssen während der stationären Phase 13 erwerben. Wir beobachteten auch minimale Reaktion auf angelegte Wärme Stress , wenn D. discoideum Zellen hatten stationäre Phase erreicht vor der Bildgebung. Um daher eine konstante Zellzahl aufrechterhalten &lt;5 x 10 5 Zellen / ml ist kritisch. Darüber hinaus können hohe Zellzahlen Übergang vom vegetativen Zyklus von D. induzieren discoideum auf den Entwicklungszyklus, so auslösenden Verhungern Wege, die zu einer anderen Antwort führen könnte Stress zu erwärmen. Bei hohen Zellzahlen in der Erholungsphase nach der Hitzebelastung erreicht werden, Streaming und Aggregation - Zellen können mit der Datenanalyse stören , da die Zellen aus dem Fokus zu bewegen (siehe Abbildung 4). Inhalt &quot;&gt; Einschränkung der Technik Der Verlust des Fokus ist der Engpass des Protokolls. Bei Temperaturänderungen kann die Brennebene drastisch Verschiebung, die in einer Zeitperiode manuelle Refokussierung erfordert unmittelbar nach der Änderung der Temperatur. Der Sprung in der Fokus kann manchmal zu extrem sein durch Software Autofokus zu überwinden, insbesondere, wenn die Zeit zwischen den Zeitpunkten hoch ist. Wenn jedoch das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist, kann dieser Engpass umgangen werden. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende Methoden Im Vergleich zu bestehenden Aufbauten wie beispielsweise die Verwendung von klimatisierten Räumen, temperaturgesteuerte Inkubation Kästen in denen die Ziele und die Mikroskoptisch oder temperaturgesteuerten Bühnen und objektive Krägen stellt die Verwendung einer Kühlkammer, die eine genauere Steuerung der Umgebungs Temperatur. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann eine konstante und gleichmäßige tem aufrechtzuerhaltenperatur während des gesamten Versuchsaufbau. In der klassischen Setups können lokale Temperaturunterschiede zu unterschiedlichen Beobachtungs Ergebnissen führen. Darüber hinaus kann es schnell und rasch auf induzierte Änderungen in der Temperatur reagieren, während klassische Setups sehr langsam induzierte Temperaturänderungen anzupassen, insbesondere um die Temperatur zu senken. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann auch einen breiteren Temperaturbereich (15-40 ° C) als die klassischen Konfigurationen umfassen, mit dem Erreichen Temperaturen, wie 15 ° C oder 40 ° C ist sehr schwierig. Dictyostelium discoideum ist besonders empfindlich gegenüber Phototoxizität. Frühere Studien Ascorbat als Fänger verwendet Phototoxizität zu reduzieren. Jedoch erfordern lange Bildgebungszeiten zusätzliche Ergänzung. Außerdem wird die Verwendung von Ascorbat auf Studien beschränkt, in dem der Mechanismus von Interesse nicht durch die Antioxidansergänzung beeinflusst wird. Wir schlagen vor, dass temperaturgesteuerte Bildgebung kann alternativ ca. verwendet werdenoach Phototoxizität zu minimieren und könnte unter Zugabe von Ascorbat kombiniert werden, um die Toxizität zu verringern. Phototoxische Effekte können durch die Bereitstellung einer konstanten und gleichförmigen Temperatur von 23 ° C unter Verwendung einer Kühlkammer minimiert werden. Die Zellen mit Temperaturkontrolle abgebildet zeigen weniger Anzeichen von Phototoxizität, wie Zellabrundung, für einen längeren Zeitraum. Dies ermöglicht auch Bildgebung mit höheren Intensitäten, kleinere Zeitintervalle oder mehr Sichtfelder (FOVs). Allgemeine Anwendung Hitzestress bei höheren Temperaturen wurde eine unterschiedliche Wärmestressantwort 14 auszulösen gezeigt. Daher könnte eine andere Antwort induzieren, die Temperatur auf 34 ° C oder 37 ° C erhöht. Neben der Temperaturbelastung angelegt wird, kann die Dauer eines bestimmten Belastungssituation modifiziert werden, um die unmittelbare Reaktion oder langfristige Anpassung an Stress studieren zu beheizen. In der Regel kann das beschriebene Protokoll seinauf ein breites Spektrum von Anwendungen erweitert. Da die präzise Temperaturregelung erheblich phototoxische Effekte reduziert, kann das Protokoll in den Einstellungen verwendet werden , die eine hohe Belichtungszeiten erfordern und / oder höhere Anregungslichtintensitäten, beispielsweise für Proteine mit einem niedrigen Expressionsniveau zu visualisieren, oder in Kombination mit kurzen Zeitintervallen zwischen Bildgebung, zum Beispiel während Zeitraffer-Bildgebung. Es kann auch für die Abbildung der gesamten Zelle, zB Mikrotubuli, da diese Einstellungen erfordern eine hohe Anzahl von optischen z-Abschnitte Spanning Objekte vorteilhaft sein.

Dictyostelium discoideum sind Einzelgänger Boden lebenden Amöben , die auf Bakterien und anderen Mikroorganismen ernähren, die durch Phagozytose aufgenommen werden. Es hat eine einzigartige und bemerkenswerte Lebenszyklus , die einen großen Bereich der Forschung seit seiner Entdeckung 1 gewesen ist. Das frühe Interesse an der vielzelligen Entwicklung 2 und die molekularen Grundlagen der Chemotaxis 3 wurde bald durch Studien ergänzt mit Schwerpunkt auf der Zellbeweglichkeit, Zellpolarität, angeborene Immunität. Zusätzlich D. discoideum wurde als Modellsystem für die biomedizinische Forschung 4,5 eingeführt. Vor kurzem haben wir D. discoideum als ein neues System , das Protein Qualitätskontrolle (PQC) System 6,7 zu studieren. Seine Proteom ist in aggregationsanfälligen Prion-ähnliche Proteine angereichert, die 8 eine Herausforderung für die Proteinqualitätskontrolle darstellt. Um zu untersuchen , ob D. discoideum hat spezielle molekulare Mechanismen entwickelt , seine zur Steuerung hoch aggregation anfällige Proteom, untersuchten wir das Verhalten der Aggregation neigende Proteine ​​Marker sowohl unter normalen Wachstumsbedingungen und bei Stress. Stressbedingungen, wie Wärmebeanspruchung kann die Rate der Protein misfolding 9 zu erhöhen verwendet werden. Deshalb haben wir versucht, ein System, wo wir Temperaturänderungen auslösen können und gleichzeitig das Verhalten von Markerproteinen folgen. Zu diesem Zweck kombiniert, wir Abbildung lebender Zellen mit Peltier-gesteuerte Erwärmung eine thermische Stufe Einsatz (Kühlkammer) verwendet wird. Diese Methode erlaubt uns eine konstante und gleichmäßige Temperatur sowie zur Aufrechterhaltung einer schnellen, aber dennoch präzise Temperaturänderung zu induzieren. Bildgebung lebender Zellen verwendet , um eine Vielzahl von biologischen Prozessen in D. zu studieren discoideum. Allerdings steht dieser Ansatz zwei wichtige Einschränkungen. Zunächst werden die Zellen, die eine hohe Beweglichkeit anzuzeigen und neigen aus dem Sichtfeld zu wandern, wodurch einzelne Zellen verfolgen, erfordert oft Bildgebung einer großen Fläche. Die Mobilitätszelle kannvon Agar - Overlay 10 jedoch verringert werden, sind diese Bedingungen für langfristige Bildgebung aufgrund einer Abnahme der Lebensfähigkeit nicht geeignet. Zweitens D. discoideum Zellen zeigen eine besonders hohe Empfindlichkeit gegenüber Phototoxizität, die 11 in Zellabrundung und mitotischen Arrest führt. Vorherige Protokolle adressiert dieses Problem durch Zugabe von Ascorbat als Radikalfänger und Reduzierung der Belichtungszeiten 12. Letzteres kann kritisch sein, wenn das Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird, und zeigt ein schwaches Fluoreszenzsignal. Die Autoren schlagen auch vor, entweder durch Abbilden in einem klimatisierten Raum oder durch Verwendung von temperaturgesteuerte Inkubation Kästen, um eine konstante Temperatur von 21 ° C zu schaffen , die das Ziel und den Mikroskoptisch 12 abzudecken. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit verbesserter Temperatursteuerung durch eine Kühlkammer unter Verwendung von auf 23 ° C eingestellt. Während der Abbildung unserer Set-up eine deutliche Steigerung der Beständigkeit gegen Phototoxizität. Eserlaubt die Verwendung von höheren Belichtungszeiten und höhere Anregungslichtintensitäten. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zeitraffer-Bildgebung, da die Zeitintervalle sorgfältig ausgewogen gegen die Anzahl der Positionen abgebildet werden müssen und der Belichtungszeit verwendet. Die Möglichkeit, die Anzahl der abgebildeten Positionen zu erhöhen, ermöglicht auch die Abdeckung eines breiten Abbildungsbereich und erleichtert die Verfolgung einzelner Zellen über einen längeren Zeitraum.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Das beschriebene Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden , um das Verhalten von aggregationsanfällig prion-ähnliche Proteine in der Amöbe D. Analyse discoideum während der Hitzestress. 1 zeigt die Verteilung von GFP-markiertem Polyglutamin - Protein - Q103 in Zellen , die unter normalen Wachstumsbedingungen (1A), nach 2 Stunden Wärmebelastung bei 30 ° C (1B) und nach 6 Stunden Stress Wiederherstellungs- und Wachstum bei normalen Wachstumsbedingungen (Abbildung 1C). Bei Temperaturerhöhung von 23 ° C bis 30 ° C, die Q103-GFP Marker verschmilzt aus einer diffusen Verteilung Strukturen punktiert. Nach dem Stressabbau und das Wachstum bei normaler Temperatur, lösen sich diese Strukturen. Die Umverteilung von Q103-GFP und die Bildung von Hitzestress induzierten cytosolischen Herde können Bildanalyse quantifiziert werden. 2A zeigt die Analyse einzelner FOVs mit Fiji und das Plugin &quot;Cell Zähler &quot;. 2B zeigt die Quantifizierung der Wärmestressantwort. Dies zeigt , dass die cytosolische Q103-GFP Brennpunkte Erhöhung der Zahl mit fortHitzeStress. Während Hitzestress, die Proteinqualitätskontrolle (PQC) System ist überwältigt, so Aggregations- neigen Proteine wie das Prion-like protein Q103 kann nicht in einem löslichen Zustand und zunehmend Aggregat in zytosolischen Foci aufrechterhalten werden. die Zellen auch eine charakteristische Rundungs zeigen, wie in 1B. die Reduktion der cytosolischen Foci nach Stress Entfernung dargestellt legt nahe , dass die aggregierte Proteine ​​werden gelöst. Die Abbildungsqualität ist empfindlich gegenüber der anfänglichen Zelldichte, Fig . 3 zeigt ein Beispiel für Zellen nach der Belastungswiederherstellung geeigneten Anfangszelldichte (3A) und eine hohe Anfangszelldichte (3B) zu vergleichen. Wenn die anfängliche Zelldichte zu hoch war, Sternzellented Ströme zu bilden , wie in 3b dargestellt. Diese, die Schwierigkeiten bei der nachfolgenden Quantifizierung wie die Zellen auferlegt sind aus der Brennebene bewegt. Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um temperaturbedingte Veränderungen zu überwachen, wie oben beschrieben. Es kann auch zu reduzieren Phototoxizität verwendet werden , wenn bei einem physiologischen Wachstumstemperatur Bildgebung. Abbildung 4 zeigt einen Vergleich der Zelle bei 23 ° C in einer Kühlkammer (4A) abgebildet und ohne Temperaturregelung in einem klimatisierten Raum abgebildeten Zellen, Set auf 25 ° C (4B). Bei konstanten Kontakt mit dem Anregungslicht runden Zellen, wenn sie nicht unter temperierten Bedingungen abgebildet. Diese Änderung in der Zellform anzeigt Stress. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Abbildung 1: <strong&gt; Aggregation neigende Prion-ähnliche Proteine verändern ihre zelluläre Verteilung während der Hitzestress. GFP-markierten polyglutamine reichen Huntingtin Exon 1 (Q103) konstitutiv in AX2-214 D. ausgedrückt discoideum Zellen (GFP - Signal in invertierten Graustufen - Nachschlagtabelle dargestellt). (A) Unter normalen Wachstumsbedingungen bei 23 ° C, Q103-GFP diffus im Cytoplasma verteilt. (B) Nach 2 Stunden von Hitzestress bei 30 ° C, Q103-GFP verschmilzt in zytosolischen Brennpunkte (rote Pfeile). Die Zellen zeigen eine charakteristische Formänderung und abrunden. (C) Nach dem Stressabbau und das Wachstum bei 23 ° C werden die cytosolische Brennpunkte gelöst. Nach 6 Stunden, kann keine cytosolische Foci beobachtet werden. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2: Quantifizierung der thermisch induzierten cytosolischen Foci - Bildung (A) Analyse von Zellen , die das freie Bildverarbeitungspaket Fiji und das Plugin &quot;Zellzähler&quot; verwendet wird .. Die Gesamtmenge an Zellen (Typ 1, blau Zähler Marker) in der Hellfeldbild bestimmt. Die Marker werden in der GFP-Kanal und die Anzahl der Zellen mit cytosolischen Foci (Typ 2, rot Zähler Marker) geladen wird bestimmt. (B) Quantifizierung der Brennpunkte nach 3 h Wärmebelastung bei 30 ° C und 3 Stunden von Stress Erholung bei 23 ° C (n = 4 Sichtfelder, Fehlerbalken = SD). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen Zahl.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Abbildung 3: Einfluss der Zelldichte auf Zellen , die bei anfänglichen Zelldichten &lt;10 5 Zellen / ml abgebildet Langzeit Zeitraffer-Bildgebung (A).. Nach 3 Stunden von Hitzestress bei 30 ° C und 6 Stunden von Stress Erholung bei 23 ° C, bleiben immer noch Zellen im vegetativen Zyklus und dividieren. Nur wenige Zellen, die die Brennebene verlassen. (B) Zellen , die bei anfänglichen Zelldichten&gt; 10 6 Zellen / ml abgebildet. Nach 9 h Bildgebung (Einstellungen wie in A), haben Zellen, die den Entwicklungszyklus eingegeben und gestartet Streaming und aggregiert werden. Zellen in den Aggregaten nicht eindeutig unterschieden werden kann. Ein großer Teil der Zellen tritt aus der Brennebene und nicht analysiert werden kann. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Abb . 4: Einfluss der Temperaturregelung auf phototoxische Effekte (A) Zellen abgebildet für 10 min mit Temperaturkontrolle bei 23 ° C: 6 Sichtfelder, z-Stapel (Abstand 0,5 uM, Probendicke 8 uM), Zeitraffer (Gesamt Zeit 10 min, Ablauf 1 min), GFP-Kanal (0,07 ms Belichtungszeit, 10% Laserintensität), RFP-Kanal (0,1 ms Belichtungszeit, 10% Laserintensität). Die Zellen zeigen keine Anzeichen der charakteristischen morphologischen Veränderungen mit phototoxischen Stress verbunden. (B) Zellen für 10 min ohne Temperatursteuerung (gleiche Bedingungen wie in A) abgebildet. Die Zellen Anzeichen einer phototoxischen induzierten Rundung aufweisen, Stress anzeigt. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. Die Zellen wurden auf einem System abgebildet basierend auf einem Mikroskop mit einem 100x / 1,4 numerische Apertur (NA) Ziel. Die Bilder wurden mit einer CCD-Kamera als 1.024 x 1.024 Pixel-Dateien unter Verwendung von 1 x 1 Binning gesammelt.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.2K Aufrufe.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Serie: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analyse der Actomyosin-Dynamik bei lokalen Zellstoff- und Gewebeskalen mit Zeitraffer-Filmen von kultivierten Drosophila-Eierkammern

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Überwachung der Proteinaggregationskinetik in vivo mittels automatisierter Einschlusszählung bei Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Biochemie

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Neurowissenschaften

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Biologie

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Eine flexible Kammer für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Biotechnik

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der

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Langfristige Live-Imaging von