Name: analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss zu PJ aus der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC; gewähren ref BB / K018442 / 1.).

1. Wachstum von Arabidopsis-Pflanzen und die Stress-Behandlung <ol><li> Vorbereitung 1 l Murashige und Skoog (MS) Medium durch Zugabe von 4,3 g MS Basal Salzmischung, 10 g Sucrose, 0,5 g 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) zu entionisiertem Wasser bis zu 1 l und Einstellen der pH-Wert auf 5,7 mit Kaliumhydroxid (KOH). Hinzufügen 6 g Phytoagar und Autoklaven für 20 min bei 120 ° C. <ol><li> Vor der Verfestigung, gießen Sie das Medium in runde Petrischalen (Durchmesser 9 cm, Höhe 1,5 cm, mit 20 bis 25 ml MS-Medium pro Platte). Erlauben die Platten für ca. 1 h in einer laminaren Strömungshaube trocknen, bevor der Deckel geschlossen wird. </li></ol></li><li> Platzieren Arabidopsis thaliana Samen in ein 1,5 ml Reagenzglas zur Oberflächensterilisation durch Zugabe von 1 ml 70% (v / v) Ethanol , enthaltend 0,02% (v / v) Triton X-100 und kontinuierlich für 5-10 min Schütteln. Für jeden Genotyp / Zustand, bereiten 10 Petrischalen mit jeweils tragenden ~ 100-150 Sämlinge. </li><li> Warten Sie etwa 10 Sekunden, bis die Samen auf die abrechnenBoden der Röhre, und dann den Überstand verwerfen durch Pipettieren. 1 ml 100% Ethanol, und schütteln Sie das Tube wieder für 10 min. </li><li> Bereiten Sie die Laminar-Flow-Haube, während die Samen Sterilisieren werden. Nehmen Sie ein Stück Filterpapier pro Probe, falten Sie es in der Hälfte der Aussaat zu erleichtern, und genießen Sie es in 100% Ethanol in der Haube. Warten Sie, bis es vollständig austrocknet. Man beachte, dass 100% Ethanol verwendet, da es schneller als 70% Ethanol verdampft. </li><li> Übertragen Sie die Samen auf das Filterpapier durch Pipettieren einer 1 ml Pipettenspitze Schnitt ~ 5 mm von dem feinen Ende verwendet wird. Trocknen lassen, was etwa 10 nehmen sollte - 15 min. </li><li> Sow ~ 100-150 sterilisierten Samen gleichmäßig auf jedem MS-Medium Petri-Platte und Dichtung jede Platte mit chirurgischen Band. </li><li> Lagern Sie die Platten den Kopf bei 4 ° C für 2 - 4 d zu fördern und zu synchronisieren Keimung. Alte Samen müssen möglicherweise länger bleiben (bis zu einer Woche) bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Platten auf eine Pflanze Gewebekulturkammer und lassen sie den Kopf nach oben.Wachsen die Pflanzen für 8 d unter einem langfris - Tage - Zyklus (16 h 100 &amp; mgr; mol · m - 2 · s - 1 Licht, 8 Stunden Dunkelheit) bei 20 ° C. </li><li> Für Stress - Behandlung, wenn die Pflanzen 8 d alt sind, in der Flow - Haube, übertragen sie aus dem Agar - Medium, indem sie sanft aus der Hand tragen Ethanol-sterilisierten Handschuhe, in eine sterilisierte Flasche flüssigem MS - Medium mit dem Stressor Schaben (zB , 200 mM Mannit). Vermeiden Sie über Agar-Medium trägt. Decken Sie den Kolben Mund mit sterilisiertem Folie ab und lassen die Pflanzen unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 1.8 für weitere 2 d auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln (~ 100 Umdrehungen pro Minute) zu wachsen. </li></ol> 2. Herstellung eines Precursor Protein durch in vitro - Transkription / Translation Hinweis: Dieses Protokoll nimmt die Verwendung von Arabidopsis Photosystem I Untereinheit D-Vorläufer (pPsaD) als Templat / Präprotein, aber das Verfahren ist kompatibel mit anderen. <ol&gt; <li> Klon der kodierenden Sequenz (CDS) von pPsaD in die multiple Klonierungsstelle (MCS) des pBluescript II SK - Vektor (oder irgendeinem anderen ähnlichen Vektor mit einem vorgeschalteten T7 - Promotor) 13. Man reinige das Plasmid (pBSK-pPsaD) eine DNA-Isolation-Kit und die Sequenz durch DNA-Sequenzierung zu überprüfen. HINWEIS: Alle diese Schritte verwenden Standard molekulare Klonierungstechniken. </li><li> Bestimmen Sie die pBSK-pPsaD Plasmid-DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer eingestellt unter Verwendung von Absorption bei 260 nm zu messen. Verdünne das Plasmid auf eine Endkonzentration von 10 ng / &amp; mgr; l. </li><li> Führen Sie einen 20 &amp; mgr; l PCR (35 Zyklen), um das verdünnte Plasmid als Matrize. Bereiten Sie die Reaktion wie folgt: 2 &amp; mgr; l 10 × Polymerase-Puffer, 2 &amp; mgr; l 2 mM dNTPs, 1 &amp; mgr; l 5 mM M13 Vorwärtsprimer (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 &amp; mgr; l 5 mM M13 Umkehrprimer (5 &#39;-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3&#39;), 1 ul pBSK-pPsaD Plasmid verdünnt, 1 U Taq-Polymerase und destilliertes Wasser, um das Gesamtreaktionsvolumen von bis zu20 &amp; mgr; l. Verwenden Sie ein Standard-PCR-Programm wie folgt: 95 ° C, 5 min; 35 Zyklen von [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); und 72 ° C, 5 min. </li><li> Versuch 5 &amp; mgr; l des PCR-Produkts auf einem 1% (w / v) Agarosegel in TAE-Puffer (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA) korrekten Amplifikation der cDNA zu verifizieren und zu quantifizieren, die relevante Band in Bezug auf Standards, um die Konzentration zu bestätigen. Lagern Sie den Rest des Produkts bei -20 ° C für weitere Anwendungen. </li><li> Bereiten einer 50 ul Reaktion eines Kaninchen - Retikulozyten - Lysat basierend zellfreien Transkriptions- / Translationssystem kompatibel mit PCR DNA unter Verwendung von wie folgt: 40 ul Reticulocytenlysat vom Transkriptions- / Translationssystem, 2,5 &amp; mgr; l radioaktiv markiertem [35 S] Methionin, 11 uCi / ml (spezifische Aktivität:&gt; 1000 Ci / mmol), 2,5 &amp; mgr; l sterilem destilliertem Wasser und 5 ul pPsaD PCR-Produkt (100-800 ng). Achtung: Tragen Sie Handschuhe, Laborkleidung und Schutzglasses beim Umgang mit radioaktivem Material. Überwachen und die Arbeitsfläche und Geräte dekontaminieren. Entsorgen Sie alle radioaktiven Abfälle in einem zugelassenen Abfallbehälter. </li><li> Inkubieren der Reaktion für 90 min in einem 30 ° C Wasserbad. Die Reaktion durch die Probe auf Eis gestellt. </li><li> Entfernen, um 1 &amp; mgr; l der Reaktion als Testprobe (das gleiche Volumen kann auch dazu dienen als Eingangssteuerung für Schritt 5.7) zur Überprüfung auf Standard Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), gefolgt von Autoradiographie, Fluorographie oder Phosphor-Bildgebung. Ein gutes Ergebnis wird durch die Beobachtung einer deutlichen und starke Bande entsprechend dem Molekulargewicht von pPsaD (~ 23 kD) angegeben. Lagern Sie den Rest der Reaktion bei -80 ° C für weitere Anwendungen. </li></ol> 3. Chloroplasten Isolation <ol><li> Die folgenden Stammlösungen: <ol><li> Bereiten Chloroplast Isolierungspuffer (CIB, 2x): 0,6 M Sorbit, 10 mM Magnesiumchlorid(MgCl 2), 10 mM Ethylenglykol - tetraessigsäure (EGTA), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 20 mM Natriumbicarbonat (NaHCO 3), 40 mM 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) ; auf pH 8,0 mit KOH eingestellt werden. Bereiten Sie 2 l 2x CIB, machen Aliquots und halten sie bei -20 ° C für die langfristige Lagerung oder bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung. Um 1x CIB machen verdünnen 2x CIB 1: 1 mit destilliertem Wasser; dies kann frisch am Tag der Chloroplasten-Isolierung Experiment hergestellt werden. </li><li> Bereiten HEPES-Puffer MgSO 4 -Sorbit (HMS, 1x): 50 mM HEPES, 3 mM Magnesiumsulfat (MgSO 4), 0,3 M Sorbitol; Einstellen auf pH 8,0 mit Natriumhydroxid (NaOH). Bereiten Sie 400 ml Puffer, machen Aliquots und halten sie bei -20 ° C für die langfristige Lagerung oder bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung. </li></ol></li><li> Führen Sie alle folgenden Verfahren im Kühlraum oder auf Eis. Vorzukühlen alle Lösungen, Geräten, Ausrüstung und Rotoren vor starting. </li><li> Vorbereiten eines kontinuierlichen Dichtegradienten durch Mischen von 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB Puffer und 5 mg Glutathion in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren der Mischung bei 43.000 × g für 30 min (Brems off) bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren behandeln das Rohr mit Sorgfalt die Steigung nicht zu stören und halten Sie sie auf Eis für die spätere Verwendung. </li><li> Übertragen Sie 100 ml 1x CIB pro Genotyp / Zustand in einen 1-Liter-Becher. <ol><li> Entfernen Sie die Sämlinge aus dem flüssigen Medium, indem sie in ein Sieb kippen und übertragen diese in einen anderen CIB enthaltenden Becher; dann spülen Sie das Gewebe mit dem CIB restliche flüssige Medium zu entfernen, bevor es mit 100 ml frischem CIB zu ersetzen. </li></ol></li><li> Zur Homogenisierung mit insgesamt 100 ml 1x CIB pro Probe in fünf aufeinander folgenden Runden der Homogenisierung verwenden, jeder Runde unter Verwendung von 20 ml frischem CIB in einem Becherglas 50 ml gehalten. <ol><li> Für die erste Runde der Homogenisierung, übertragen das Pflanzengewebe, in das 50 ml-Becherglas von Hand, so dass dervorherigen Haltepuffer durch die Finger zu entleeren. Versuchen Sie den größten Teil des Gewebes in der ersten Runde zu verwenden, aber stellen Sie sicher, dass es mit Puffer eingetaucht ist; wenn dies nicht möglich ist, stellen die verbleibenden nicht verwendeten Gewebe in der zweiten Runde. </li></ol></li><li> Legen Sonde des Gewebes Homogenisator in das Gewebe und homogenisieren mit zwei Impulsen von 1 bis 2 s je. Filtern des Homogenats durch zwei Schichten von Filtertuch in einen 250-ml-Zentrifugenröhrchen durch sanftes Quetschen. Bewahren Sie das Filtrat, und übertragen das Gewebe zurück in die 50-ml-Becher. </li><li> Legen Sie eine zweite 20 ml CIB aliquoten in den 50-ml-Becherglas, das Hinzufügen alle verbleibenden Gewebe nicht in der ersten Runde der Homogenisierung verwendet, und wiederholen Sie die Homogenisierung und Filtrationsschritte. Somit wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 , bis alle der 100 ml CIB verbraucht ist (dh 5 Aliquots von 20 ml), und die daraus resultierenden Filtrate kombinieren. </li><li> Zentrifugieren Sie die gepoolten Homogenats bei 1000 × g für 5 min (Bremse) bei 4 ° C und abgießender Überstand unmittelbar nach Beendigung der Zentrifugation, dabei nicht um das Pellet zu stören. Das Pellet im Restüberstand in der Röhre nach links, indem Sie vorsichtig das Rohr auf Eis gerührt wurde. Nicht heftig durch Pipettieren oder Vortexen resuspendieren. </li><li> übertragen Sie vorsichtig das Homogenisat auf der Oberseite der vorgefertigten Gradienten kontinuierliche Dichte, mit einer Pasteurpipette es über die Wand des Aufnahmerohr anzuwenden. Vermeiden Sie den Gradienten zu stören. Zentrifuge in einem Schwenkbecherrotor bei 7.800 × g für 10 min (Brems off) bei 4 ° C. HINWEIS: Zwei grüne Bänder in der Steigung nach dem Zentrifugieren gesehen werden kann: das untere Band intakt Chloroplasten enthält, und das obere Band gebrochene Chloroplasten enthält. </li><li> Entsorgen Sie die Top-Band durch Pipettieren und dann übertragen das untere Band mit einer Pasteur-Pipette in ein frisches 50 ml Zentrifugenröhrchen, ein Volumen von bis zu 8 ml pro Steigung zu halten. </li><li> In ~ 25 ml 1x HMS-Puffer in das Rohr und invertieren zweimal das Rohr to waschen Sie die Percoll aus den Chloroplasten. Das Röhrchen wird erneut in die Schwingeimerrotor und Zentrifuge bei 1000 × g für 5 min (Bremse) bei 4 ° C. </li><li> Gießen Sie den Überstand ab und lassen Sie das Chloroplasten-Pellet in den Rest HMS resuspendieren in der Röhre gelassen, indem Sie vorsichtig das Rohr auf Eis gerührt wurde. Fügen Sie eine weitere 100 bis 300 &amp; mgr; l von HMS, falls erforderlich (basierend auf der Größe des Pellets und der Auszählung in Abschnitt 4), aber versuchen Sie nicht, um die Probe zu viel zu verdünnen. <ol><li> Halten Sie die Chloroplasten auf Eis. Jedes Mal, bevor die Chloroplasten für Downstream-Anwendungen verwendet werden, schütteln Sie das Röhrchen sie wieder zu suspendieren. Verwenden Sie immer einen Schnitt Pipettenspitze (mit einem vergrößerten Pore) die Chloroplasten zu übertragen. </li></ol></li></ol> 4. Analyse der Ausbeute und Intakt von Chloroplasten <ol><li> In 5 ul isoliert Chloroplasten bis 495 &amp; mgr; l 1x HMS-Puffer in einem 1,5 ml-Röhrchen, und dann vorsichtig mischen, indem das Röhrchen Invertieren einer 1 zu erhalten: 100 Verdünnung. </li><li> Place ein Deckglas auf der Oberseite der Zählkammer des Haemocytometers. Langsam Pipette ~ 40 - 60 &amp; mgr; l der verdünnten Chloroplasten-Suspension in den Spalt zwischen dem Deckglas und der Zählkammer. Mit Hilfe eines Phasenkontrast-Mikroskop mit 10-facher oder 20x-Objektiv, suchen intakte Chloroplasten rund und hell und von einem Lichtkreis umgeben. HINWEIS: Unter dem Mikroskop gibt es eine 1 mm 2 Zählfläche mit 25 großen Quadraten, die jeweils 16 kleine Quadrate in der Mitte der Zählkammer. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Chloroplasten in 10 großen Plätzen. Die Zahl der Chloroplasten pro großen Platz sollte im Durchschnitt zwischen 10 und 30. Wenn zu wenige oder zu viele Chloroplasten vorhanden sind, den Verdünnungsfaktor (Schritt 4.1 oben) entsprechend anpassen, und wiederholen Sie den Vorgang. </li><li> Berechnen der Anzahl von Chloroplasten pro ml (Konzentration) wie folgt: n (die durchschnittliche Anzahl der pro Chloroplasten großen Platz berechnet in Schritt 4.3) × 25 (Gesamtzahl der großen Quadraten) × 100 (Verdünnungsfaktor) × 10 4 (Skalierungsfaktordaten pro 1 mL auszudrücken, da das Volumen oberhalb der 25 Quadrate 0,1 mm 3). </li><li> Berechnen Sie die tatsächliche Ausbeute von Chloroplasten durch die Konzentration durch das Volumen der Chloroplasten-Suspension in Schritt 3.12 erhalten multipliziert wird. Normalerweise können mehr als 50 × 10 6 Chloroplasten erhalten werden. </li></ol> 5. Chloroplasten-Protein Import <ol><li> Die folgenden Stammlösungen: <ol><li> Bereiten 10x HMS - Puffer: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO 4 und 3,0 M Sorbitol; auf pH 8,0 mit NaOH einstellen. Bereiten Sie 50 ml dieses Puffers, aliquoten, und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung und bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung. </li><li> Bereiten Import Anschlagpuffer: 50 mM EDTA, gelöst in 1x HMS-Puffer. Bereiten Sie 50 ml dieses Puffers, aliquoten, und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten 2x Protein-Ladepuffer: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) Glycerin, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) Bromphenolblau. Machen Sie 50 ml, und lagern bei 4 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, 100 &amp; mgr; l von 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT) bis 900 &amp; mgr; l Puffer. </li></ol></li><li> Um einen zeitlichen Verlauf mit drei Zeitpunkten ausgeführt werden, bereiten 3 Röhrchen jeweils ein 130-ul-Aliquot von Einfuhranschlagpuffer enthalten, und lassen Sie sie auf Eis. Bereiten Sie eine 450 &amp; mgr; l Import Reaktion in einem 2-ml-Röhrchen (pro Genotyp / Zustand). Tauen Sie alle kurz vor Zutaten zu verwenden. <ol><li> Für eine Importreaktion verwenden in der Regel von 10 × 10 6 Chloroplasten in A &amp; mgr; l Volumen; Wenn beispielsweise die Chloroplasten - Konzentration 2,5 × 10 8 / ml, 40 ul verwenden Chloroplasten Suspension. Drei Zeitpunkte müssen 3 × A &amp; mgr; l (dh 120 &amp; mgr; l in unserem Beispiel). </li><li> Mischen Sie die Reaktionen Komponenten auf Eis in der folgenden Reihenfolge: destilliertes Wasser (bis das Gesamtvolumen 600 &amp; mgr; l zu machen), B ul 10x HMS - Puffer (wobei B = [600-3 × A] / 10, dh 48 in unserem Beispiel), 12 ul1 M Gluconsäure (Kaliumsalz), 6 &amp; mgr; l 1 M NaHCO 3, 6 &amp; mgr; l 20% (w / v) BSA, 30 &amp; mgr; l 100 mM Adenosin - 5&#39;-Triphosphat - Magnesiumsalz (MgATP), 24 &amp; mgr; l 250 mM Methionin (nicht radiomarkiert ) und 30 &amp; mgr; l-Vorläuferprotein. Unmittelbar vor dem Import Reaktion starten, fügen Sie 3 × A &amp; mgr; l von Chloroplasten und mischen, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Reaktionsröhrchen bei 25 ° C in einem Wasserbad unter 100 &amp; mgr; mol · m - 2 · s - 1 Licht. Gelegentlich Flick die Rohre Chloroplasten zu suspendieren. </li><li> Um einen Zeitverlauf führen, zurückziehen 130 &amp; mgr; l-Aliquots aus der Reaktion bei den erforderlichen Zeitpunkten im linearen Bereich der Einfuhr, die für pPsaD bis zu ~ 12 min (4-, 8- und 12-min Zeitpunkten geeignet sind in diesem Fall). Der lineare Bereich Zeitraum kann für verschiedene Proteine 14 variieren. So wird vorgeschlagen, vor jeder einzelnen Präprotein zu testen t zu optimierener Zeitpunkten. </li><li> Unmittelbar nach dem Rückzug, übertragen jede 130-ul-Aliquot in ein Röhrchen eiskaltem Import Anschlagpuffer, mischen, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen, und alle Röhrchen auf Eis zu halten, bis die Zeit-Kurs abgeschlossen ist. </li><li> Zentrifugieren Sie alle Proben für 30 s bei 12.000 × g in einer Mikro, entsorgen Sie die Überstände durch Pipettieren und Resuspension Pellets in 15 ul 2x Protein-Ladepuffer durch Vortexen. </li><li> Analyse aller Proben sowie die pPsaD Eingangskontrolle (mit pPsaD äquivalent zu 10% der Menge zugegeben , die jedem Importreaktion aus Schritt 2.7) durch Standard - SDS-PAGE und Autoradiographie, Fluorographie oder Phosphor - Bild 15. Verwenden Sie die Bildanalyse-Software zu quantifizieren und die Ergebnisse zu analysieren. Um eine Anzeige der Importeffizienz bieten, kann die Menge des importierten Proteins in verschiedenen Genotypen / Bedingungen durch Messung der Radioaktivität mit jedem reifen Band zugeordnet bewertet werden. </li></ol>

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Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Wir haben kürzlich gezeigt , dass Chloroplasten - Import - Protein kann aktiv durch Stress reguliert werden, die für die Chloroplasten - Funktion und das Überleben der Pflanze 3 kritisch ist. In dieser Studie, eine solche Regelung zu überwachen, modifizierten wir unsere Chloroplasten Isolierung und in vitro Import Testverfahren , um Beurteilung der Importkapazität von Pflanzen unter Stressbedingungen gewachsen zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten eine wichtige Rolle für SP1 in Chloroplasten-Import-Regulationsprotein. Herkömmliche in vitro Import - Assays verwenden Pflanzen auf Standard - MS - Agar - Medium 6,17,18 gewachsen. Im Fall des hier beschriebenen sp1 mutant, solche herkömmlichen Assays ergaben keine Unterschiede in Proteinimport relativ zu dem WT 3. Allerdings ist die Rolle von SP1 bei der Regulierung der Proteinimport deutlich zum Vorschein , wenn Proteinimport unter Stressbedingungen beurteilt wird unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren (Abbildung 1). Während es may nicht möglich sein, direkt Import von Daten aus dem Stressbedingungen Assay mit denen von herkömmlichen Assays erhalten vergleichen (wie die Methoden Pflanzen in Flüssigkultur und auf Agar-Medium beschäftigen, beziehungsweise), Vergleiche zwischen Stress und Nichtstressbedingungen sind denkbar vorausgesetzt, die Pflanzen alle im gleichen flüssigen Kulturmedium mit oder ohne Stressoren gezüchtet. Im Vergleich mit dem Stress - Behandlung auf Agarmedium, ist Flüssigkultur bequemer für die Behandlung der großen Anzahl von Pflanzen , die für in vitro - Assays import. Darüber hinaus erleichtert es die einheitliche Anwendung der Stressor auf alle Pflanzen, die für Behandlungen kurzfristige Belastung besonders wichtig ist. Das hier vorgestellte Verfahren wurde der osmotische Druck unter Verwendung Mannit Behandlung zu untersuchen angewendet, aber leicht zu einer Vielzahl von anderen Belastungen angepasst werden könnte; kurzfristige Salzstress und oxidativer Stress, für die beispielsweise die entsprechenden Stressoren könnte be in ähnlicher Weise über flüssigem MS-Medium aufgebracht. Für andere Arten von Spannungen, schlagen wir den Grad der Belastung zuerst optimiert; übermäßig schwere Behandlungen haben negative Auswirkungen auf den Ertrag und / oder Import Kompetenz der isolierten Organellen können. Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb des Protokolls, auf die sollte man besonders darauf achten, wie nachfolgend beschrieben. Die optimale Konzentration für die Agar MS-Medium kann differieren (0,6-0,9%, w / v) je nach Hersteller. Daher ist es empfohlen, die empirisch Agarkonzentration optimieren, bevor Experimente beginnen. Das Medium sollte nicht so weich sein, dass es bei der Ernteschritt (Schritt 1.9) an das Gewebe klebt, noch sollte es so schwer sein, dass sie Pflanzenwurzelentwicklung hemmt. Die Saccharosekonzentration kann auch nach den verwendeten Pflanzen eingestellt werden. Wenn bei besonders kranken Mutanten arbeitet, ergänzt MS-Medium mit 2 - 3% (w / v) Saccharose Pflanzen besser wachsen kann helfen. Wenn AppLiegen Stress - Behandlungen, ist es nicht gut , sehr alten Pflanzen zu dem flüssigen Medium zu übertragen (zB&gt; 14 Tage). Dies liegt daran, die weiter entwickelten Wurzeln von älteren Pflanzen sind leichter während transferral beschädigt. In Bezug auf die Transkriptions / Translations-System gibt es zwei Hauptsysteme: solche auf Basis von Weizenkeime, und solche auf Basis von Kaninchen-Retikulozyten. Diese Kits können verschiedene Vorlagen verwenden, wie linearisierte Plasmide, unlinearisiert Plasmide oder PCR-Produkte. Die Kits sind auch spezifisch für die T3, T7 und SP6-Promotoren. Beachten Sie, dass das Kit wir hier empfehlen für die Verwendung mit PCR-Produkten nur geeignet ist und der T7-Promotor. Doch aus unbekannten Gründen einige radiomarkierten Präproteinen mit diesem System gemacht möglicherweise nicht effizient in den Import-Test arbeiten; in solchen Fällen kann man erwägen einen Weizenkeimextrakt-System oder ein Retikulozytenlysat-System gemeint für Plasmidmatrizen versuchen. Man kann auch das Ergebnis der Transkription / Translation Wieder verbessernAktion durch die Reaktionsbedingungen modifiziert nach dem Handbuch des Herstellers. Es ist wichtig, Chloroplasten Isolation früh am Morgen (oder früh am Lichtzyklus der Wachstumskammer), um zu vermeiden Ansammlung von Stärke in den Chloroplasten aufgrund der Photosynthese zu beginnen, die die Isolierung von intakten Organellen behindern können. Die Chloroplasten-Isolierungsverfahren muß schnell und ohne unnötige Verzögerungen durchgeführt werden, und die isolierten Chloroplasten müssen immer kalt gehalten werden. Dies ist gegen die Beobachtung zu mildern, die Chloroplasten isoliert werden nach und nach ihre Lebensfähigkeit verlieren, was nicht gut ist. Wenn neu aufgetaut CIB oder HMS-Puffer verwenden, müssen Sie vor der Anwendung die Puffer gut zu mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten. Die optimalen Bedingungen für die Homogenisierung von Pflanzenmaterial haben empirisch festgestellt worden ist, und kann variieren, wenn ein anderes Gewebe-Homogenisator verwendet wird. Wenn die verschiedenen Pflanzen Genotypen enthalten similar Chlorophyllpegel, Chlorophyll Quantifizierung kann als Alternative verwendet werden, um die Proben zu normalisieren, bevor die Import Assays durchzuführen. Chlorophyll kann spektrophotometrisch nach Extraktion einer Probe der isolierten Chloroplasten in 80% (v / v) wßrigem Aceton 19,20 bestimmt werden. Wenn jedoch die Importraten von Pflanzen verschiedene Chlorophyll Inhalt zeigen (zB Mutanten mit chlorotisch Phänotypen) miteinander verglichen werden, verwenden Chloroplasten Zahl Zählen der Chloroplasten - Proben in den Import - Assays zu normalisieren. Es ist besonders wichtig, die Chloroplasten gründlich in Schritt 3.11 zu resuspendieren. Unzureichende Aufwirbelung können Aggregate von Chloroplasten lassen, was es schwierig machen Zahlen genau zu zählen und damit die korrekte Beladung der Importreaktionen behindern wird. Wenn eine schwere Aggregation unter dem Mikroskop zu sehen ist (zB Aggregate mit&gt; 10 Chloroplasten miteinander verbunden), auch weiterhin die Chloroplasten - Probe , bis die aggregat auf Eis schüttelnes werden entfernt. Es ist einfacher, die Chloroplasten in einem kleineren Volumen an Puffer wieder zu suspendieren. Es ist wichtig, sich bewusst zu sein, dass Proteinimport Reaktionen (Abschnitt 5) müssen wegen ihrer radioaktiven Natur mit entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden. Notwendige Vorsichtsmaßnahmen gehören: Einmalhandschuhe, Laborkleidung und Schutzbrille zu tragen, die Überwachung und die Arbeitsfläche und Ausrüstung Dekontaminierung, und in einem zugelassenen Abfallbehälter aller radioaktiven Abfälle zu entsorgen. Denken Sie auch daran, dass die richtige osmotische Druck für die Aufrechterhaltung der Unversehrtheit der Chloroplasten während der Import Reaktionen kritisch ist, und dies wird hauptsächlich durch die HMS-Puffer gehalten. Denn 10x HMS viskos ist, sollte sie zunächst bis auf RT erwärmt werden, und dann gründlich gemischt und aufgetragen, um eine Schnittpipettenspitze Messung von genauen Volumina zu gewährleisten. In der Importreaktion wird kaltes Methionin zugesetzt, um den Einbau von freien radiomarkierten Methionin in keinem Zusammenhang chloropl zu hemmenast Proteine ​​durch organellären Übersetzung während der Inkubationsschritt, während BSA verwendet wird, indem sie als Substrat für Proteasen Proteolyse zu minimieren.

Chloroplasten sind sehr reichlich Organellen, die in den grünen Geweben von Pflanzen existieren. Sie sind bekannt für ihre kritische Rolle bei der Photosynthese, ein Prozess, der Lichtenergie nutzt Kohlendioxid zu Zucker umwandeln und unterstützen somit fast alles Leben auf der Erde 1. Zusätzlich Chloroplasten (und die breitere Familie von verwandten Organellen genannt Plastiden) spielen viele andere wichtige Rollen in Pflanzen, einschließlich der Biosynthese von Aminosäuren, Lipiden, Pigmente und die Erfassung von Umgebungssignalen, wie Schwerkraft und pathogen Herausforderung. Photosynthese erzeugt reaktive Sauerstoffspezies (ROS) als Nebenprodukte, die unter bestimmten Umständen nützlich Rollen haben, aber wenn können schädlich oder sogar letale Wirkungen überproduzierte verursachen. Die Überproduktion von ROS wird vor allem durch widrige Umweltbedingungen gefördert und damit Chloroplasten sind eng mit Reaktionen auf abiotischen Stress, wie Salz- und osmotischen Stress 2 verbunden. CHloroplasts haben eine komplexe Struktur. Jede Chloroplast ist durch eine Doppelmembranaußenschicht genannt Hülle umgeben, die aus äußeren und inneren Membranen besteht. Intern gibt es ein weiteres Membransystem die Thylakoide genannt, wo die Lichtreaktionen der Photosynthese stattfinden. Zwischen den beiden Membransystemen gibt es ein wässriges Kompartiment Anruf das Stroma, die Kohlenstoff-Fixierung beteiligt ist. Ein Chloroplasten kann bis zu ~ 3.000 verschiedene Proteine enthalten, und die überwiegende Mehrheit dieser Proteine sind in dem Cytosol in Vorläuferform synthetisiert und müssen in das Organell durch spezielle Protein translocons in den Hüllmembranen 1 importiert werden. Interessanterweise haben neuere Arbeiten darauf hin, dass Chloroplasten Proteinimport aktiv geregelt ist, und so in der Lage, eine wichtige Maß an Kontrolle über den Chloroplasten Proteom auszuüben. Zum Beispiel wurde es im Jahr 2015 berichtet, dass Proteinimport gegen abiotischen Stress durch die direkte Regulierung der Fülle von th reagieren kanne Translokon am äußeren Hüllmembran von Chloroplasten (TOC) durch das Ubiquitin-Proteasom - System 3. Verwendung von gereinigtem Chloroplasten und in vitro synthetisierten Vorläuferproteine, Proteinimport in vitro 4,5 rekonstituiert werden. Somit können in vitro - Verfahren verwendet werden , um die Raten der Einfuhr in verschiedenen mutierten Pflanzen 6, zu beurteilen , die eine kritische Ansatz für die Analyse von putativen Komponenten des Proteinimportmaschinerie war und für die Mechanismen entdeckt Proteinimport und ihrer Regulation zugrunde liegen. Außerdem Chloroplasten können mit weiteren Fraktionierung oder Protease Verdau folgenden in vitro Import verarbeitet werden, die Untersuchungen über die Unter organellären Lokalisierung und der Topologie von Chloroplasten - Proteine 7,8 erleichtern kann. Um die Regulierung der Proteinimport durch Stress studieren, haben wir unsere Routine Chloroplasten Isolationsmethode modifiziert, wie wir beschreibenHier. Wichtig waren, die Chloroplasten von Pflanzen isoliert, die auf Standard-Murashige und Skoog (MS) Agar-Medium für 8 Tage und dann übertragen in flüssigem MS-Medium, das mit Stressor gewachsen war, eine relativ kurze, kontrollierte Stress-Behandlung bietet. Die Ausbeute und die Kompetenz von Chloroplasten aus einer solchen Stress-behandelten Pflanzen isoliert sind kompatibel mit dem nachgeschalteten in vitro Proteinimport - Test 3. Zusätzlich zu den Chloroplasten Isolierungsprotokoll zeigen wir das Routineverfahren für die in vitro Proteinimport, die robust erwiesen hat und weit 3,9-12 verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog basal salt&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>phytoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>surgical tape (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Micropore, 3M)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>filtration cloth (Miracloth)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL centrifuge bottle</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Kinematica PT10-35)</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron probe (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>fixed-angle rotor for 250&amp;nbsp;mL bottles (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JLA-16.250)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>fixed-angle rotor for 50&amp;nbsp;mL tubes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JA-25.50)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>radiolabeled [&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S] methionine</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA)</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>phase-contrast microscope (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0.1 mm depth, 1/400 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>cover glasses</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm &amp;times; 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>1.5 mL microfuge tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL microfuge tubes</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>microfuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid (potassium salt)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>methionine</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>image analysis software (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>unavailable</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants

Chloroplasten sind Organellen mit vielen lebenswichtige Rollen in Pflanzen, die nicht nur die Photosynthese sind aber zahlreiche andere Stoffwechsel- und Signalfunktionen. Darüber hinaus sind die Chloroplasten kritisch für Pflanzen Reaktionen auf verschiedene abiotischen Stress, wie beispielsweise Salzgehalt und osmotischem Stress. Ein Chloroplasten kann bis zu ~ 3.000 verschiedene Proteine ​​enthalten, von denen einige durch ihr eigenes Genom codiert sind. Jedoch sind die meisten Chloroplasten-Proteine ​​in den Zellkern codiert und in dem Cytosol synthetisiert werden, und diese Proteine ​​müssen in den Chloroplasten durch translocons an den Chloroplasten Hüllmembranen importiert werden. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Chloroplasten-Import-Protein kann aktiv durch Stress reguliert werden. Um biochemisch solche Regulierung der Proteinimport unter Stressbedingungen zu untersuchen, entwickelten wir das hier beschriebene Verfahren als eine schnelle und unkomplizierte Verfahren, das leicht in jedem Labor erreicht werden kann. In diesem Verfahren werden Pflanzen werden unter normalen conditio gewachsenns und dann ausgesetzt Bedingungen in flüssiger Kultur zu betonen. Pflanzenmaterial wird gesammelt und Chloroplasten werden dann durch Homogenisierung freigegeben. Das rohe Homogenat wird durch Dichtegradientenzentrifugation getrennt, so dass die Isolierung der intakten Chloroplasten. Chloroplasten-Ausbeute wird durch Zählen bewertet und Chloroplasten Intakt wird unter einem Mikroskop geprüft. Für die Proteinimport Assays werden gereinigte Chloroplasten mit 35 S radioaktiv markiertem in vitro setzten Vorläuferproteine inkubiert, und der Zeitverlauf Experimente durchgeführt werden Vergleiche von Importraten zwischen Genotypen unter Stressbedingungen zu ermöglichen. Wir präsentieren Daten, die diese Methode erzeugt mit, die zeigen, dass die Rate der Proteinimport in Chloroplasten von einer regulatorischen Mutante speziell unter osmotischen Stressbedingungen verändert wird.

Ein Beispiel Chloroplasten - Import - Protein Experiment mit 3 Zeitpunkten ist in Abbildung 1 dargestellt. PSAD eine ~ 18 kD - Komponente des Photosystems I an das Stroma freigelegt, mit einer Vorläuferform von ~ 23 kD 16. PSAD wurde hier für die in vitro Proteinimport - Test ausgewählt , weil seine Steady-State - Spiegel im sp1 Mutante erhöht sind, relativ zu WT, unter Stressbedingungen, was auf eine Änderung ihrer Einfuhr Effizienz in der Mutante 3. Die sp1 Mutante trägt einen Defekt in einem wichtigen Regulator des Chloroplasten - Protein Importmaschinerie - das SP1 Protein 3. Für die Chloroplasten von Pflanzen unter normalen Bedingungen isoliert gewachsen, gab es keinen offensichtlichen Unterschied in pSAD import zwischen sp1 und WT (Daten nicht gezeigt) 3. Doch hier beschriebenen Verfahren unter Verwendung von PSAD Import in die Chloroplasten von osmotisch isoliert zu beurteilengestressten Pflanzen wurde ein deutlicher Unterschied festgestellt. Während wir die Ansammlung des reifen Proteins Form in einer zeitabhängigen Art und Weise mit den beiden Genotypen beobachtet, war die Rate der Import deutlich niedriger für WT Chloroplasten als für sp1 Chloroplasten (Abbildung 1), die mit unseren bisherigen Ergebnissen 3 konsistent ist, und zeigt , eine wichtige Rolle für die SP1-Protein in den Chloroplasten-Import von pSAD unter Stressbedingungen zu regulieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein Protein Import Assay Dirigiert Chloroplasten aus Pflanzen isoliert Grown unter osmotischer Stress Bedingungen. Chloroplasten von einer 10 Tage alten WT (Col-0) und eine sp1 mutierten Arabidopsis - Pflanzen isoliert wurden , unter Stressbedingungen (200 mM Mannit) gezüchtet 2 d. (A) Protein Import wurde unter Verwendung von durchgeführt [35 S] -Methionine-markiertem pPsaD und man ließ für 4, 8 und 12 min vor der Analyse durch SDS-PAGE und Phosphor-Bild fortzufahren. Parallel dazu umfasst die pPsaD 10% Steuereingang in vitro translatierte Protein (IVT) wurde analysiert. Der Vorläufer (pre) und reifen (mat) Formen der pPsaD angegeben, während zwischen zwei Bands, die wahrscheinlich entsprechen abgeschnitten oder proteolysiertes Translationsprodukte, weil ihre Intensität während des Zeitverlaufs (*) nicht ändern. (B) Um die Preise der Import in die Chloroplasten von WT und sp1 Pflanzen angebaut unter Stressbedingungen, die Intensität jedes Band vergleichen , um zu importiert reife Protein in A entspricht , wurde quantifiziert. Alle Daten werden als Prozentsatz der Menge der eingeführten Protein in den Chloroplasten von WT Pflanzen nach 12 min ausgedrückt. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Analyse des Proteinimports in aus gestressten Pflanzen isolierte Chloroplasten | Biologie | Video

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Hier beschreiben wir eine neue Methode Proteinimport in isolierte Chloroplasten unter Stress zu studieren. Das Verfahren ist schnell und einfach, und kann die Folgen verschiedener Stressbedingungen für Chloroplasten Proteinimport, und die entsprechenden regulatorischen Mechanismen zu studieren, angewendet werden.

Analyse von Protein-Import in Chloroplasten von gestressten Pflanzen isoliert

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

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Serie: Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Forschung

Biochemie

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Biologie

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analyse der translationalen Regulation in hitzegestresster Arabidopsis

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational activities of various genes can help us understand the molecular mechanisms underlying plant resilience, contributing to the development of crops with enhanced stress tolerance in the face of global climate change. This paper presents a detailed methodology for assessing translation efficiency through polysome profiling in plants exposed to heat stress. The procedure is divided into three parts: heat stress treatment for Arabidopsis, translation efficiency test using polysome profiles, and calculation of translation efficiency by isolating non-polysomal and polysomal RNA based on the profile. In the first part, Arabidopsis plants are subjected to controlled heat stress conditions to mimic environmental challenges. The treatment involves exposing the plants to high temperatures for specified durations, ensuring consistent and reproducible stress induction. This step is crucial for studying the plant's physiological and molecular responses to heat stress. The second part involves the translation efficiency test using polysome profiling. Polysomes are extracted through sucrose gradient centrifugation, which separates mRNAs based on ribosomal loading. This allows for the examination of ribosome occupancy on mRNAs, providing insights into the translational control mechanisms under stress conditions. In the third part, RNA is isolated from both polysomal and non-polysomal fractions. Spike-in RNA is used to accurately measure the amount of RNA in each fraction. The calculation of translation efficiency is performed by comparing the distribution of mRNAs across these fractions under normal and heat stress conditions. The translation activities of specific genes are further assessed by performing quantitative real-time PCR (qRT-PCR) with ribosome-associated RNA and total RNA. This methodology focuses exclusively on the effects of heat stress, providing a detailed protocol for analyzing translational regulation in plants.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Polysomen-Profiling-Protokoll zur Untersuchung der translationalen Regulation in Arabidopsis unter Hitzestress

The protocol presented here involves polysomal profiling to isolate translatome, mRNAs associated with ribosomes, into non-polysomal and polysomal RNAs from Arabidopsis through sucrose density gradient centrifugation. This method demonstrates the translation efficiency of heat-stressed Arabidopsis.

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

Protein Transport to the Thylakoids

Thylakoids are membrane-bound sac-like structures within the chloroplast that serve as sites for photosynthesis. Thylakoid lumen contains many electron transport proteins and is enclosed by a thylakoid membrane rich in the light-harvesting complex. Proteins targeted to the thylakoids are transported as precursors and are sorted by the general TOC/TIC import pathway. Once the precursor reaches the stroma, stromal processing peptidases remove their transit signal and expose thylakoid signal sequences. The processed precursors use distinct mechanisms to reach the thylakoid lumen or membrane.
The first mechanism is the chloroplast signal recognition particle or cpSRP-dependent pathway that transports chlorophyll-binding proteins to the thylakoid membrane using energy from GTP hydrolysis. cpSRP proteins and FtsY receptors bind the processed precursor and stimulate GTP hydrolysis. The energy derived facilitates precursor entry through the Alb3 translocase and their subsequent insertion into the thylakoid membranes. In a second mechanism, small thylakoid membrane proteins form soluble stromal intermediates with short hydrophobic signal-like peptides that allow these proteins to fold and insert into the membrane. Once inserted, the signal-like peptides are cleaved by thylakoid processing peptidases to form the mature transmembrane protein. A third pathway employs Oxa-like integrases for inserting thylakoid membrane protein spontaneously without any energy input or targeting factors.
Some proteins targeted to the lumen employ the chloroplast secretory or cpSec pathway, which transports unfolded proteins across the thylakoid membrane. Processed precursors carrying a twin-arginine or RR motif in the N terminal domain often get folded by the stromal chaperonin Cpn60. Folded peptides are then translocated to the thylakoid lumen by the chloroplast twin-arginine or cpTat pathway. cpTat peptidases possess a basic amino acid in their C-terminal domain that helps distinguish and avoid cpSec precursors and cleaves cpTat precursors only.

Proteintransport zu den Thylakoiden

Thylakoids are membrane-bound sac-like structures within the chloroplast that serve as sites for photosynthesis. Thylakoid lumen contains many electron ...

Analyse von Protein-Import in Chloroplasten von gestressten Pflanzen isoliert

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Proteintransport zu den Thylakoiden