Name: the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
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Die Autoren danken Marin Manuel und Olivia Goldman-Szwajkajzer für ihre Hilfe in den Fotos zu machen. Die Autoren danken auch Arjun Masukar und Tobias Bock für das Manuskript Korrektur. Finanzielle Unterstützungen wurden von der Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401) zur Verfügung gestellt, das NIH-NINDS (R01NS077863), die Thierry Latran Foundation (OHEX Project), die Französisch Verband für Myopathie ( Grant-Nummer 16026) und Target ALS sind dankbar anerkannt. Felix Leroy war der Empfänger einer &quot;Contrat Doctoral&quot; von der Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinien (86/609 / CEE und 2010-63-UE) und Französisch Gesetzgebung durchgeführt und wurden von der Universität Paris Descartes Ethikkommission genehmigt. 1. Spinal Cord Scheibe Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen täglich oder einen Tag im Voraus. Wenn über Nacht, Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 gehalten und in fest verschlossenen Flaschen gekühlt halten. <ol><li> Bereiten Low Na + künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF): 3 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mM Sucrose, 26 mM NaHCO 3, 0,8 mM CaCl 2, 8 mM MgCl 2, 25 mM Glucose, 0,4 mM Ascorbinsäure, 1 mM Na-Kynurenat, 2 mM Na-Pyruvat. Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,4). Da Na-Kynurenat oft schwer zu lösen, stellen Sie sicher, das in der Tabelle aufgeführten Materialien zu kaufen. </li><li> Bereiten K-Gluconat solution: 130 mM K-Gluconat, 15 mM KCl, 0,05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM Glucose, 1 mM Na-Kynurenat, 2 mM Na-Pyruvat, eingestellt auf pH 7,4 mit KOH. </li><li> Bereiten ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 25 mM Glucose, 0,4 mM Ascorbinsäure, 2 mM Na-Pyruvat. Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,4). </li><li> Vor dem Beginn der Dissektion, lösen sich 2% Agar in 80 ml der K-Gluconat-Lösung und halten bei 60 ° C warm. </li></ol></li><li> intrakardialer Perfusion <ol><li> Führen Sie diese Vorbereitung auf die weiblichen und männlichen Mäusen im Alter von P2 bis P11. </li><li> Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 0,1 ml 25 mM Natrium-Pentobarbital (50 mg / kg). </li><li> Mit Nadeln oder Klebeband, immobilisieren die Maus auf dem Rücken auf einer großen Petrischale mit Silikon gefüllt. Verwenden Sie ein Sezieren microscope für den Rest der Präparation. </li><li> Halten Sie die Spitze des Brustbeins, heben Sie die Brust und schneiden Sie die Membran mit einer feinen Schere. Dann öffnen Sie die Brust auf beiden Seiten, indem sie durch die Rippen schneiden das Herz aussetzen. </li><li> Schneiden Sie den rechten Vorhof vor den linken Ventrikel mit einer 27G Nadel Punktierung. </li><li> Perfuse mit eiskaltem niedrigen Na + ACSF. Nach 30 sec, sollte eine niedrige Na + ACSF aus dem Atrium fließen zu sehen. Geringe Mengen an Natrium verhindern, dass die Zellen, die aus Spick und Zelltod bei der Präparation zu reduzieren. </li><li> Halten Sie die Nadel im Herzen unter dem Binokular halten, bis die Leber gelb wird, wenn das Blut abgelassen wird. </li></ol></li><li> Rückenmark Dissektion <ol><li> Enthaupten das Tier und legte es auf seinen Bauch. </li><li> Entfernen Sie schnell , die Haut des Rückens (Abbildung 1A1). Machen Sie zwei Schnitte durch die Schultern und hinunter den Brustkorb (Abbildung 1A2). Dann schneiden Sie die Schnur als low wie möglich in der kaudalen Abschnitt, um die Wirbelsäule mit dem Beginn der Rippen aus dem unteren Teil des Tieres zu isolieren. Drehen Sie das Tier wieder und entfernen Sie die Eingeweide noch an den Rippen befestigt. </li><li> Übertragung der Wirbelsäule zu einer anderen, kleineren Silizium gefüllte Petrischale und benutzen 4 insect pins es dorsalen Seite nach oben (Figur 1A) zu halten. </li><li> Kontinuierlich perfundieren das Tier mit Carbogen blasigen ACSF (bei etwa 4 ° C) , während eine Laminektomie der dorsalen Seite durchgeführt wird , und Aussetzen des Rückenmarks von der rostralen Ende (1B). Dazu legen Sie die Spitze der feinen Schere zwischen dem Knochen und dem Rückenmark und schneiden den Knochen nach und nach aus dem rostralen Ende, um sicherzustellen, von der weißen Substanz zu bleiben weg. Alternate auf jeder Seite , während mit einer Pinzette die Band von Knochen bereits geschnitten (Abbildung 1B1) fern zu halten. </li><li> Unter Verwendung der kleinsten Feder Schere und Pinzette, heben Sie die Dura und schneidenbeide Seiten auf, während Sie die lose Teil der Dura, um mit der Schere eine Beschädigung des Rückenmarks zu vermeiden. Schneiden Sie entlang der rostro-caudale Achse. HINWEIS: Die Dura ist eine halb transparente kontinuierliche Membran; in diesem Alter ist die pia mater zu zerbrechlich und wird während der Präparation und Slicing (Abbildung 1B2) kommen auseinander. </li><li> Sobald die Dura ein stumpfes Glas oder Kunststoffspitze entfernt verwendet wird vorsichtig auf die Schnur auf der linken Seite des von der Halbschnitt Wirbelsäule gebildet Nut schieben, und schneiden Sie die ventralen und dorsalen Wurzeln auf der rechten Seite, von der rostralen Seite beginnen , am weitesten von wo aus sie die Schnur (wenige mm zumindest Abbildung 1B2) eingeben. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite, gehen immer von rostral nach kaudal. Wenn linkshändig, von der linken Seite beginnen und dann auf die rechte Seite zu bewegen. </li></ol></li><li> Die Einbettung in Agar <ol><li> Schieben Sie die Kabel aus der Wirbelsäule. Verwenden Sie einen kleineren Insektenstift festzunagelndie Schnur mit der Rückenfläche nach oben und zart jedes Stück Membran noch daran (Abbildung 1C1) angebracht entfernen. </li><li> Einmal gereinigt, schneiden beide Enden (Abbildung 1C2). Fügen Sie ein gebogener Insektenstift im vorderen Teil der Schnur der Schnur zu manipulieren und beachten Sie seine Ausrichtung (Pfeil in Abbildung 1C2). Dann übertragen das Rückenmark zu einer eiskalten K-Gluconatlösung. HINWEIS: Diese Lösung ahmt die intrazelluläre Zusammensetzung des CSF und die Zellen vor dem Absterben des osmotischen Schock verhindern , sobald die Motoneuronen 26 geschnitten wird. </li><li> Sobald das Rückenmark innerhalb der intrazellulären Lösung ist, nehmen Sie den Becher mit dem Agar aus dem trockenen Bad und kühlen sie auf eine Mischung aus Eis und Wasser. </li><li> Halten Sie Rühren, während die Temperatur zu messen. Wenn die Temperatur 38 ° C erreicht das Rückenmark tauchen, es durch das Insekt Stift halten und legen Sie sie nach unten rostralen Seite. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark ist als straight wie möglich weg von den Wänden, Schwanz- Teil leicht nach oben (Abbildung 1D1). </li><li> Verlassen das Becherglas in das Gemisch aus Eis und Wasser das Agar zu ermöglichen, so schnell wie möglich zu verfestigen. Stellen Sie sicher , dass es an seinem Platz bleibt und dass das Kabel so gerade wie möglich (Abbildung 1D1) ist. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Nach dem Erstarren schneiden den Agarblock das Rückenmark in der Weise , dass die Basis des Blocks in einem 35 ° Winkel mit dem Lendenteil des Cords (Pfeil in Figur 1D2) enthält. Die dorsale Oberfläche sollte entfernt werden , mit Blick auf von der Basis (Abbildung 1D2). Hinweis: Dies ist ein kritischer Schritt in dem Verfahren zum Aufrechterhalten der Kontinuität der Motoneuron-Pools zu den ventralen Wurzeln, von dem sie zu verlassen. </li><li> Kleben Sie den Block in die Kammer des Vibratom mit Sekundenkleber. Tauchen sie in K-Gluconatlösung und fügen Sie slushed gefrorenen K-Gluconatlösung zu haltendas Bad (unter 2 ° C) gekühlt. </li><li> Schneiden Sie 350 bis 400 &amp; mgr; m dicke Scheiben der Lendengegend (erkennbar durch ihre Krümmung und mit größerem Durchmesser). In der richtigen Ausrichtung (siehe 1.4.1.), Verwenden Sie die Klinge von der dorsalen auf der ventralen Oberfläche zu schneiden und Scheiben kontinuierlich mehr rostral machen. Typischerweise gibt es 4-5 geeignete Scheiben mit ventral Wurzeln erstreckt 2 mm oder mehr. Verwenden Sie die folgenden Parameter: 10 ° Winkel, 70 Hz Schwingungsfrequenz und 10 mm / min Geschwindigkeit des Schneidens. </li></ol></li><li> Die Inkubation <ol><li> Übertragen Sie die Scheiben zu ACSF bei 34 ° C. Nach ca. 30 min, kühlen die Scheiben bis auf RT und die Aufnahme-Session beginnen. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection A1:. Die Entfernung der Haut des Rückens der dorsalen Säule zu belichten A2:Schneiden der Schultern und Rippen der dorsalen Säule frei B1:. Vertebrale Spalte auf die Silizium-gefüllte Petrischale gepinnt (dorsalen Seite nach oben, kaudal links) B2:. Gleiche mit dem Rückenmark ausgesetzt und seziert C1:. Rückenmark isoliert . (rostralen Seite links) C2: Rückenmark bereit eingebettet werden (Bauchseite nach oben, rostralen Seite links). Notieren Sie sich die kleineren Insektenstift an der rostralen Seite D1:.. Rückenmark im Agar - Becher (rostralen Seite dow, Bauchseite gegenüber dem Boden) D2: Cut Agar - Block mit dem eingebetteten Rückenmark. Notieren Sie sich die 35 ° Winkel der Rückenmark bildet mit der Basis des Blocks und der Lendenanschwellung (Pfeil). Maßstabsbalken 1 cm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Platzieren der Scheibe in die Kammer HINWEIS: Ventral Wurzeln sind von unterschiedlicher Größe. <ol><li> Bereiten Sie eine Schachtel mit verschiedenen Pipetten mit Spitzendurchmessern von 40 bis 170 &amp; mgr; m im Voraus reichen. Zur Vorbereitung Saugpipetten, bereiten viele Pipetten mit einer langen Verjüngung. Mit einem Diamantmesser, machen einen Schnitt an verschiedenen Positionen. Dann unter einem Binokular, brechen sie durch die Spitze mit einer Pinzette zu schlagen. </li><li> Entfernen Sie die Kammer von der Aufnahme Mikroskop und legen Sie sie unter einem Binokular. </li><li> Wählen einer Scheibe, die einen ventralen Wurzel von ausreichender Länge enthält (2 mm oder mehr) auf eine Nutsche Stimulationselektrode angebracht zu werden. Wählen Sie die richtige Ausrichtung der Scheibe mit den ventralen Wurzeln nach oben (2A) und schneiden Sie vorsichtig die Agar um die ventralen Wurzeln , während der Rest des Agar verlassen um die Scheibe (2B). Hinweis: Da der Agar fester als die Scheibe ist, wird dies die Gewinde des Ankers Scheibe ermöglichen, sich auf dem Agar zu ruhen und nicht auf der Scheibe und damit die anchor wird das Gewebe nicht schädigen. Stellen Sie sicher , dass die Fäden des Ankers Scheibe oberhalb der Motoneuron - Pool (in rot in 2C gezeigt). </li><li> Montieren Sie die Kammer wieder auf das Mikroskop und kontinuierlich die Aufnahmekammer perfuse mit ACSF mit einer Rate von 1 bis 2 ml / min bei RT. Verwendung einer Glaspipette mit ACSF gefüllt und mit einer Spritze verbunden, saugen einen der ventralen Wurzel (Pfeil in Figur 2C). Um eine gute Stimulation des ventralen Wurzel zu erreichen, muss die Pipettenspitze um den ventralen Wurzel dicht sein. Einen Pol sollte in der Stimulationselektrode und die andere in dem Bad (oder mit der patch-Klemmelektrode reference). </li><li> Erreichen patch-clamp Aufzeichnung der gewünschten Zelltyp und notieren Sie die Wirkung der ventralen Wurzel Stimulation als previsouly 10 beschrieben. <ol><li> Hier wird ein Verstärker für die Datenerfassung verwendet werden. Filter Ganzzellableitungen bei 3 kHz. Digitalisieren bei 10 kHz. Compensate Brückenwiderstand in current-Clamp-Modus. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ventralwurzel Vorbereitung A: Lendenwirbelscheibe Rückenmark eingebettet in Agar mit der ventralen Wurzel nach oben . B: lumbalen Rückenmark Scheibe mit den ventralen Wurzeln aus dem Agar befreit . C: lumbalen Rückenmark Scheibe mit einer Stimulationselektrode eng um den ventralen Wurzeln (Pfeil) platziert . Beachten Sie die Position der Renshaw - Zellen, die rote Fluoreszenz im CHRNA2-Cre Maus 28 mit der Maus Reporter gekreuzt R26 Tom 17. Maßstabsbalken 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Oblique slicing des Rückenmarks ist wichtig, da es für die einseitige Stimulation der Motoneuron-Pools und Renshaw Zellen in einer einzigen Wirbelsegments in einer zuverlässigen, umfassende und spezifische Weise ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht es eine schnelle, elegante und eindeutige Identifikation von aufgezeichnetem Motoneurone. Als nächstes werden wir die Vorteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Scheibe Zubereitungsmethoden zu markieren, und dann werden wir die häufigsten Fallen stressen zu vermeiden, während der Durchführung dieses Verfahrens. Die meisten Studien Querschnitten unter Verwendung stützen ihre Identifizierung auf intrinsischen elektrischen Eigenschaften 3,14,15,29. Doch diese variieren stark zwischen den Motoneuron - Pools sowie zwischen Motoneuron - Subtypen innerhalb eines bestimmten Pool (Alpha-, Beta- und Gamma-Motoneuronen 30). Daher sind unter Verwendung von Studien Größenparameter wahrscheinlich kleiner Gamma-Motoneuronen auszuschließen. Auf der anderen Seite, Cooper und Sherrington described 1940 eine Gruppe von großen Nervenzellen im ventrolateralen grauen Substanz des lumbalen Rückenmark von Affen und Katzen , die 31,32 Axone aufsteigend überschritten hatte. Zusätzlich zu den Motoneuron somas nahe zu sein, stellten sie fest, dass sie von Motoneuronen histologisch nicht zu unterscheiden erschienen. Ein kürzlich erschienener Artikel bestätigte die Existenz solcher Zellen in der Maus 33. Aufgrund der großen Grße dieser Zellen und ihre Lage, konnten sie wurden in früheren Studien irrtümlicherweise enthalten. Unser Identifizierung Kriterium schließt mutmaßliche spinal Grenzzellen, da ihre Axone in der ventralen Wurzel nicht projizieren, während gleichzeitig eine zuverlässige Identifizierung aller Motoneuronen, unabhängig von ihrer Größe. Darüber hinaus die intrinsischen elektrischen Eigenschaften zu analysieren, (zB Eingangswiderstand), ist zeitaufwendiger als die einfache Beobachtung eines antidromic Aktionspotential. Neben intrinsischen elektrischen Eigenschaften verwenden, einige Studiemit biocytin Etikettierungen 14,17 s quer Scheiben verwenden, bestätigen ihre Identifizierung durch die Durchführung post - hoc - Analyse der molekularen Marker für die Motoneurone (wie Islet-1/2 16) oder durch die Morphologie zu visualisieren. Solche Kennzeichnungen sind jedoch langwierig und bieten keine direkte Identifizierung. Sie werden daher nur selten systematisch durchgeführt. Einige Studien versucht , den Einsatz von Mauslinien , um eine genetisch kodierte Motoneuron fluoreszierenden Marker exprimieren (Hb9-GFP Mauslinie 18, ChAT-EGFP transgenen Mäusen, die eGFP in cholinergen Zellen einschließlich Motoneuronen 19 oder G85R SOD1-YFP transgenen Mäuse exprimieren, die stark exprimieren das YFP - Fusionsprotein in Motoneuronen 17). Da jedoch der genetische Markerexpression üblicherweise in Zeit und da die Scheiben üblicherweise von Embryonen oder juveniles genommen werden konditioniert wird, wird die Expression des Markers nicht im Alter angemessen die study durchgeführt wird. Andere Studien haben rückläufige Mittelinjektion 34 verwendet das Motoneuron - Pool zu visualisieren. Wir Choleratoxin Beta-Injektionen in die soleus oder der EDL (persönliche Beobachtung) auch durchgeführt. Solche Markierungstechniken sind von großem Wert eines bestimmten Motoneuron-Pool zu beschriften, sondern erfordern langwierige Operation ein paar Tage vor dem Experiment. Darüber hinaus ist die junge Alter, in dem die Scheibe Experimente durchgeführt werden, ist es wesentlich schwieriger, speziell die Muskeln Ziel. Schließlich gibt es ein echtes Anliegen der Motoneuron von Stören durch eine exogene Substanz injiziert wird. Unter optimalen Bedingungen konnten wir antidromic Aktionspotentiale in nahezu alle aufgenommenen Motoneurone zu erhalten. Der 35 ° -Winkel eingesetzt ist kritisch ventral Wurzeln von ausreichender Länge zu erhalten. Abschließend bietet die schräge Scheibe Vorbereitung eine schnelle und zuverlässige Art und Weise jedes Motoneuron zu identifizieren, die zu anderen Identifizierungstechniken überlegen ist. Wie in der Einleitung erwähnt, nur zwei Studien berichtet erfolgreiche Stimulation der ventralen Wurzeln in Querschnitten. Die erste Studie aufgezeichnet zervikalen Neuronen in der Ratte stimuliert und die weiße Substanz , wo der ventralen Wurzel Stutzen 4 austritt. Sie erfolgreich antidrome Aktionspotential in 85% der aufgenommenen Neuronen induziert. Wir glauben, dass ihre hohe Erfolgsquote auf die Tatsache gestützt, dass bei der zervikalen Ebene, die Axone und Somen von Motoneurone auf der gleichen Ebene liegen. Dies ist nicht der Fall in mehr caudal slices. Schon bei der zervikalen Ebene, deren Querscheiben behielt nur Stubs der ventralen Wurzeln, die weniger zuverlässig sind zu stimulieren. Die zweite Studie stimulierte die Hühnerembryo dorso-Lendenwirbelsegment 5. Allerdings verwendeten sie spannungsempfindlichen Farbstoff-Aufnahme, die die räumliche Auflösung fehlte den Erfolg der Induzierung einer antidromic Aktionspotentiale auf Einzelzellebene anzuzeigen. Unsere Scheibe preparatIon bietet auch eine hervorragende Möglichkeit , Renshaw - Zellen zu stimulieren , wie kürzlich in einem Papier 28 angegeben. Mit Hilfe der schrägen Scheiben, waren sie in der Lage monosynaptic Renshaw Zellen - Antworten in 46% der Fälle zu erfassen, die eine wesentliche Verbesserung von 10% Erfolgsrate lag bei angetroffen mit Querschnitten 35. Obwohl wir nicht einen ähnlichen Vergleich zur Stimulation der Motoneuron-Pools, diese Beobachtung in der Renshaw-Zelle führt uns finden konnten, zu glauben, dass Motoneurone auch mehr Konnektivität beizubehalten. Oblique Aufschneiden des Rückenmarks ist eine sehr anspruchsvolle Technik, die zuverlässig viel Übung erfordert, bevor ein Präparat, von dem Erhalt eines aufzeichnen kann. Mit sehr feine und scharfe Pinzette und Mikro-Schere ist von wesentlicher Bedeutung. Die Zeit, zu sezieren kann ziemlich lang sein (bis zu 1 Stunde), solange das gesamte Verfahren in gekühltem Carbogen blasigen Dissektion Medium durchgeführt wird. Während einige Autoren erkennen keinen Nutzen intrakardialer perfusion in der Herstellung von Scheiben 36, beschlossen wir , diesen Schritt des Verfahrens aufrecht zu erhalten. Es ist schwer, den Vorteil der intrakardialen Perfusion für die Qualität der Aufnahmen objektiv zu messen, vor allem, weil es mit dem Alter ändert. Der wichtigste Faktor ist die Maus Alter. Wir nahmen erfolgreich von Mäusen zwischen P2 und P11 das obige Protokoll verwendet. Historische diesem Alter wird das Rückenmark Myelin zu dicht und die größten Zellen (die Motoneurone) sterben vor dem Schneiden, höchstwahrscheinlich wegen Sauerstoffmangel. Nach diesem Fenster, fanden wir es immer schwieriger, gesunde Scheiben zu erhalten. In jüngster Zeit wurden neue Techniken berichtet worden , bei älteren Tieren 17,36 gesunde Scheiben zu erhalten. Sie benutzten zusätzliche Additive , um ihre Sezieren und Aufzeichnungsmedium wie ergänzende Energiequellen (Ethyl-Pyruvat), geringere Na + und Cl - Konzentrationen Onkose der Zellen 37,38 und Polyethylenglykol zu verhindern , dass die eff zu begrenzenjekte der umfangreichen Membran, die während des Schneidens Querschnitten erhalten auftreten. Mit solchen Verbesserungen konnten sie von bis zu 6 Monate alten Tiere aufzunehmen. In Zukunft wäre es interessant, schräge Schnittpräparate bei erwachsenen Tieren, um zu versuchen, die Vorteile der beiden Techniken kombinieren. die beiden Protokolle Die Kombination sollte relativ einfach nachweisen und ein zuverlässiges Werkzeug Motoneuron Identität zu bestätigen und zu studieren, die Bevölkerung von Axonkollateralen von Motoneuronen in erwachsenen Mäusen gezielt bereitzustellen. Darüber hinaus könnte man versuchen, schräge Scheiben im Embryo Maus zu erhalten. Bemerkenswert unserer Zubereitung behält auch die dorsalen Wurzeln, die das Rückenmark, sowie die Aktivierung von dorsal neuronaler Populationen stimuliert werden kann , um die Aktivierung monosynaptic I a Innervation der Motoneuronen zu studieren. Abschließend bieten Ventralwurzel Stimulationen ein zuverlässiges Werkzeug Motoneuron Identität zu bestätigen und die Bevölkerung von Motoneuron Axonkollateralen gezielt zu untersuchen. &lt;/ P&gt;

Historisch gesehen , in vivo an großen Tieren wie Katzen oder Ratten Motoneuron Aufnahmen scharf Elektrode 1 wurden durchgeführt , oder auf einem isolierten ganzen Rückenmark in Mäuse 2. Die Entstehung der Patch-Clamp-Aufnahmetechnik in den 1980er Jahren für den direkten Zugriff auf das Motoneuron genannt somas nach Bedarf Abdichtung unter Sichtführung erreicht werden. Somit wurde das Rückenmark slice Zubereitung leicht seit den frühen 1990ern 3 erreicht. Jedoch oft früh slice Zubereitung nicht für die Stimulation der ventralen Wurzeln ermöglichen. Nach bestem Wissen und Gewissen, haben nur zwei Studien erfolgreich Stimulation der ventralen Wurzeln in Querschnitten berichtet, und keiner wurde von den Mäusen 4,5 erhalten. In diesem Artikel stellen wir eine Technik tragfähige Rückenmarksscheiben neugeborenen Mäusen zu erreichen (P2 - P11) in dem die Motoneuron-Pool seiner ventralen Wurzel abzuweichen Axone beibehält. auslassenral Wurzel Stimulation löst antidromic Aktionspotential aus dem gleichen Ventralwurzel zurück in die Somen des Motoneuron-Pool zu verlassen. Es regt auch die Motoneuron Sicherheiten Ziele, andere Motoneuronen 6-10 und die Renshaw - Zellen 11-13. Da nur Motoneurone ihre Axone die ventralen Wurzeln nach unten senden, verwenden wir die Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale als eine einfache und sichere Weg um physiologicaly Motoneuronen 10 identifizieren. Neben der Verwendung von potenziell nicht-inclusive oder irreführende elektrophysiologischen und morphologischen Kriterien , um die Motoneuron Identität, die jüngsten Studien über Rückenmark Motoneurone zu bestätigen stützen sich ebenfalls auf mühsame und zeitraubende Post - hoc - Anfärbungen 16. Eine solche Identifizierung wird in der Regel nur durchgeführt mit einer Probe der aufgezeichneten Zellen. Andere Identifikationsstrategien setzen auf Mauslinien, in denen die Motoneurone endogene Fluoreszenz exprimieren <sup&gt; 17-19. Doch bereits in jungen Jahren mit genetisch kodierten Markierungen kann schwierig sein, wenn Markerexpression noch variabel ist oder wenn die Studie erfordert bereits eine transgene Mauslinie verwendet wird. Alternativ kann antidrome Aktionspotentialaufzeichnungen routinemäßig auf allen Mäusen vom Beginn der Zellaufnahme erfolgen. Experimentatoren arbeiten an intakten Rückenmark Vorbereitungen bei der Katze, Ratte und Maus haben zuverlässig solche Identifikationstechniken seit den 1950er Jahren 1,2,20,21 verwendet. Bei optimalen Bedingungen konnten wir antidromic Aktionspotentiale aus praktisch alle aufgenommenen Motoneurone zu entlocken. Darüber hinaus können Ventralwurzel Stimulation verwendet werden , um zuverlässig andere Motoneurone 22,23 oder ihre Ziele begeistern. die Renshaw Zellen 10,24,25. Wir präsentieren hier Anwendungen der Ventralwurzel Stimulation in Form von antidromic Aktionspotential Aufnahmen von Motoneuron somas sowie Anregung von Renshaw Zellen.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>dissolves better then other brands</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium hydroxide solution</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation

Elektrophysiologische Aufnahmen von Rückenmark Scheiben haben sich als wertvolle Technik zu sein, ein breites Spektrum von Fragen zu untersuchen, die von Mobilnetzwerkeigenschaften. Wir zeigen, wie rentabel schräge Scheiben des Rückenmarks von jungen Mäusen herzustellen (P2 - P11). Bei dieser Herstellung behalten die Motoneuronen ihre Axone von den ventralen Wurzel des Rückenmarks kommen aus. Die Stimulation dieser Axone entlockt zurück ausbreitenden Aktionspotentiale der Motoneuron somas und spannend die Motoneuron Kollateralen im Rückenmark eindringen. Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale ist eine sofortige, endgültige und elegante Art und Weise Motoneuron Identität zu charakterisieren, die andere Methoden Identifizierung übertrifft. Darüber hinaus ist die Motoneuron Kollateralen stimulierenden eine einfache und sichere Weg, um die Sicherheit Ziele der Motoneuronen im Rückenmark, wie andere Motoneuronen oder R zu erregenenshaw Zellen. In diesem Protokoll stellen wir antidrome Aufnahmen von der Motoneuron somas sowie Renshaw Zellanregung aus ventral root Stimulation.

Bestätigung der Motoneuron Identität Mit antidromen Aktionspotentialen Zell - Targeting Motoneurone sind im ventralen Horn (sichtbar in rot in 2C) gefunden. Starten Sie aus dem Bündel von Axonen der ventralen Wurzel bildet, und gehen bis das Bündel streut voll und man beginnt, große Zellen zu sehen (lange soma Achse, über 20 &amp; mgr; m). Erreichen whole-cell Aufnahme eines runden gesund aussehendes Zelle eine Elektrode Anfangswiderstand von 3 bis 4 M &amp; OHgr verwenden. Die interne Lösung verwendet wurde, enthielt: 140 mM K-Gluconat, 6 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na 2 GTP. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 mit KOH, und die Osmolarität auf 285-295 mOsm mit destilliertem Wasser zugesetzt. <strong&gt; Bestätigung der Motoneuron Identität Sobald Ganzzellaufnahme erreicht wird, eine einzelne zweiphasige Stimulation des ventralen Wurzel gelten (1 - 50 V, 0,1 bis 0,3 ms) ein antidromic Aktionspotential in den aufgenommenen Zellen des ventralen Schnur zu entlocken Figuren 3A1 und 3A2 zeigen antidromic Aktion. Potentiale in Voltage-Clamp oder Strom-clamp, respectively. Wenn die Stimulationsintensität von 1 bis 5 V zu erhöhen (Abbildung 3A1) und von 10 bis 15 V (Abbildung 3A2) die antidromic Aktionspotential erscheint in einem Alles-oder-nichts - Mode mit einer Latenzzeit von 0,9 ms und 1,1 ms sind. Da nur Motoneurone ihre Axone durch die ventralen Wurzeln zu senden, ist die antidromic Aktionspotential ein Beweis für die Zellidentität. In einer Minderheit der Motoneurone (ca. 10%), scheiterte Ventralwurzel Stimulationantidromic Aktionspotential auslösen , sondern löste orthodrome Aktionspotentiale. Die Figuren 3B1 und 3B2 zeigen orthodrome Aktionspotentiale in Voltage-Clamp oder Stromklemme verbunden. Wenn die Stimulation von 20 bis 30 V (Abbildung 3B1) zu erhöhen und von 25 bis 40 V (Abbildung 3B2), erscheint ein Aktionspotential, eine frühere exzitatorischen postsynaptischen Strom folgende (EPSC) oder exzitatorischen postsynaptischen Potentials (EPSP). Die Latenzen der Aktionspotentiale sind länger (5,1 msec und 5,3 msec, respectively). In diesen beiden Zellen löste die Ventralwurzel Stimulieren eines Feed-Forward-Anregung (Motoneurone Axonkollateralen sich senden und zu anderen Motoneurone), die stark genug war, ein orthodrome Aktionspotential zu entlocken. In derartigen Zellen eine antidrome Aktionspotential auslösen das Versagen (gekennzeichnet durch seine Alles-oder-nichts-Mode und einer Latenz von weniger als 5 msec) sagt uns ar schließen, dass diese Zellen nicht zulassen,<html> e Motoneurone. Man beachte, daß die Intensität erforderlich Stimulation hervorzurufen Vorwärtserregungs ist höher als die benötigte eine antidrome Aktionspotential hervorzurufen. Alle hier gezeigten Stimulationen sind 0,1 msec aber manchmal mehr Stimulation (bis zu 0,3 ms) erforderlich sein kann, eine antidrome Aktionspotential hervorzurufen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig3.jpg" /> Abbildung 3. Motoneuron Responses to Ventralwurzel Stimulation A1: 1 V (rote Kurve) und 5 V (schwarze Kurve) Stimulationen A2:.. 10 V (rote Kurve) und 15 V (schwarze Kurve) Stimulationen B1: 20 V (rote Kurve) und 30 V (schwarze Kurve) Stimulationen . B2: 25 V (rote Kurve) und 40 V (schwarze Kurve) Stimulationen. Schwarze Punkte zeigen Reiz Timing. Doppelpfeilspitzen betonen den Unterschied in der Latenzen zwischen Ortho- und antidromic Spikes.m / files / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Renshaw Zellstimulation Zell - Targeting Renshaw Zellen im Vorderhorn 27,28 gefunden. Visualisieren Sie die Axon-Bundles mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bildgebung ein 20X und ein 63X Ziele verwenden. Starten Sie aus dem Bündel von Axonen der ventralen Wurzel bildet , und gehen bis die Axone zu zerstreuen beginnen , aber sind noch erkennbar (Abbildung 4A, Pfeile). Ziel ist für die Zellen mittlerer Größe (etwa 10 bis 15 &amp; mgr; m im Durchmesser, 4A, Pfeilspitzen). Erzielen Sie whole-cell Aufnahme eines runden gesund aussehende Zelle eine Elektrode aus anfänglichen Widerstand von 5 bis 7 MOhm mit. Je nach Experiment verwendeten wir either Cs + -basierten oder K + -basierte interne Lösungen 10. Die Cs-basierte Lösung verhindert große Kaliumströme, die um -45 mV sichtbar waren. In einigen Experimenten haben wir auch 5 mM QX-314 die Natriumkanäle, die für Spiking in dem aufgezeichneten Zelle zu blockieren. Die Cs + -basierte Lösung enthält: 125 mM Cs-Gluconat, 5 mM QX-314 Cl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 1 mM CaCl 2, 4 mM Mg-ATP und 0,4 mM Na-GTP, wobei der pH eingestellt auf 7,3 mit CsOH. Die K + -basierte Lösung sollte sowohl in spannungs- und stromKlemme, die Renshaw Zellantworten auf ventralen Wurzel Stimulation in Bedingungen annähert , so viel wie möglich die physiologischen diejenigen zu analysieren verwendet werden. Diese Lösung enthält: 125 mM K-Gluconat, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2, 4 mM Mg-ATP, 0,4 mM Na-GTP, wobei der pH auf 7,3 mit KOH eingestellt. Die Reizstärke zwischen 10 und 100 V und die Dauer variiert, variiert zwischen 50 und 300 &amp; mgr; s. Bipo<html> lar Pulse wurden in allen Fällen verwendet. Antwort der Renshaw - Zellen zu Ventralwurzel Stimulation Die Stimulation des ventralen Wurzel löst die corelease von Glutamat und Acetylcholin aus Motoneuron Kollateralen auf die Renshaw Zellen 10. Feed-Forward - Hemmung vermittelt durch GABA und Glycin rekrutiert auch 10. 4B zeigt Antworten auf die einzelnen Stimulation des ventralen Wurzel. Die Zelle wurde in einen Voltage-Clamp-Modus mit dem Cäsium-basierten Lösung aufgezeichnet, und bei einer Spannung von -45 mV gehalten. QX-314 in der intrazellulären Lösung verhindert die Zelle von Brennen und GABA und Glycin-Antworten wurden von 3 uM Gabazin blockiert und 1 &amp; mgr; M Strychnin, respectively. Der nach innen gerichtete synaptischen Stroms in 4B ist die Summe der glutamatergen und Nikotin Ströme. <html> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig4.jpg" /> Abbildung 4. Renshaw - Zell - Stimulation aus der Ventralwurzel A: Bilder der Renshaw - Zellpools erworben einen schrägen Kondensator in derselben Schicht genommen bei zwei verschiedenen Vergrößerungen (20x und 40x - Objektive) verwendet wird . Beachten Sie die Motoneuron Axone in die Ventralwurzel verschmelzenden (Pfeil). Vermeintliche Renshaw-Zellen werden mit Pfeilen angezeigt. Maßstabsbalken: 100 &amp; mgr; m in A1, 50 &amp; mgr; m in A2 . B: Voltage-Clamp - Aufnahmen einer Renshaw Zelle nach Stimulation des ventralen Wurzel (schwarzer Punkt). Die rote Kurve ist der Durchschnitt der grauen. Haltespannung wurde auf -45 mV eingestellt. QX-314 in der intrazellulären Lösung verhindert die Zelle von Brennen und GABA und Glycin-Antworten wurden von 3 uM Gabazin blockiert und 1 &amp; mgr; M Strychnin sind. Schwarzer Punkt zeigt an Reiz Timing.com / files / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Wir zeigen, wie schräge Scheiben des Rückenmarks in jungen Mäusen vorzubereiten. Diese Herstellung ermöglicht die Stimulation der ventralen Wurzeln.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Aufrufe.  Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes.  Wir zeigen, wie schräge Scheiben des Rückenmarks in jungen Mäusen vorzubereiten. Diese Herstellung ermöglicht die Stimulation der ventralen Wurzeln. 

Serie: The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biologie

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

Die Reaktionen von Motoneuronen auf die Stimulation des Rückenmarks verstehen

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Author Spotlight: Advancing Spinal Cord Stimulation - Erforschung der zellulären Reaktionen von Motoneuronen durch Patch-Clamp-Elektrophysiologie 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

Die Ex vivo Präparation eines Rückenmarksschnitts für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in Motoneuronen während der Rückenmarkstimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...