Name: spin saturation transfer difference nmr (sstd nmr): a new tool to obtain kinetic parameters of chemical exchange processes
Uploaded: 2016-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spin Saturation Transfer Difference NMR SSTD NMR: A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes at JoVE.com

Funding by the University of East Anglia, the EPSRC (EP/L012855/1) and the EU (H2020-MSCA-IF-2014-EF-ST-658172) is gratefully acknowledged (MTQ).

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. 1. NMR-Probenvorbereitung <ol><li> Wiegen 5 mg N, N - Dimethylacetamid, in den ein NMR - Röhrchen geeignet für niedrige Temperaturen und lösen sich in 0,6 ml Toluol - d 8. </li></ol> 2. NMR Experimenteller Aufbau 25 <ol><li> NOE Spectra Acquisition <ol><li> Führen Sie eine eindimensionale NOE (Nuclear - Overhauser - Effekt) Experiment. 26 HINWEIS: NOE-Effekte bei jeder Temperatur passieren kann. Eine eindimensionale NOE-Spektrum das Signal Bestrahlen, die in der SSTD NMR Experiment bestrahlt wird, bei -40 ° C wurde aufgezeichnet, um sicherzustellen, dass die Rotation und die Magnetisierungstransfer in der Probe hier verwendet wurde, minimiert und somit die NOE, falls vorhanden, würde vorherrschen und in diesem Experiment gemessen werden. Idealer shoul, NOE-Effekte zwischen den beiden Austauschkerned nicht vorhanden sein, Interferenzen mit dem SSTD Verfahren zu vermeiden. </li></ol></li><li> SSTD NMR-Experimente-Setup <ol><li> Legen Sie die Probe im Magneten durch erste Typisierung ej in der Befehlszeile der Software auf den Luftstrom einzuschalten. Dann legen Sie die Probe auf der Oberseite des Magneten und dann ij geben. Warten Sie, bis die Probe innerhalb des Magneten ist. </li><li> Sobald die Probe im Magneten, Typ versehenes Werkzeug in der Befehlszeile. Ändern, um die Temperatur auf die erste ausgewählte Temperatur das Experiment durchzuführen (295,5 K in diesem Fall). Lassen Sie die Probe für mindestens 20 min bei der gewählten Temperatur zu stabilisieren. </li><li> Durchführen einer 1D - 1 H-NMR - Experiment an der Probe. <ol><li> Erstellen Sie einen neuen Datensatz einer 1 H-NMR - Experiment. Dazu klicken Sie auf Datei / Neu und nennen Sie das neue Experiment. </li><li> Geben Sie nacheinander und wartet auf den vorherigen Befehl zu beenden: lock, Atma, topshim, getprosol und RGA. </li><li> Geben Sie &lt;em&gt; zg das Proton Experiment zu erwerben. Sobald sie es verwandeln Typ EFP und apk Fourier beendet ist und die Phase einzustellen. </li></ol></li><li> Erstellen Sie einen neuen Datensatz von zum Beispiel ein 1 H - NMR - Experiment. Dazu klicken Sie auf Datei / Neu und nennen Sie das neue Experiment. </li><li> In diesem neuen Datensatz, geben Sie in der Befehlszeile rpar. Wählen Sie eine der &quot;STDDIFF&quot; Parametersätze aus der Liste, zum Beispiel STDDIFFESGP, und klicken Sie auf &quot;lesen&quot; und dann &quot;Alle&quot; (Abbildung 1). Alternativ dazu tun dies , indem alle rpar STDDIFFESGP eingeben. HINWEIS: Das Experiment kann mit dieser Impulsfolge durchgeführt werden. Jedoch verwendet das Impulsprogramm in unserem Experiment war STDDIFF. </li><li> Um die STDDIFF Pulssequenz auszuwählen, klicken Sie auf die Schaltfläche mit den drei Punkten in der PULPROG Linie (Abbildungen 2 und 3). </li><li> Bevor die SSTD NMR - Experiment durchgeführt wird , kalibrieren 1 H 90 ° hart pulse (p1). Zu diesem Zweck ist sicherzustellen, dass die Probe in dem Magneten ist, bei der gewünschten Temperatur (Schritt 2.2.2). Geben Sie pulsecal in der Befehlszeile und kopieren Sie den Wert des 90 ° Impulses bei der höheren Leistung (PL1 = -1 dB in diesem Fall), dh derjenige, der den kürzesten Impuls (Abbildung 4) ergibt. </li><li> Einzuführen, um die Werte für die kalibrierte Fest Impuls in dem Experiment. Typ getprosol 1H (Wert für p1 in Schritt 2.2.7) erhalten (Wert für PL1) (Abbildung 5). </li><li> Stellen Sie die Länge des geformten Pulses. Typ p13 und stellen einen Wert von 50.000 &amp; mgr; s (Abbildung 6). </li><li> Stellen Sie den selektiven Pulsform. Um dies zu tun, zur Macht gehen und klicken Sie auf den &quot;Bearbeiten ...&quot; , um SHAPE (Abbildung 7). Gehen Sie auf die geformten Puls 13 und wählen: Gaus 1,1000 (Abbildung 8). </li><li> Stellen Sie die selektive Impulsleistung (SP13). Setzen Sie ihn auf etwas angemessen, das heißt </em&gt;, Auf diesem System zwischen 40-60 dB (entsprechend einer Feldstärke von etwa 120 Hz) (Abbildung 8). Zu hohe Feldstärken können zu nicht akzeptablen Sättigungseffekten führen. 27-29 HINWEIS: 50 dB war optimal in unserem Fall. Berücksichtigen Sie, dass dies ein Dämpfungsskala, also je kleiner der Wert, desto höher die Leistung der Radiofrequenz. Wie es um die sättigenden Gaussian Kaskade entspricht, die für lange Zeit (mehrere Sekunden) angewendet wird, sollte SP13 nicht unter 40 dB gehen (falls nötig, konsultieren Sie die Gerätespezifikationen, so lange Pulse mit hoher Leistung die Probenkopf beschädigen könnte). Nach unserer Erfahrung 41-61 dB über die Abschwächung der harten 1 H 90 ° Impuls (-1 dB in dieser Arbeit) funktioniert gut. Versuchen Sie, immer die höchste Dämpfung auswählen möglich, die zu ähnlichen Sättigungsniveau. </li><li> Geben ns und setzen Sie ihn auf 8 und geben Sie ds und setzen Sie ihn auf 4. </li></ol></li></ol> 3. NMR-Datenerfassung eind Verarbeitung 25 <ol><li> SSTD NMR Experiment Acquisition <ol><li> Öffnen Sie die 1 H - NMR - Experiment durchgeführt , in Schritt 2.2.3 zu prüfen , wo das Signal , das ist bestrahlt wird. Dazu das Experiment in der Software-Browser suchen, klicken Sie rechts im Datensatz und klicken Sie auf &quot;Anzeige in einem neuen Fenster&quot;. </li><li> Bewegen Sie den Cursor-Linie in die Mitte des Signals zu bestrahlen und notieren Sie sich die chemische Verschiebung in ppm. Wählen Sie die spektrale Breite, die in dem Experiment verwendet. HINWEIS: In diesem Fall wird das Signal, welches bestrahlt wird, ist bei 2,17 ppm, und die spektrale Breite verwendet wurde, war 1,46 ppm. Stellen Sie sicher, dass keine chemische Verschiebung Korrektur verwendet wird, oder die Bestrahlungsfrequenz kann falsch eingestellt. </li><li> Gehen Sie auf die zuvor erstellte SSTD NMR-Experiment mit dem in Abschnitt 2.2 genannten Einrichtung. </li><li> Erstellen Sie eine Liste mit den Frequenzen der Bestrahlung. Dazu geben Sie in der Befehlszeile fq2list und eine bestehende Liste aus. </li><li> Bearbeiten Sie die ListeBestrahlungsfrequenzen einschließlich der folgenden Daten in den drei ersten Reihen (Abbildung 9): Zeile 1. P (zeigt an, dass die folgenden Daten in ppm); Row 2 Frequenz des Signals in ppm bestrahlt werden, wie in 3.1 gemessen.. 1; Reihe 3,40 ppm (eine Frequenz , die weit von den 1 H - Signale der Verbindung ist , so dass die Bestrahlung in dieser Frequenz nicht die Spektren nicht beeinträchtigt). </li><li> Speichern Sie die Liste mit einem neuen Namen und dann in der Befehlszeile eingeben fq2list und wählen Sie die Liste gerade erstellt haben . </li><li> Zur Zentrierung das Experiment auf die Signale untersuchten Typ O1P und wählen Sie als das Zentrum des Experiments die chemische Verschiebung des Signals , das bestrahlt wird. </li><li> Typ sw die spektrale Breite zu wählen (1,46 ppm in diesem Fall, aber auch jede andere spektrale Breite kann gewählt werden). HINWEIS: Wenn die Erfassungszeit erhalten, nachdem die spektrale Breite zu ändern ist zu lang (die mehr Rauschen in den Spektren einführen wird) es can eingestellt werden , AQ , indem Sie den gewünschten freien Induktionszerfalls (FID) Auflösung (FIDRES, 0,25 Hz in diesem Fall) zu liefern. </li><li> Wählen Sie den Wert für die Inter Relaxationsdelay D1. Sicherzustellen , dass sie mindestens 1 bis 5 - fachen Wert der T 1 des langsamsten entspannend Proton. HINWEIS: Wir setzen auf 40 sec auf, die die längste Sättigungszeit (D20) in dem Experiment ist. Auf diese Weise allen Versuchen halten die gleiche Gesamt &quot;pro Scan&quot; Zeit (Verzögerung + Sättigungszeit + Pulse + Erfassungszeit). </li><li> Typ D1 und setzen Sie ihn auf 40 sec. </li><li> Stellen Sie den ersten Wert für die Sättigungszeit von D20 eingeben und es bis zu 40 Sekunden einstellen. Bestimmen Sie die Empfängerverstärkung (rg) automatisch durch RGA eingeben. </li><li> Erstellen Sie das nächste Experiment , indem Sie iexpno. Typ D20 und eine Sättigungszeit von 20 sec in diesem Experiment aus. Typ RGA automatisch rg bestimmen. </li> &lt;li&gt; Wiederholen Sie den letzten Schritt für D20 = 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3 Sek. </li><li> Nachdem alle Versuche erstellt werden, öffnen Sie die erste und in der Art multizg Befehlszeile und geben Sie die Anzahl der Versuche, 8 in diesem Fall (dh multizg 8). </li></ol></li><li> SSTD NMR Experiment Verarbeitung <ol><li> Öffnen Sie die PROCNO 1 (Prozessnummer) von EXPNO 1 (Experiment Nummer) des Satzes (die mit der höheren Sättigungszeit). </li><li> In der Art lb Befehlszeile und den Wert auf 1,5 eingestellt. HINWEIS: Bei Spektren mit sehr hohem Signal-zu-Rausch-Verhältnisse dieser Wert verringert werden kann; Umgekehrt könnte es für noisy Experimente erhöht werden, wenn die spektrale Auflösung nicht schwerwiegend beeinträchtigt wird. </li><li> In der Befehlszeile Typ EFP und Prozess FID # = 1 ( &quot;on-Resonanz&quot; Spektrum) in PROCNO = 2 (Abbildung 10). </li><li> Korrigieren Sie die Phase des Experiments durch die interaktive Phasenkorrektur b klickenutton und sie als 2D-Experiment speichern. Speichern und Beenden (Abbildung 11). </li><li> Typ rep 1 in der Befehlszeile zu dem PROCNO 1 zu gehen. </li><li> In der Befehlszeile Typ EFP und Prozess FID # = 2 ( &quot;off-Resonanz&quot; Spektrum) in PROCNO = 3 (Abbildung 12). </li><li> In der Befehlszeile Typ .md und dann 2 rep ein mehrere Anzeigefenster mit beiden verarbeiteten Spektren zeigen: 2 (der mit dem Signal in der Mitte gesättigt) und 3 (demjenigen , in dem der sättigenden Impulsfolge bei 40 ppm angewandt wurde ) (Abbildung 13). </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche mit einem Delta - Zeichen (Abbildung 13) , um den Differenzspektren zu berechnen und sie in PROCNO 4. Beenden Sie das mehrere Anzeigefenster speichern. </li><li> Wählen Sie eine Integrationsbereich für das Signal auf der linken Seite (das Signal, in dem die Übertragung der Sättigung aufgrund der chemischen Austauschprozess wird beobachtet werden). Immer integrieren, um die Region in PROCNO 3 und PROCNO 4. <br/&gt; Hinweis: Der Bereich Integration in diesem Experiment verwendet wurde, 2,55-2,67 ppm. </li><li> Einmal integriert, gehen Sie auf die &quot;Integrale&quot; Reiter in jedem der Experimente , und kopieren Sie den Wert von &quot;Integral [abs]&quot; (Abbildung 14). </li><li> Teilen Sie das Integral in PROCNO 4 durch das Integral in PROCNO 3. dass der Wert von η SSTD für eine Sättigungszeit von 40 sec (η SSTD = Spin Sättigungstransfer - Differenz - Parameter). 21 </li><li> Wiederholen des Verfahrens für den Rest der Versuche mit unterschiedlichen Sättigungszeiten. </li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse 30 <ol><li> Die Analyse der Daten der kinetischen Parameter zu erhalten <ol><li> Zeichnen Sie die erhaltenen η SSTD Werte im Vergleich zum Sättigungszeit. 21 </li><li> Führen Sie eine exponentielle Anpassung der erhaltenen Kurven der Gleichung einzustellen <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq1.jpg" /> <img alt = &quot;Gleichung 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54499 / 54499eq2.jpg&quot; /&gt; <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq3.jpg" /> = <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq4.jpg" /> bei sehr langen Sättigungszeit t = Zeit </li><li> Berechnen der Werte von η SSTD MAX und δ und nutzen sie die Werte der Geschwindigkeitskonstanten (k) und Relaxationszeiten (T 1A) gemäß den folgenden Gleichungen zu berechnen: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq5.jpg" /> T1A = longitudinale Relaxationszeit Konstante von Spin A k = gegenseitigen Ort-Austausch-Konstante kinetische Geschwindigkeit <ol><li> Besorgen Sie sich die kinetische Geschwindigkeitskonstante von: <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq6.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Eyring Plot der thermodynamische Parameter zu erhalten <ol><li> Plot ln (k / T) gegen 1 / T (T = absolute Temperatur), die Werte des kine mit<html> tic Raten bei verschiedenen Temperaturen. </li><li> Führen Sie eine lineare Anpassung der Daten erhalten, um die Eyring-Gleichung anpassen: <img alt="Gleichung 7" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq7.jpg" /> <img alt="Gleichung 8" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq8.jpg" /> <img alt="Gleichung 9" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq9.jpg" /> <img alt="Gleichung 10" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq10.jpg" /> R = Gaskonstante k B = Boltzmann - Konstante T = absolute Temperatur </li><li> Berechnen Sie die thermodynamischen Parameter &amp; Delta; H ≠ und &amp; Delta; S ≠. </li><li> Berechnen Sie die Werte für E A (298) und &amp; Delta; G ≠ (298) unter Verwendung der folgenden Gleichungen: <img alt="Gleichung 11" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq11.jpg" /> <img alt="Gleichung 12" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq12.jpg" /> s / ftp_upload / 54499 / 54499eq13.jpg &quot;/&gt; <img alt="Gleichung 14" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq14.jpg" /> </li></ol></li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Internal+Rotation+of+N,N-Dimethylacetamide:+A+Spin-Saturation+Transfer+Experiment.">Kinetics of Internal Rotation of N,N-Dimethylacetamide: A Spin-Saturation Transfer Experiment.</a> J. Chem. Ed. 74, 978-982 (1997).</li><li>Forsen, S., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+Rates+by+Nuclear+Magnetic+Multiple+Resonance.+III.+Exchange+Reactions+in+Systems+with+Several+Nonequivalent+Sites.">Exchange Rates by Nuclear Magnetic Multiple Resonance. III. Exchange Reactions in Systems with Several Nonequivalent Sites.</a> J. Chem. Phys. 40, 1189-1196 (1964).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

One of the more obvious advantages of this methodology is that the rate constants and the relaxation time for a given temperature can be obtained with a single set of experiments, with a robust pulse sequence (the same used for STD experiments to study protein-ligand interactions, which is typically found within the available set of experiments from the spectrometer manufacturer). This simplifies the experimental setup since there is no need to measure T1 or reach steady state saturation. Besides, it is remarkable that this method does not depend on the magnet strength, as coalescence methods. On the other hand, the main limitation is that this technique cannot be applied to chemical exchange processes too fast or too slow, which would depend on the temperature range of the NMR machine or the solvents used.
This new technique for the calculation of kinetic parameters can be applied to a great variety of substrates and its applicability has already been demonstrated with some interesting molecules.21 The kinetic parameters of the 4-N,N-dimethylamido[2.2]paracyclophane, a challenging substrate in which the signal of one of the methyl groups of interest is overlapped with other signals from the molecule, were successfully calculated using SSTD NMR. Interestingly, this methodology can be applied as long as one of the signals of study is isolated. SSTD NMR is also a useful protocol for the calculation of kinetic parameters in molecules in which the coalescence temperature is so high that the molecule decomposes before reaching it. This is the case with PtCl2(dimethylallene)(pyridine), in which the methodology was successfully applied without the need of reaching coalescence. The choice of solvents and temperatures is critical to obtain good results, since the chemical exchange rates can vary significantly with these parameters. Moreover, in addition to the criteria in a normal NMR experiment, key steps in a SSTD NMR experiment are the selectivity of the irradiation as well as the temperature control. Both factors have to be precise to guarantee the success of the experiment.
The representative results presented here are for the kinetics of intramolecular chemical exchange, but the technique can also be applied to study the kinetics of intermolecular chemical exchange and also ligand exchange, common processes in the dynamic behavior of transition metal complexes. 
Finally, providing a proper modification of the equations is made,32 this method could be extended to deal with multi-site exchange and unequal populations, as it has been done in former double resonance experiments,8-9 increasing the usefulness of this technique for the study of chemical exchange processes in challenging compounds.

Chemische Austausch bezieht sich allgemein auf jede inter- oder intramolekularen Prozess, in dem ein Kern von einer Umgebung in eine andere bewegt, in der seine NMR-Parameter (chemische Verschiebung, skalare Kopplung, dipolaren Kopplung, Relaxationsrate) unterscheiden. Es gibt zahlreiche Beispiele von chemischen Austausch in der organischen und metallorganischen Moleküle (zB Rotationsbarrieren in Biarylen, Ring Spiegeln Barrieren und Konformationsgleichgewicht, Stickstoff Inversion, die Ligandenbindung, degenerierten Ligandenaustausch und Tautomerisierung). 1-3 Die chemische Wechselkurs wird im Zusammenhang mit die Thermodynamik der Barriere des Austauschprozesses und damit seine Studie ist von entscheidender Bedeutung, Molekulardynamik dieser Systeme zu verstehen. Das klassische Zeichen des dynamischen Austausch in der NMR ist eine dramatische Veränderung in der Linienform der NMR-Signale, wie sich die Temperatur ändert. Bei niedrigen Temperaturen ist das Verfahren langsam und zwei unterschiedliche chemische Verschiebungen sind Beobachved. Bei hohen Temperaturen verschmelzen die beiden Signale zu einem Signal, das als &quot;Koaleszenz&quot; bekannt ist. Bei mittleren Temperaturen, werden die Signale sehr breit. Diese Empfindlichkeit des NMR-Spektrums zu chemischen Austausch macht NMR eine sehr leistungsfähige Methode, um die Dynamik von Molekülen in Lösung zu untersuchen. Zwei Methoden wurden bei der Untersuchung von dynamischen Prozessen in Lösung , die hauptsächlich verwendet. Linienformanalyse, 4-7 und Spinsättigungstransfer Experimente 8-9 Außerdem ist es auch erwähnenswert ist die Umkehrung Übertragungsverfahren 10 und das CIFIT Programm 11 für die direkte Extraktion von Geschwindigkeitskonstanten, die eine relativ effizienten Ansatz für den Austausch Messungen in einfachen Systemen sind. Obwohl diese Verfahren in den meisten Fällen sehr gute Ergebnisse liefern, sie haben jedoch eine Reihe von Nachteilen. Der Hauptnachteil der Linienformanalyse sind die hohen Temperaturen in einigen Proben zu erreichen Verschmelzen benötigt wird . 12 Die wichtigsten Fragen , wenn ca zu berücksichtigenrrying out Spinsättigungstransferexperimente sind: die sehr lange Sättigungszeiten erforderlich , um den stationären Zustand Sättigungstransfer zwischen den Austauschstellen zu erreichen, und die Notwendigkeit , die longitudinale Relaxationszeit, T 1, um zu bestimmen , was schwierig sein kann , wenn es eine Überlappung der verschieden ist Signale im Bereich der Studie. 13 Im Rahmen unserer Untersuchungen in organometallische Mechanismen ist 14-16 unsere Gruppe das fluktuierende Verhalten von Platin-Allenkomplexe in Lösung zu studieren. Dies ist eine komplexe Aufgabe, die mindestens drei verschiedene Prozesse beinhaltet, von denen die π-face wobei Austausch oder Drehung des Metalls um einen der Allenachse. Wir stießen auf, dass normale VT Experimente und Linienformanalysetechniken , die zuvor in ähnlichen Systemen verwendet wurden, 17-19 in unserer Studie nicht geeignet waren, aufgrund einer sehr langsamen Drehung in unserem Platin-Allen - Komplex, der die Koaleszenz Temperatur des aus signals von Interesse höher als die Temperatur der Zersetzung des Komplexes. Um diese Einschränkung zu überwinden, die wir entwickelt und vor kurzem berichtet , ein neues NMR - Protokoll (SSTD NMR) Prozesse der gegenseitigen Ort chemischen Austausch zu studieren. 20 Wie der Name dieser Methode schlägt die Spin Sättigung Transfer - Methode für kleine Moleküle verwendet , kombiniert mit der Sattigungsubertragung Difference NMR - Methode für die Untersuchung von Protein-Ligand - Interaktionen eingesetzt, 21-24 durch transiente Spinsättigungstransfer Messung entlang Sättigungszeiten zu erhöhen (build-up - Kurven) in kleinen Molekülen chemische Austausch unterzogen. Mit dieser neuen Methode (SSTD NMR) haben wir gezeigt, dass wir die kinetischen Parameter der intramolekularen chemischen Austausch in kleinen organischen und organometallischen Molekülen einige zusätzliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen erhalten: Koaleszenz der Signale nicht erforderlich ist, so dass ein flexibler Temperaturbereich kann verwendet werdenin der Studie; Signalüberlappung nicht stört, obwohl mindestens eine der Austausch Resonanzen getrennt werden sollte; besteht keine Notwendigkeit , T 1 oder eingeschwungenen Zustand erreichen die Sättigung zu messen; Geschwindigkeitskonstante Werte werden direkt und T &amp; sub1 ; -Werte gemessen werden , in dem gleichen Experiment erhalten wurde , nur eine Reihe von Experimenten unter Verwendung von . Ein weiterer bemerkenswerter Vorteil der SSTD NMR Methodik ist, dass im Gegensatz zur Analyse Linienform, die Bestimmung der Kinetik Geschwindigkeitskonstanten nicht durch die Erhöhung der Koaleszenz Temperaturen mit hohen Magnetfeldern zugeordnet begrenzt. Somit ist unsere Methodik dann sehr gut für niedrige und hohe Magnetfelder angeeignet. Dieser Artikel soll neuen Benutzern zu helfen, diese neue Methode, um ihre eigenen Systeme unterziehen chemischen Austausch anzuwenden und beschreibt die Probenvorbereitung, Versuchsaufbau, Datenerfassung, und ein Beispiel für die Datenverarbeitung und Analyse in einem einfachen organischen Moleküls.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethylacetamide</td><td>Aldrich</td><td>38840</td><td>Acute toxicity</td></tr><tr><td>Toluene-&lt;em&gt;d&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Fluorochem</td><td>D-005</td><td>Flammable and toxic</td></tr><tr><td>500 MHz 7&quot; Select Series NMR Tubes</td><td>GPE LTD</td><td>S-5-500-7</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 2.1</td><td>TopSpin program, Bruker Corp., http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin/ (2015).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 6.0</td><td>Origin 6.0 software, OriginLab Corp., http://originlab.com.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 500 MHz fitted with 5 mm broadband observed BBFOplus Z-gradient SmartProbeTM probe</td><td>&amp;nbsp;Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance I 500 MHz Inverse Triple Resonance NMR spectrometer fitted with a 5 mm TXI Z-gradient probe</td><td>&amp;nbsp;Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Spinner standardbore shimsystems (5 mm)</td><td>&amp;nbsp;Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td>H00804</td><td></td></tr></tbody></table>

spin saturation transfer difference nmr (sstd nmr): a new tool to obtain kinetic parameters of chemical exchange processes

Diese detaillierte Protokoll beschreibt die neue Spin Sättigungstransfer-Differenz Kernspinresonanz-Protokoll (SSTD NMR), die vor kurzem in unserer Gruppe entwickelten Verfahren der gegenseitigen Ort chemischen Austausch zu studieren, die schwer mit herkömmlichen Methoden zu analysieren. Wie der Name schon vermuten lässt, kombiniert diese Methode die Spin-Methode Sättigungstransfer für kleine Moleküle verwendet, mit dem Sättigungstransfer-Differenz (STD) NMR-Methode zur Untersuchung von Protein-Ligand-Interaktionen eingesetzt, durch transiente Spinsättigungstransfer Messung Sättigungszeiten entlang zunehmender (Build -up Kurven) in kleinen organischen und metallorganischen Moleküle chemischen Austausch unterzogen. Vorteile dieses Verfahrens gegenüber existierenden sind: es besteht keine Notwendigkeit Koaleszenz der Austausch von Signalen zu erreichen; kann das Verfahren solange ein Signal der Austausch von Websites isoliert angewendet werden; besteht keine Notwendigkeit , T 1 oder eingeschwungenen Zustand erreichen die Sättigung zu messen; Geschwindigkeitskonstante vaLues werden direkt gemessen, und T &amp; sub1 ; -Werte sind in dem gleichen Experiment unter Verwendung von nur einem Satz von Experimenten erhalten. Um das Verfahren zu testen, haben wir die Dynamik der gehinderten Rotation von N, N -dimethylamides untersucht, für die viele Daten zum Vergleich zur Verfügung steht. Die thermodynamischen Parameter mit SSTD erhalten werden, sind sehr ähnlich zu den berichteten diejenigen (Spin-Sättigungstransfertechniken und Linienformanalyse). Das Verfahren kann auf anspruchsvollere Substrate aufgebracht werden, die nicht von früheren Verfahren untersucht werden können. Wir sehen, dass die einfache experimentelle Aufbau und die breite Anwendbarkeit des Verfahrens auf eine große Vielfalt von Substraten wird dies eine übliche Technik unter ökologischen und Metallorganikern ohne umfangreiches Know-how in der NMR machen.

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Spin Saturation Transfer Difference NMR SSTD NMR: A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

A detailed protocol describing the SSTD NMR method is presented here to help new users apply this new method to obtain the kinetic parameters of their own systems undergoing chemical exchange.

Spin Sättigungstransfer-Differenz-NMR (SSTD NMR): Ein neues Werkzeug zu erhalten kinetischen Parameter der chemischen Austauschprozesse

This detailed protocol describes the new Spin Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance protocol (SSTD NMR), recently developed in our ...

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Chemistry

Unit 1

Spin Saturation Transfer Difference NMR (SSTD NMR): A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

Advanced Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

SCIENTISTS IN ACTION

17.8K Aufrufe.  University of East Anglia. A detailed protocol describing the SSTD NMR method is presented here to help new users apply this new method to obtain the kinetic parameters of their own systems undergoing chemical exchange.

Serie: Spin Saturation Transfer Difference NMR SSTD NMR: A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Forschung

Chemie

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

In Situ Monitoring of Diffusion of Guest Molecules in Porous Media Using Electron Paramagnetic Resonance Imaging

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with nitroxide spin probe 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (IPSL) as a guest inside the periodic mesoporous organosilica (PMO) aerogel UKON1-GEL as a host and ethanol as a solvent is used as an example to describe the protocol. Data is shown from a previous publication, where the protocol has been applied to both IPSL and Tris(8-carboxy-2,2,6,6-perdeutero-tetramethyl-benzo[1,2-d:4,5-d&#8242;]bis(1,3)dithiole) methyl (Trityl) as guest molecules and UKON1-GEL and SILICA-GEL as host systems. 
A method is shown to prepare aerogel samples that cannot be synthesized directly in the sample tube for measurement due to a size change during synthesis. The aerogel is attached to sample tubes using heat shrink tubing and a pressure cooker to reach the necessary temperature without evaporating the solvent in the process. The method does not assume a clearly defined initial distribution of guest molecules at the start of the measurement. Instead, it requires a reservoir on top of the aerogel and experimentally determines the influx rate during data analysis.
The diffusion is monitored continually over a period of 20 hr by recording the 1d spin density profile within the sample. The spectrometer settings for the imaging experiment are described quantitatively. Data analysis software is provided to take the resonator sensitivity profile into account and to numerically solve the diffusion equation. The software determines the macroscopic translational diffusion coefficient by least square minimization of the difference between the experiment and the numerical solution of the diffusion equation.

In Situ Monitoring of Diffusion of Guest Molecules in Porous Media Using Electron Paramagnetic Resonance Imaging

A protocol for the in situ monitoring of the diffusion of guest molecules in porous media using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging is presented.

In Situ Überwachung der Diffusion von Gastmolekülen in porösen Medien Mit Elektronenspintomographie

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Biochemie

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important biological processes. Understanding how the balance between structure and dynamics governs biological function is a new frontier in modern structural biology and has ignited several technical and methodological developments. Among these, CPMG relaxation dispersion solution NMR methods provide unique, atomic-resolution information on the structure, kinetics, and thermodynamics of protein conformational equilibria occurring on the &#181;s-ms timescale. Here, the study presents detailed protocols for acquisition and analysis of a&#160;15N relaxation dispersion experiment. As an example, the pipeline for the analysis of the &#181;s-ms dynamics in the C-terminal domain of bacteria Enzyme I is shown.

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the  &#181;s-ms Timescale

Here, a detailed description of the protocol implemented in the laboratory for acquisition and analysis of 15N relaxation dispersion profiles by solution NMR spectroscopy is provided.

15 N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers and modulators. While these dynamic states remain hidden to most structural methods, R1&#961; relaxation dispersion (RD) spectroscopy allows the study of conformational dynamics in the micro- to millisecond regime at atomic resolution. The use of 1H as the observed nucleus further expands the time regime covered and gives direct access to hydrogen bonds and base pairing.
The challenging steps in such a study are high-purity and high-yield sample preparation, potentially 13C- and 15N-labeled, as well as setup of experiments and fitting of data to extract population, exchange rate, and secondary structure of the previously invisible state. This protocol provides crucial hands-on steps in sample preparation to ensure the preparation of a suitable RNA sample and setup of 1H R1&#961; experiments with both isotopically labeled and unlabeled RNA samples.

We present a protocol to measure micro- to millisecond dynamics on 13C/15N-labeled and unlabeled RNA with 1H R1&#961; relaxation dispersion nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The focus of this protocol lies in high-purity sample preparation and setup of NMR experiments.

Praktische Aspekte der Probenvorbereitung und des Aufbaus von 1H R1ρ Relaxationsdispersionsexperimenten von RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Biotechnik

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

<meta charset="utf8"></head><body>Hochauflösende Untersuchungen von Proteinen in natürlichen Membranen mittels Festkörper-NMR

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Hochauflösende Untersuchungen von Proteinen in natürlichen Membranen mittels Festkörper-NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...

Fortschrittliche NMR-Techniken für die Analyse von Glykan-Protein-Wechselwirkungen

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and their biological consequences are intimately related to the three-dimensional structures of both partners, as well as to their dynamic features and their presentation on the corresponding cell compartments. NMR techniques are unique to disentangle these characteristics and, indeed, diverse NMR-based methodologies have been developed and applied to monitor the binding events of glycans with their associate receptors. This protocol outlines the procedures to acquire, process and analyze two of the most powerful NMR methodologies employed in the NMR-glycobiology field, 1H-Saturation transfer difference (STD) and 1H,15N-Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) titration experiments, which complementarily offer information from the glycan and protein perspective, respectively. Indeed, when combined they offer a powerful toolkit for elucidating both the structural and dynamic aspects of molecular recognition processes. This comprehensive approach enhances our understanding of glycan-protein interactions and contributes to advancing research in the chemical glycobiology field.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung der strukturellen und dynamischen Aspekte der molekularen Glykanerkennung

Here, we present a protocol detailing the acquisition, processing, and analysis of a series of NMR experiments aimed at characterizing protein-glycan interactions in solution. Most common ligand-based and protein-based methodologies are outlined, which undoubtedly contribute to the fields of structural glycobiology and molecular recognition studies.

Glykan-Protein-Wechselwirkungen entwirren: Kernspinresonanz (NMR) als Rettung

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

Spin Sättigungstransfer-Differenz-NMR (SSTD NMR): Ein neues Werkzeug zu erhalten kinetischen Parameter der chemischen Austauschprozesse

Zusammenfassung

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Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

In Situ Überwachung der Diffusion von Gastmolekülen in porösen Medien Mit Elektronenspintomographie

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

¹⁵ N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala

Praktische Aspekte der Probenvorbereitung und des Aufbaus von ¹H R_1ρ Relaxationsdispersionsexperimenten von RNA

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter

Hochauflösende Untersuchungen von Proteinen in natürlichen Membranen mittels Festkörper-NMR

Hochauflösende Untersuchungen von Proteinen in natürlichen Membranen mittels Festkörper-NMR

Glykan-Protein-Wechselwirkungen entwirren: Kernspinresonanz (NMR) als Rettung