This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.

1. MFP Leiter und Plattform Reinigung und Vorbereitung Hinweis: Dieses Protokoll verwendet vertikal orientierten Silizium-Glas - Hybrid - MFP 15,16 leitet. Die Siliciumkomponente des Kopfes enthält die Mikrokanäle, die bis zu einer Tiefe von 100 um geätzt werden. Die geätzte Silizium auf Glas geklebt anodische Bonden verwendet wird. Die Kanalausführung umfasst ein Muster von sechs Kanälen aus, jeweils zwei für die Injektion und Aspiration und zwei zum Einspritzen der Eintauchflüssigkeit (Abbildung 1). Die Kanäle zum Injizieren Tauchflüssigkeit verwendet aufzufüllen die Medien die biologische Probe umgibt, wodurch Verluste durch Aspiration und Verdunstung zu vermeiden. Die inneren Kanäle und äußeren Kanäle in der aktuellen Arbeit verwendet werden, sind 100 × 100 &amp; mgr; m und 200 × 100 &amp; mgr; m auf. Nach der Herstellung und Verarbeitung, MFP Köpfe mit klaren Kanäle und poliert Scheiteln erhalten. <ol><li> Herstellung der Pumpstation und Fluid-Gerät <ol><li> Verwenden Sie Kapillaren mit einem 1/16 &#39;&#39; (1,59 mm) Außendurchmesser und 0,02 &#39;&#39; (0,51 mm) Innendurchmesser für alle Schläuche an den Spritzen verbunden. Vary Kapillarengröße auf Anwendung basiert und erhalten die entsprechenden Anschlüsse und Armaturen der MFP-Kopf mit den Spritzen zu verbinden. Verwenden Sie Reinstwasser wo Verdünnungen notwendig sind. </li><li> Saubere Spritzen (250-500 &amp; mgr; l Volumen) und Spritzenkolben durch Beschallung in 0,5% Bleichlösung in Reinstwasser vor to- und Post-Experimente mit lebenden Zellen. Spülen Sie sie gründlich mit Wasser. Füllen Sie sie mit Wasser mit ihren Spitzen vollständig in ein Wasserbad getaucht und Absaugen des Kolbens verwendet wird. Spülen Sie die Flüssigkeit, während sie innerhalb des Wasserbades mit dem Spritzenwelle die Dichtung am Ausgang der Spritze zu kontaktieren. Wiederholen Sie aspirieren und Spülung, bis keine Luftblasen in der Spritze Spalten gesehen. </li><li> Schließen Sie Spritzen an die Spritzenpumpen mit Luer-Lock-Anschlüsse. Verwenden Sie ein Schaltventil auf die montiertePumpen der Flüssigkeit aus der Spritze auf einen von zwei Kapillaren zu richten entweder an den MFP Kopf oder an den Flüssigkeitsbehälter (Abbildung 6) führt. (Wenn kein Schaltventil zur Verfügung siehe Abschnitt 1.4.4). Purge beide Kapillaren mit Wasser aus den Spritzen bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 10 bis 50 &amp; mgr; l / min, abhängig von der Größe der Spritze, bis etwa 10 &amp; mgr; l Wasser werden in den Spritzen links. </li><li> Pre-setzen Sie die gespülten Kapillaren in einen geeigneten mikrofluidischen Stecker / Adapter, der mit den Kanal Vias im Kopf - Schnittstellen (zB M1 - Anschluss - siehe Materialien). </li></ol></li><li> MFP Kopf Vorbereitung <ol><li> Reinigen Sie den MFP Kopf durch Beschallung mit Glaswaren Reinigungsmittel für Standard-Reinigungs oder 0,5% Bleichmittel für strenge Reinigung, für 5 min. Purge Kanäle mit Wasser durch den Scheitelpunkt in Wasser getaucht und Anlegen von Vakuum an die Vias. </li><li> Untersuchen Sie Kanäle unter einem Stereomikroskop für mögliche Hindernisse (Verstopfung) und reTorf den vorherigen Schritt, falls erforderlich. </li><li> Montieren Sie den sauberen Kopf auf dem Kopfhalter und schrauben Sie den Stecker mit dem vorher eingesetzten und gespült Schlauch auf den Kopf. Schrauben Sie den Kopfhalter auf die Z-Stufe, die für die Kontrolle der Spaltabstand zwischen dem Kopf und der Zellschicht verwendet wird. </li></ol></li><li> Kalibrieren der Scan - Stufen des MFP - Plattform <ol><li> Führen Endpunkt Kalibrierung der X-, Y- und Z-Phasen vor den Kopf zu verbinden mit der Plattform, nach dem Protokoll des Herstellers mit einem geeigneten Software-Schnittstelle. Kalibrierte Stufen Genauigkeit sorgen für die MFP-Kopf bei der Positionierung. </li><li> Erhalten eines rohen Null Spaltabstand (Nullstellen) durch den MFP-Kopf über eine Kammer gleiten, ohne Zellen zu bringen und langsam in 5 &amp; mgr; m Stufen hinabsteigen. Sonde nach Kontakt mit dem Substrat, sollte Newtonsche Ringe beobachtet werden. Dies ist eine grobe Schätzung. Eine genaue Position ist nach dem Einstellen der Koplanarität der Sonde Spitze zum substrat erhalten werdene. </li><li> Um Koplanarität der Sonde Spitze zu gewährleisten, stellen Sie die Neigung des Kopfes eines Goniometers (an der Schnittstelle des Kopfes und die Z-Stufe) verwendet wird. Wenn gebildet sicherzustellen , dass die Newtonsche Ringe symmetrisch sind (Abbildung 1). Bewegen Sie den MFP Kopf 20 &amp; mgr; m entfernt von dem Substrat und passen Neigung Goniometer verwendet wird. Wiederholen Sie absteigen, Nullstellen und Neigungsverstellung, bis die Newtonsche Ringe sind symmetrisch auf Kontakt. Mit eingestellt Neigung, stellen Sie die z-Position, die Ringe als Null symmetrische Newton erzeugt. HINWEIS: Die Z-Stufe steuert den Kopf-zu-Substrat - Abstand, während der XY - Tisch das Abtasten des Substrats (2) steuert. Eine detaillierte Erklärung finden Sie in unserer früheren Arbeit 14 zu finden. </li></ol></li><li> Chemische Präparate für die lokale Entfernung von Zellschichten Achtung: Gegebenenfalls Verwendung Sicherheitsausrüstung (zB Nitril - Handschuhe, Schutzbrille) für die Chemikalien vorbereitet. Verwenden Sie einen Rauch hood gegebenenfalls zur Herstellung von Lösungen. Bereiten Sie alle Chemikalien und Puffer mit Reinstwasser als Verdünnungsmittel. <ol><li> Vorbereitung 50 mM NaOH - Lösung als Behandlungsflüssigkeit für die inneren Einspritzkanal (i2 mit Strömungs Q I2 in Abbildung 1). </li><li> Bereiten Sie die Extraktionspufferlösung für die äußeren Einspritz (i1 mit Strömungs Q I1 in 1) erforderlich ist , bestehend aus 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5% Tween 20 und 10 uM Rhodamin B in 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan bei pH 8. Zur Spülung verwenden Wasser in den Streben Spritzen. </li><li> Filtern Sie alle Lösungen, die eine 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter. Degas alle gefilterten Lösungen einen Exsikkator, bis die gelöste Luft Anschlag auf die Oberfläche mit sprudelnden. </li><li> Mit der Ablaufleitung an den Spritzenpumpen verbunden sind, spülen Sie das Restwasser und aspirieren die entgasten Lösungen in die Injektionsspritzen bei 40 &amp; mgr; l / min, bis die Spritzen voll sind (250 oder 500 &amp; mgr; l).Dadurch wird sichergestellt, blasenfreie Füllung der Spritzen, Anschlüsse und Kapillaren. Die Spritze-Umschaltventil-Zwei Kapillarsystem ermöglicht Füllung der Mitte experiment Spritzen. In Ermangelung eines solchen Schaltventil, trennen Sie die Kapillaren aus dem Kopf und füllen die Kapillaren und die Spritze durch die entgaste Lösungen abgesaugt, bevor sie den Kopf wieder anschließen. </li><li> die Verarbeitung Aspirieren und Flüssigkeiten durch die Kapillaren ermöglicht die Verwendung von kleinen Mengen während des Betriebs abgeschirmt werden. Wenn die Chemikalien in großen Mengen hergestellt werden, füllen Spritzen mit den erforderlichen Lösungen direkt. Zum Beispiel, dass die Bestrebung Spritzen Wasser enthalten, können mit diesem Ansatz gefüllt werden. </li><li> Spülen Sie die Kapillaren an den MFP Kopf mit den Flüssigkeiten für jeden Kanal zugewiesen, wie in 1.4.1 und 1.4.2 definiert. HINWEIS: Die Extraktionspufferlösung schirmt das NaOH in der inneren Einschluss und der Rhodamin-Komponente in dem Puffer ermöglicht die Visualisierung von the hHFC während des Betriebs. </li><li> Wenn die Zellen über konfluent sind, mit Zellaggregate auf der kultivierten Fläche erscheinen, ergänzen das Extraktionspuffer mit 10% Proteinase K. Diese ergänzt die Wirkung von NaOH auf diese Aggregate durch denaturierte Proteine ​​auflösen als das Lysat die Bestrebung Kanäle gelangt. Dies verhindert ein Verstopfen der Kanäle während des Betriebes. </li></ol></li><li> Herstellung von Zellmonoschichten auf chamber slides Achtung: Verwenden Sie eine Zellkultur Haube für die Kultivierung von Zellen und Griff Ausrüstung gemäß Vorschriften der Biosicherheitsbeauftragten des Labors festgelegt. Hinweis besonderen Anforderungen bestimmter Zelllinien und Anpassung Protokoll und Geräte entsprechend. <ol><li> Verwendung der Zellkultur - Inkubatoren (bei ​​5% CO 2 und bei 37 ºC) für die Kultur und Expansion von Zellen strukturiert werden. Führen Sie die Erweiterung mit Standard - Zellkulturprotokolle 17,18 in T - Kolben. Verwenden Kulturmedien nach Anforderungen der spezifischen cell Leitung (zB Serum und Antibiotikum ergänzt DMEM zur Kultivierung von MCF7 und MDAMB 231). </li><li> Bei Erreichen in den Kulturflaschen Zellkonfluenz, trypsinize und Zellen und seed 2 × 10 5 Zellen / cm 2 in jeder der 2-Kammer - Objektträger zur Strukturierung und die Kultur mehr als 48 Stunden zu sammeln. Verwenden Sie die Zellen in einer der Kammern als eine Kontrolle für das Zellwachstum und Lebensfähigkeit. </li><li> Zellkonfluenz an den Kammer gleitet, Inkubation der Zellen für 45 min mit 500 ul Zell-tracker Farbstofflösung (zB grün - CMFDA oder orange - CMRA) Bei Erreichen von 10 &amp; mgr; M Konzentration hergestellt in Serum-freiem Medium. Dies wird für die Zell Visualisierung während der Strukturierung erfolgen. Waschen Sie die markierten Zellen mit PBS, indem Sie vorsichtig jede Kammer mit einer Pipette gespült und anschließend Kultur die Zellen in serumhaltigem Medium für die Musterexperimente. </li><li> Besorgen Sie sich ein Referenzbild der Zelle-tracker-gefärbten Zelloberfläche zum Zwecke der Zellzählung. Dies geschieht, um sicherzustellen,Konfluenz der Zellschicht. Darüber hinaus dient es als Hilfe für die Quantifizierung Experimente wenn Probenrückgewinnung und die DNA-Analyse Ziele sind. HINWEIS: In dem Fall, dass die Lebensfähigkeit der Zellen während der Strukturierung beurteilt werden wird, können die Zellen mit einem Live / Dead Zytotoxizität Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt werden. </li></ol></li></ol> 2. Erstellen der Hierarchical hydrodynamischem Fluss Confinement (hHFC) <ol><li> Bewegen Sie den MFP über die Zellschicht zu einem Spaltabstand von 50 &amp; mgr; m aus dem Glasträger. Dieser Spaltabstand während sichergestellt Kontakt des hHFC erklärt auch einschichtige Oberfläche und Dickenvariation. </li><li> Injizieren NaOH bei 6 bzw. 8 &amp; mgr; l / min durch i2. Bewerten Sie anderen Flussraten (dh Q I1, Q A1 und Q A2) 3 , um die Flussregeln in Abbildung verwendet wird . </li><li> Modulieren der Größe des inneren HFC durch das Verhältnis von Q I2 / I1 Q Ändern der Injektionsspritzen verwendet wird .Beispielsweise verwenden , um eine Q I1 zwischen 1,3 &amp; mgr; l / min und 4 &amp; mgr; l / min, mit dem Q I2 bei 8 &amp; mgr; l Fest / min, die aus 150 in einer NaOH - Bilanz führt - 300 Zellen (100 bis 200 &amp; mgr; m 2 / Zelle) ( Figur 3D). </li><li> Injizieren Vollmedium von den äußersten Öffnungen auf dem MFP Kopf mit einer Strömungsrate von 20 &amp; mgr; l / min für die Verdampfung der Medien zu berücksichtigen, und Aspiration während des Betriebs des hHFC. </li></ol> 3. Patterning-Zellmonolayern hHFC Verwendung Hinweis: Die Scanmuster legt die Bereiche der Zellschicht, wo die Zellen extrahiert werden (subtraktiven Strukturierung), die restlichen Zellen verlassen spezifische biologische Fragen zu studieren. Dieses Muster kann gerade Linien oder eine Reihe von Punkten, beispielsweise. Komplexe Muster erfordern Entwurf eines geeigneten Abtasttrajektorie. Zum Beispiel stellt ein kariertes Abtastbahn ein Gitter von Zellflächen (beispielsweise in 4A gezeigt </strong&gt;), die die Wirkung verschiedener Stimuli an Zellen in verschiedenen Plätzen studieren würde es ermöglichen, während in enger Nachbarschaft zu sein. Diese Muster können die Kontrolle über die XY-Stufen der Plattform erstellt werden, in dem die Steuerungssoftware Scripting von Scan-Trajektorien für die MFP-Kopf über die Zellschicht ermöglicht. <ol><li> Die Bühne Software den Sondenkopf über der Zellschicht in benutzerdefinierten Muster (durch Setzen X, Y und Z-Koordinaten) bei einer Abtastgeschwindigkeit von 10 um / s zu einem Spaltabstand von 50 &amp; mgr; m abzutasten. </li><li> Mit der verschachtelten hHFC in Betrieb und in Kontakt mit der Monoschicht, scannen Sie den MFP mit einer Flugbahn des gewünschten Musters strukturiert Zellentfernung zu bewirken. </li><li> Für eine Co-Kultur nach dem ersten Typ Entfernung Zelle, eine andere Zelllinie Samen, die Lücken zu füllen, mit den Methoden in Kapitel 1.5. Bewegen zwischen verschachtelten und kniff Modi (durch Spaltabstand zu erhöhen, zum Beispiel) Zellentfernung zu steuern. HINWEIS: Die Scan-Geschwindigkeit müssen möglicherweise Untersu seingated für andere Zelllinien. Die Scan-Geschwindigkeit in dieser Demonstration Effekte komplette Zellentnahme über die gescannten Bereiche für die verwendeten Zelllinien verwendet. </li></ol> 4. Downstream Processing zur Probenahme und DNA-Amplifikation <ol><li> Bereiten Sie die Probenentnahmestation für Downstream-Analyse des Lysats. Für die Probenentnahmestation, verwenden Sie ein 3D-8-Streifen PCR Rohrhalter gedruckt. Alternativ wählen Sie einen geeigneten Rohrhalter als diesen Adapter zu dienen, die im Scanbereich montiert wird der Kopf außerhalb des Substrats fähig ist. Wischen den Rohrhalter mit 70% Ethanol oder einer anderen Oberfläche Dekontaminations basierend auf der Stringenz für die Anwendung erwünscht ist. Verwenden Sie einen magnetischen Clip auf dem Rohrhalter es auf den Substrathalter zu befestigen. </li><li> Nach der Probenentnahmestation vorbereiten, positionieren Sie den MFP Kopf 100 &amp; mgr; m von der einschichtigen. Beginnen Sie den hHFC mit 50 mM NaOH-Lösung als Behandlungsflüssigkeit für die innere Injektionskanal mit Durchflussraten von 1 Betrieb, 6, -7 Und -17,5 &amp; mgr; l / min für Q I1, Q I2, Q A1 und A2 Q beziehungsweise. <ol><li> Sobald die Strömungs Confinement (in ca. 10 sec) stabilisiert hat, steigen Sie den Sondenkopf mit einem Spaltabstand von 50 &amp; mgr; m durchzuführen NaOH basierten lokalen Lyse des ausgewählten Subpopulation von Zellen mit dem hHFC. Nach Lyse der Subpopulation abgeschlossen ist (ca. 30 sec pro Stellfläche), richten den Kopf in Richtung der Rohre in der Entnahmestation. Werfen Sie die gesammelten Lysat in die PCR - Röhrchen direkt (Abbildung 6). </li></ol></li><li> Zur Weiterverarbeitung des Lysats, neutralisieren zuerst den pH-Wert der Lösung durch das Lysat mit Tris-Puffer Mischen (1: 1). Nach der Neutralisierung Wärme für 30 Minuten das Lysat bis 95 ºC. Dann direkt das Lysat in ein Standard-qPCR-Workflow laden, wie durch Lieferanten des Gerätes eingestellt. </li></ol>

<ol>
	<li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li><li>Goubko, C. A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+cell+types+in+co-cultures:+A+review.">Patterning multiple cell types in co-cultures: A review.</a> Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).</li><li>Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+systems+for+the+generation+of+patterned+co-cultures+for+controlling+cell-cell+interactions.">Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).</li><li>Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layered+patterning+of+hepatocytes+in+co-culture+systems+using+microfabricated+stencils.">Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils.</a> Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).</li><li>Sch&#252;tze, K., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+expressed+genes+by+laser-mediated+manipulation+of+single+cells.">Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells.</a> Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).</li><li>Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropallet+arrays+for+the+separation+of+single,+adherent+cells.">Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells.</a> Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).</li><li>Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+mammalian+cells+from+adherent+cultures+by+fluidic+force+microscopy.">Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy.</a> Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).</li><li>Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+scraper+based+on+an+atomic+force+microscope+for+detaching+a+living+cell+from+a+substrate.">A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate.</a> J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration.">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li><li>Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipurpose+microfluidic+probe.">Multipurpose microfluidic probe.</a> Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).</li><li>Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+the+&amp;#34;open+space&amp;#34;+for+performing+localized+chemistry+on+biological+interfaces.">Microfluidics in the &amp;#34;open space&amp;#34; for performing localized chemistry on biological interfaces.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).</li><li>Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+quadrupole+and+floating+concentration+gradient.">Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient.</a> Nat. Commun. 2 (May), 464 (2011).</li><li>Christ, K. V., Turner, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+hydrodynamically+confined+microfluidics:+controlling+flow+envelope+and+pressure.">Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure.</a> Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).</li><li>Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+hydrodynamic+flow+confinement:+efficient+use+and+retrieval+of+chemicals+for+microscale+chemistry+on+surfaces.">Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces.</a> Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).</li><li>Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vertical+Microfluidic+Probe.">A Vertical Microfluidic Probe.</a> Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).</li><li>Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+and+versatile+microfluidic+probe+for+local+processing+of+tissue+sections+and+biological+specimens.">A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens.</a> Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301 (2014).</li><li>Pollard, J. W., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Cell Culture Protocols. , (1997).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cell+culture+protocols.">Human cell culture protocols.</a> Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).</li><li>Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cell+detachment+by+shear+stress.">Quantitative analysis of cell detachment by shear stress.</a> Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).</li><li>Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+multicolor+dynamically+adhesive+substrates+to+control+cell+adhesion+and+multicellular+organization.">Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization.</a> Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).</li><li>Tasoglu, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+stem+cell+research.">Bioprinting for stem cell research.</a> Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir präsentieren ein vielseitiges Protokoll für die subtraktiven Strukturierung von Zellmonolayern, die schnelle Erzeugung von räumlich definierten Zellstrukturen ermöglicht. Selektive Lyse der Zellmonolayer wird mit NaOH als Verarbeitungsflüssigkeit in hHFC durchgeführt. Die NaOH denaturiert augenblicklich die Proteine ​​in der Zellmembran enthalten ist. Wir empfehlen die Verwendung von 50 mM NaOH-Konzentration der Weiterverarbeitung des Lysats zu gewährleisten. Diese Konzentration kann für eine schnellere Zellentfernung erhöht werden, Lysat Downstream Processing kein Ziel ist. Die hHFC stellt sicher, dass die nicht verarbeitete Umgebung der Zellschicht unbeeinflusst bleiben und sind entweder das Muster erweitert oder andere Eigenschaften der Zellen Sondieren. Die Rate der Zellentfernung ist eine Funktion sowohl der Chemie und Scherung durch die Strömung dargestellt. Wir wählen einen Arbeitsbereich von Flussraten Chemie dominante Zellentfernung zu haben. Scangeschwindigkeiten von 10 - 20 &amp; #181; m / sec eine NaOH Injektionsflussrate von 6 unter Verwendung von - 8 ul / min verwendet werden, &#39;schnelle&#39; subtraktiven Strukturierungs zu erleichtern. Die rasante Geschwindigkeit der Zellentfernung behandelt einige Herausforderungen durch Oberflächendruck basierend Musterung 20,21 nähert. Diese Verfahren erfordern einen Mechanismus Wachstum von Zellen zu begrenzen, in räumlich definierten Bereichen, beispielsweise durch selektive Abscheidung von Zelladhäsionsproteinen via Mikrokontaktdrucken und anschließender Aussaat von Zellen, um das Muster zu erhalten. Sie zeichnen sich durch geringen Durchsatz begrenzt und erfordern mehrere aufeinanderfolgende Schritte zur Mustererzeugung sowie ein neues für jedes Muster Schablone / Stempel. Das beschriebene Verfahren erfordert nicht selektives Wachstum von Zellen auf definierte Bereiche und mehrere Einschränkungen überwindet durch subtraktive Strukturierung im Gegensatz zum Drucken ausgeführt wird, während keine zusätzliche Behandlung des Zellkultursubstrat erfordern. Mit dem Protokoll in diesem Dokument beschriebenen, den Durchsatz von Musterzellmonolayernerhöht wird, während sofortiges visuelles Feedback des erzeugten Muster zu erhalten. Dies erleichtert die Echtzeit-Änderung der Muster. Eine solche Steuerung kann in Szenarien, in denen die Lebensfähigkeit der Zellen auf einer gegebenen Oberfläche nicht homogen ist von entscheidender Bedeutung sein. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass der gleiche Kopf und der Chemie verwendet werden können, mehrere Muster zu erzeugen, wodurch die Anzahl der Schritte zu reduzieren bei der Erzeugung einer strukturierten Zellschicht beteiligt. Die Abmessungen der Kanäle in dem Kopf und der Kopfgeometrie kann entsprechend den Anforderungen der Anwendung geändert werden, wodurch die Kontrolle über die Auflösung der Strukturierung ermöglichen. Alle Versuche in der aktuellen Arbeit wurden unter Verwendung eines MFP Kopf mit festen Öffnungsabmessungen durchgeführt, und zwar mit inneren Öffnungen bei 100 × 100 &amp; mgr; m und äußeren Öffnungen bei 200 × 100 &amp; mgr; m. Dieses Design mit größeren äußeren Öffnungen wurde ohne ein Verstopfen der Öffnungen kontinuierlichen Betrieb des hHFC sicherzustellen ausgewählt vonStreuzelltrümmer. Wir haben getestet Köpfe mit inneren Abmessungen der Öffnung 50 × 50 &amp; mgr; m und 50 &amp; mgr; m Abstand zwischen ihnen, mit erfolgreichen Ergebnissen in Zellentnahme. Die Verwendung von kleineren Öffnungen, bis zu 10 × 10 &amp; mgr; m mit 10 &amp; mgr; m Abstand, würde die Skalierung auf eine kleinere Stellfläche Größe (~ 30 × 30 &amp; mgr; m) ermöglichen, wodurch eine höhere Auflösung bei der Muster ermöglicht. Wir beobachteten operativen Fragen mit Öffnungsgrößen kleiner als 10 &amp; mgr; m aufgrund von Partikeln zu verstopfen. Wegen solcher Betriebsschwierigkeiten, 100 &amp; mgr; m ist die Strombegrenzung der Auflösung und somit eine Begrenzung der beschriebenen Technik. Allerdings können wir dies mit der flüssigen Formgebung Fähigkeit des hHFC adressieren. Wir haben gezeigt , dass die Auflösung der Zellentfernung kann durch Steuern Q I2 / Q I1 (Abbildung 4b) und die Spitze-zu-Substrat - Spalt 10,14 für einen gegebenen Satz von Öffnungsabmessungen abgestimmt werden. Die Stadien in der aktuellen Arbeit verwendet hat eine minimale Schrittweite von 100 nm.Eine Kombination dieser steuerbaren Parameter kann die räumliche Auflösung der Zellentnahme in Bezug auf die Stellfläche Größe und Tastweite verbessern. Wenn gemusterten Kokulturen erwünscht sind spezifische Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, sequenziellen seeding und Strukturieren kann unter Verwendung des beschriebenen Protokolls durchgeführt werden. Schließlich können amplifizierbare DNA von hoher Qualität aus dem Lysat erhalten werden, wie ersichtlich , durch die singuläre Peaks in der DNA Schmelze Kurve (siehe Abbildung 7). Wir untersuchten eine DNA-Menge von etwa 1,6 aus einem einzigen Fußabdruck ng (etwa 300 Zellen) unter Verwendung von qPCR, die theoretische Erwartung nahe ist (6-8 pg / Zelle). Dies deutet auf eine Menge der extrahierten DNA geeignet für verschiedene nachfolgende Prozesse, während die Verwendung von irgendwelchen DNA Isolationsmethoden vermieden. Dies eröffnet Möglichkeiten für die DNA-Analyse-basierten von kultivierten Zellen lokale Sondierung. Die Fähigkeit von hHFC Flüssigkeiten zu formen können auch lebende Zellen und Proteine ​​verwendet werden auf ac abzuscheidentiviert Oberflächen, die in Kombination mit dem subtraktive Strukturierung und sequenzielle Kokultivierung in diesem Protokoll vorgestellt ermöglicht die Erstellung von komplexen Zell- und Zell-Matrix-Muster auf Kultursubstraten. Die Vielseitigkeit und die Kontrolle zur Verfügung gestellt von hHFC-basierten subtraktiven Strukturierung von Zellmonolayern und die Möglichkeit, auf den extrahierten Zellen DNA-Analyse durchzuführen, stellt ein leistungsfähiges neues Werkzeug für Biologen setzen ortsaufgelöste Untersuchungen Wechselwirkungen zwischen Zelle durchzuführen.

In ihrer natürlichen Umgebung wahrnehmen Zellen in biologischen Geweben eine Reihe von biochemischen und physikalischen Signale lenken ihr Wachstum, Organisation und Entwicklung. Diese Hinweise zu verstehen, müssen selektive Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Dies erfordert die Entwicklung von Verfahren zur Strukturierung Zellmonolayern. Methoden zur geometrisch getrennten verschiedenen Zelltypen in Kultur (Strukturierung) ermöglichen breite Studien von physikalischen und chemischen Signale in der Zellbiologie. Die meisten der derzeitigen Ansätze zur Strukturierung Zellschichten von 1 bis 4 sind abhängig von Ablagern zell Adhäsionsproteine ​​auf Oberflächen oder mit mikrofabrizierten Schablonen für das selektive Wachstum auf Substraten. Im Gegensatz dazu zeigen wir hier ein Verfahren zur schnellen Musterzellmonolayern in situ, dh Zellen in Kultur, die von Zellen in ausgewählten Bereichen der Monoschicht entfernt werden . Methoden, die solche subtraktiven Strukturierungs 5 durchführen - 9 usually erfordern spezielle Substrate, Oberflächenbehandlung, komplexe Operation, physikalischen Kontakt oder Ablation mittels eines Lasers, unbeabsichtigt die lebenden Zellen zu beeinflussen. Wir verwenden hier eine mikrofluidische Sonde (MFP) 10,11, ein berührungsloses Scannen mikrofluidischen Technologie , die hydrodynamisch eine Flüssigkeit auf ein Substrat beschränkt. Ein wichtiger Bestandteil des MFP ist der mikrostrukturierten Kopf enthält Mikrokanäle (Abbildung 1). Die zugehörige Plattform besteht aus Spritzenpumpen für die Flüssigkeitssteuerung, Stufen zur Abtaststeuerung und ein invertiertes Mikroskop zur Visualisierung und Rückkopplung (Abbildung 2). In seiner Grundkonfiguration umfasst das MFP Kopf zwei Mikrokanäle mit Öffnungen an der Spitze, eine Verarbeitungsflüssigkeit und die andere zum Absaugen der injizierten Behandlungsflüssigkeit zusammen mit einigen Tauchflüssigkeit (3A) eine zur Injektion. Während MFP Betrieb ist der Scheitelpunkt in einem festen Abstand von dem Substrat. Wenn die Absaugströmungsleitung Rate (Qa) ist sufficiently höher als die Einspritzströmungsgeschwindigkeit (Q i), das heißt Q a: Q i ≥ 2,5, wird die Behandlungsflüssigkeit auf dem Substrat beschränkt. Dies führt zu einer hydrodynamischen Strömungs Confinement (HFC). Der Bereich, in dem die Behandlungsflüssigkeit in direktem Kontakt mit dem Substrat ist, wird die Aufstandsfläche bezeichnet. Bei typischen Betriebsbedingungen, die Strömung der Behandlungsflüssigkeit innerhalb der HFC durch eine niedrige Reynoldszahl gekennzeichnet ist (Re ≈ 10 -2) und eine hohe Peclet - Zahl (Pe ≈ 10 2). Dies bedeutet, Flüssigkeit fließt in laminaren Regime mit Konvektion die primäre Form der Massentransfer von chemischen Spezies zu sein. 14 - Die numerischen und analytischen Modelle zur Strömungshaft sind an anderer Stelle 12 beschrieben. In dieser Arbeit verwenden wir den Ansatz der gleichzeitig mehrere Verarbeitungsflüssigkeiten zu beschränken, die hierarchische HFC (hHFC) 14 bezeichnet wird. Zur Umsetzung hHFC mit dem MFP, zwei additional Öffnungen benötigt, um eine sekundäre Quelle der Einspritzung und Aspiration zu liefern. Dies ermöglicht es uns, eine Flüssigkeit, die in einer zweiten Flüssigkeit zu begrenzen. Die inneren (processing) Flüssigkeit Vorteile werden die von Streu Ablagerungen auf dem Substrat durch die äußere (Abschirmung) Flüssigkeit abgeschirmt. Darüber hinaus ermöglicht hHFC Betrieb in zwei Modi: (i) die verschachtelten Modus, in dem die Behandlungsflüssigkeit in den inneren HFC Kontakt mit der Oberfläche (3B), und (ii) der gedrängten Modus, in dem die innere Flüssigkeit verliert den Kontakt und nur die äußere Flüssigkeit in Kontakt mit dem Substrat (3C). Die Umschaltung zwischen den beiden Betriebsarten ermöglicht es Benutzern zu bewirken oder Bearbeiten des Substrats zu stoppen , und wird durch Steuern des Kopf-an-Oberfläche erzielt Spalt oder durch das Verhältnis zwischen den Einspritzströme ändert (Q i2 / Q i1). Für eine gegebene Kanalgeometrie kann die Aufstandsfläche der Behandlungsflüssigkeit auf dem Substrat durch Modulieren Strömungsbedingungen (3D) gesteuert werden. Sodium hydroxid (NaOH) wird als die innere Behandlungsflüssigkeit verwendet, um die Zellen zu lysieren und das Lysat kontinuierlich von der Oberfläche angesaugt wird. Da die chemischen Wirkungen der Verarbeitungsflüssigkeit auf die innere HFC Fußabdruck lokalisiert sind, bleiben die benachbarten Zellen ungestörte, die Raum-Zeit-Studien von Zell-Zell-Wechselwirkungen ermöglicht. Die Scan - Funktionalität des MFP ermöglicht die Erstellung von benutzerdefinierten Geometrien von Zellmuster (Abbildung 4). Ferner nimmt die Wahl der NaOH als Behandlungsflüssigkeit stromabwärts der DNA - Analyse (Abbildung 7).

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Microfluidic Probe (MFP)</td><td></td><td></td><td>Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Z&amp;uuml;rich</td></tr><tr><td>Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>154461</td><td>2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; and capable of holding up to 3 ml of media volume</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Chemicals and cell lines&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B</td><td>SigmaAldrich chemicals, USA</td><td>S5881, 252859,&amp;nbsp; E9884, R6626</td><td>Chemicals used for processing and shielding liquids</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen, Germany</td><td>19131</td><td>protease to digest denatuired proteins</td></tr><tr><td>Deconex 16 Plus</td><td>Bohrer Chemie, Switzerland</td><td></td><td>Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning.</td></tr><tr><td>DNA away&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>7010</td><td>Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases.</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>10566-016</td><td>Culturing medium for epithelial cells.</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA dye</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C7025</td><td>Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours.</td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMRA dye</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin genomic primers for qPCR</td><td>Integrated DNA technologies, USA</td><td></td><td>Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR.</td></tr><tr><td>MCF7 breast carcinoma cells</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-22</td><td>Cell lines used to produce co-cultures.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 breast carcinoma cells</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment and fluidic connections&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Motorized high precision stages</td><td>Custom machined components.&amp;nbsp; Linear axis motors from LANG GmBH, Germany</td><td>Customized linear axis stages from LT series</td><td>3 &amp;times; LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port.</td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Hamilton, Switzerland</td><td>1700 TLLX series</td><td>Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 &amp;micro;l range.</td></tr><tr><td>Nemesys low pressure syringe pumps</td><td>cetoni GmbH, Germany</td><td></td><td>Component of pumping station.</td></tr><tr><td>Circular M1-connector</td><td>Dolomite microfluidics, United Kingdom&amp;nbsp;</td><td>3000051</td><td>Interface between vias in MFP head and tubing</td></tr><tr><td>Tilt/rotation stage Goniometer</td><td>OptoSigma, USA</td><td>KKD-25C</td><td>Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex</td></tr><tr><td>DS Fi2 HD color camera (CCD)&amp;nbsp;</td><td>Nikon, Switzerland</td><td></td><td>Controlled using DS-U3 controller unit</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Win - Commander</td><td>LANG GmBH, Germany</td><td></td><td>Stage control software.</td></tr><tr><td>Qmix Elements</td><td>cetoni GmbH, Germany</td><td></td><td>Pump control software.</td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon, Switzerland</td><td></td><td>Basic research module for image acquisition and analysis.</td></tr></tbody></table>

rapid subtractive patterning of live cell layers with a microfluidic probe

Die mikrofluidischen Sonde (MFP) erleichtert auf biologische Substrate lokale Chemie Durchführung von Nano- Flüssigkeitsmengen zu beschränken. Verwendung einer bestimmten Implementierung des MFP, die hierarchische hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC) werden mehrere Flüssigkeiten in Kontakt mit einem Substrat gebracht gleichzeitig. Lokale chemische Wirkung und flüssige Formgebung der hHFC verwendet wird, wird ausgenutzt, indem lokal Lyse und Entfernen von Zellen Zellmuster zu erzeugen. Durch Verwendung des Scan-Fähigkeit des MFP, benutzerdefinierte Muster der Zellmonoschichten erzeugt werden. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, Echtzeit und räumlich kontrollierten Zell Strukturierung, die eine selektive Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionsstudien ermöglichen kann.

Das beschriebene Protokoll zur schnellen subtraktive Musterbildung von Zellmonoschichten demonstriert eine Mehrkomponenten MFP - Plattform (1 und 2). Das Protokoll verwendet die hierarchische hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC; Abbildung 3) , um lokal zu behandeln und zu entfernen Zellen aus Zellmonolayern mit NaOH als Verarbeitungsflüssigkeit. Die hHFC Konfiguration umfasst eine innere und eine äußere HFC HFC. Die beschränkte NaOH in der inneren hHFC führt chemische Wirkung und Scherung auf den Zellen in Kontakt. Innerhalb dieser Ausleuchtzone werden die Zellen homogen auf die chemische Einwirkung von NaOH ausgesetzt, Konvektion angetriebene Massentransfer aufgrund innerhalb und mit vernachlässigbarer Diffusion zu dem Bereich außerhalb der Begrenzung. Die Scher auf die Zellen auf der anderen Seite, kann durch Variieren der Strömungsrate des NaOH verändert werden. Um die Betriebsparameter zu vereinfachen, haben wir uns für chemische Wirkung die dominante Mechanismus der Zellentnahme im Vergleich zur Scher zu machen. Nachschätzen die Scherkraft durch die hHFC auf die Oberfläche aufgebracht wird, ein Finite-Elemente-Modell wurde mit Comsol Multiphysics 5.0 gebaut. Simulationen wurden mit dem CFD-Modul für laminare Strömungen laufen. Zwei Einlassrandbedingungen zu den Einspritzöffnungen der Geometrie und zwei Austrittsrandbedingungen an die Bestrebung Öffnungen (Abbildung 5) wurden für den Bereich der Strömungsraten und Abmessungen der Öffnung in der aktuellen Demonstration verwendet angewendet. In dem Modell erhalten, diktierte die Flussregeln der Scherprofil, während die Strömungsgeschwindigkeiten die Größe der Scher auf der Oberfläche definiert. Praktisch bestimmt eine Kombination von beiden, wenn die hHFC Kontakte an der Oberfläche. Wenn man sich diese Faktoren im Auge, setzen wir für den Betrieb eine Reihe von Durchflussraten, um herauszufinden, um chemisch dominante Zellentfernung zu erhalten. Um eine hHFC zu erzeugen, verwenden wir den Fluss der Regel von insgesamt Streben nach Injektionsflussrate-Verhältnis von 3,5. Die anderen Flussregeln verwendet wurden definiert innerhalb der Aspiration Kanäle zu verstopfen, zu minimieren,was durch denaturierte Proteine ​​verursacht werden das Festhalten an den Kanaloberflächen. Verwendung des entwickelten Modells, fanden wir Strömungsgeschwindigkeiten von 5 bis 10 &amp; mgr; l / min übersetzen zu einer Scherspannung zwischen 1 und 3 N / m 2. Ohne die chemische Wirkung von NaOH, beispielsweise im Falle der Extraktionspuffer, würde die Scherspannung nicht hoch genug sein , um die Zellen 19 zu entfernen. Innerhalb des beobachteten Bereichs, bemerken wir , dass Betrieb bei höheren Flußraten ist praktischer zu Störungen im Strömungspfad aufgrund bei niedrigen Strömungsraten aspiration (dh Q I2 &lt;4 &amp; mgr; l / min) aufgrund von Zelltrümmern in den Kanälen. In Anbetracht der untersuchten Scherprofil und praktischen Erwägungen Strömungs NaOH Raten (Q I2) von 6 und 8 &amp; mgr; l / min für die Musterungsexperimente und Q I1, Q A1 und Q A2 entsprechend den Flussregeln in Abbildung 3 gezeigt ist, verwendet. Das Verhältnis Injektionsströme (Q I2 / Q I1) ermöglicht us , um die Größe des durch Autebert erarbeitet hHFC Fußabdruck (3D und 4B), mit dem zugrunde liegenden Prinzip modulieren et al. 14. Unter Verwendung der flüssigen Formfähigkeit des hHFC gekoppelt mit hochauflösenden Scan - Fähigkeit von MFP - Plattform zeigen wir , lebenden Zellen Gittergenerierung bei mehreren Skalen und zeigen weiterhin die Anwendung des bestimmten Protokolls in den Entwicklungs Co-Kulturen (4C). Die Plattform ermöglicht es uns auch, Probenlysat Retrieval für Downstream-Analyse durchzuführen. Um die Qualität des erhaltenen Lysats zeigen, probierten wir lokal lysierten Zellen aus einem und fünf Fußabdrücke in zwei unabhängigen Experimenten, die Veränderung der DNA - Mengen zeigt , aus dem Lysat gewonnen (Abbildung 7). Hier stellen wir amplifizierte im Lysat unter Verwendung von β-Actin-Primer DNA enthielt (vorwärts: GGATGCAGAAGGAGATCACT und Reverse: CGATCCACACGGAGTACTTG<html> ) Unter Verwendung von 4 ul des neutralisierten Lysats in jeder PCR-Reaktion. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig1.jpg" /> Abbildung 1. Module des MFP - Plattform und den Kopf. (A) Die operativen Module der Plattform umfassen Spritzen, Motortische und einen Controller motorisiert. Der MFP ist mit einem motorisierten Z-Stufe verbunden, um den Spaltabstand zwischen dem Kopf und dem Substrat zu steuern, und der Substrathalter zu dem X- und Y-Motorstufen, welche die Scansystem befestigt ist. (B) Der MFP Kopf fluidischen Vias hat die Pumpstation zu verbinden, Befestigungslöcher , den Kopf auf die Z-Bühne zu montieren, und die Kanäle, die die polierte Spitze austritt. Die Spitze wird coplanar zu der Zellkultursubstrat. Symmetric Newton&#39;schen Ringe kann beobachtet werden, wenn die Spitze und das Substrat koplanar sind und in Kontakt.<html> p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig2.jpg" /> Abbildung 2. MFP - Plattform. Die hochauflösende Scan - Plattform ist mit einem bearbeiteten Kopfhalter Schnittstelle mit dem hochpräzisen motorisierte Z-Bühne. Der Substrathalter wird auf der XY Bühne für Abtastzwecke verbunden. Zur Gewinnung des Lysats für nachgeschaltete Analyse, eine 3D gedruckt Meßstation eingeklipst magnetisch an der Seite des Substrathalters (in Einschub gezeigt). Spritzenpumpen, ein inverses Mikroskop, Steuerungen und Displays rund um die Plattform befinden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Hierarchical hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC) für räumliche und zeitliche Kontrolle der Zellentfernung. (A) Schematische Darstellung eines einzelnen HFC. (B) Verschachtelte und (C) eingeklemmt Modus von hHFC Betrieb. (D) Bild des Fußabdrucks für zwei unterschiedliche Einspritz- / Absaugströmungsleitung Verhältnisse. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig4.jpg" /> Abbildung 4. Muster der Zellmonolayern des MFP verwendet wird . (A) Cell-Grid - Generation durch programmierte Abtastung des MFP auf einem MDA-MB-231 Zellschicht. Die Zellen wurden mit grünen Zelle-tracker Farbstoff gefärbt. (B) Die Grundfläche für die verschiedenen Injektionsverhältnisse (n) Auf einer MCF7 Zellmonolayer. Die schematische Darstellung zeigt die erwartete Variation in der Form des inneren HFC mit einer Änderung in n. (C) Patterned Co-Kultur durch subtraktive Strukturierung von einschichtigen MCF7 gefolgt durch Impfen MDA-MB-231 - Zellen in den Regionen abgezogen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig5.jpg" /> Abbildung 5. Schubspannung auf der Oberfläche , wenn hHFC. Die Scherbeanspruchung auf die Oberfläche steigt linear mit der inneren Einspritzflussrate anwenden. Die höchste Scherpunkt zwischen den beiden inneren Öffnungen (unten rechts im Bild), wo die Verarbeitungsflüssigkeit begrenzt (rote Fließlinien, links oben kleines Bild) gefunden. Die Abmessungen der Öffnung in der Finite-Elemente-Modell verwendet werden, sind 200, 100, 100 und 200 &amp; mgr; m für i1, i2, a1und A2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig6.jpg" /> Abbildung 6. Betriebsarten der MFP - Plattform zur Durchführung Zellentnahme und Strukturierung. (A) Schematische Darstellung des Strömungswegs für die subtraktive Strukturierung durch Zell - Lyse. Der Einfachheit halber sind nur eine von jeder Injektion und Aspiration Strömungswege dargestellt. Die Spritzen werden mit dem Ablassventil in den Pumpen gefüllt. i1 und i2 sind zum Einspritzen von Extraktionspuffer und NaOH verwendet wurden. (B) Schematische Darstellung des Strömungswegs für Lysat Erholung. Dieser Strömungspfad nach der Sammlung von Zellysat für die Analyse unter Verwendung des Strömungswegs in (A) aktiviert wird. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig6large.jpg" target="_blank">Bitte clic</a>k hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig7.jpg" /> Abbildung 7. Downstream - Analyse von DNA aus Zelllysat qPCR verwendet wird . (A) Amplification Plots von DNA in Lysat von 5 Fußabdrücke extrahiert (5 fp) und 1 - Bilanz (1 fp). Die Kontrollen wurden in beiden Fällen nach Lysat Sammlung extrahiert. (B) Schmelzkurven von DNA aus dem Lysat verstärkt , um die Qualität der extrahierten DNA zeigt. qPCR wurde durchgeführt (N = 2, n = 3) , um das β-Aktin - Gen zu verstärken. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung S" src="/files/ftp_upload/54447/54447figS.jpg" /> Abbildung S1. Eine skalierte Bild von Kanaldesign für den 6-Kanal - MFP Kopfzur Strukturierung von Experimenten verwendet. Kanäle die hHFC Durchführung sind 200, 100, 100, 200 &amp; mgr; m breit und 100 &amp; mgr; m tief. Die beiden äußersten Kanäle, die Eintauchflüssigkeit aufzufüllen sind 500 &amp; mgr; m breit und 100 &amp; mgr; m tief. Eine GSD - Datei für das gleiche Design hat sich als Ergänzung zu diesem Artikel zur Verfügung gestellt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe at JoVE.com

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

rapid-subtractive-patterning-live-cell-layers-with-microfluidic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K Aufrufe.  IBM Research - Zurich. We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Serie: Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Forschung

Biologie

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Biotechnik

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

Die Mikrofluidik-Probe: Betrieb und Nutzung für lokalisierte Oberflächenbearbeitung

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Neurowissenschaften

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Ingenieurwesen

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high throughput. In general, the acquisition of single-cell time courses from cultured cells is hampered by cell motility and diversity of cell shapes. Adhesive micro-arrays standardize single-cell conditions and facilitate image analysis. LISCA combines single-cell microarrays with scanning time-lapse microscopy and automated image processing. Here, we describe the experimental steps of taking single-cell fluorescence time courses in a LISCA format. We transfect cells adherent to a micropatterned array using mRNA encoding for enhanced green fluorescent protein (eGFP) and monitor the eGFP expression kinetics of hundreds of cells in parallel via scanning time-lapse microscopy. The image data stacks are automatically processed by newly developed software that integrates fluorescence intensity over selected cell contours to generate single-cell fluorescence time courses. We demonstrate that eGFP expression time courses after mRNA transfection are well described by a simple kinetic translation model that reveals expression and degradation rates of mRNA. Further applications of LISCA for event time correlations of multiple markers in the context of signaling apoptosis are discussed.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays LISCA - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

We present a method for the acquisition of fluorescence reporter time courses from single cells using micropatterned arrays. The protocol describes the preparation of single-cell arrays, the setup and operation of live-cell scanning time-lapse microscopy and an open-source image analysis tool for automated preselection, visual control and tracking of cell-integrated fluorescence time courses per adhesion site.

Live-Cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - eine vielseitige Technik zur Quantifizierung der zellulären Kinetik

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...