This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

Alle Protokollschritte durchgeführt wurden von der University of Missouri Animal Care und Use Committee (ACUC) überprüft und genehmigt. Für dieses Protokoll, männlichen C57BL / 6-Mäuse im Alter von 15 Wochen wurden genutzt, obwohl theoretisch jeder Nagetier in jedem Alter kann für Experimente verwendet werden. Da dies ist ein Nicht-Überlebens Operation wird Euthanasie durch Ausbluten und bilaterale Pneumothorax erreicht. 1. Durchblutung der Nieren Hinweis: Perfusion von Organen wie Herz, Leber und Niere entfernt das Blut, das mit der Interpretation der Daten beeinträchtigen kann. Daher, wenn möglich, wir perfuse immer die Organe. <ol><li> Platzieren Sie die Maus in einem Isofluran (3 ml / min) Induktionskammer, bis es unbeweglich ist. Dann entfernen Sie die Maus aus der Kammer lag es vom Rücken her auf dem Seziertisch und die Isofluran-Kegel auf der Maus Nase legen und Isofluran mit einer Rate von 1,5 ml / min durch den Regler schieben. </li><li> Schauen Sie sich die Zehe Prise response mit einer Pinzette zu beurteilen, ob das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht hat. Reinigen Sie das ventrale Abdomen mit Kochsalzlösung und schneiden Sie den Bauch mit einer Schere öffnen und die Bauchorgane drücken (aus dem OP-Feld) auf der linken Seite der Maus. </li><li> Sammeln von Blut aus der unteren Hohlvene mit einer 25-Gauge-Nadel-fixiert auf eine 1-ml-Spritze und fügen Sie sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 10 &amp; mgr; l 0,5 M EDTA. Hinweis: Ansammlung von Blut ist optional. Plasma kann für biochemische Messungen verwendet werden. Leukozyten können für die Durchflusszytometrie-Tests verwendet werden. </li><li> Mit einer Schere, machen einen kleinen Schnitt in der rechten Vorhofs die Mischung aus Blut heraus zu lassen und PBS aus dem nächsten Schritt. </li><li> Nehmen Sie eine 50-ml-Spritze und füllen mit eiskaltem PBS (20-30 cc). Als nächstes befestigen Sie den linken Ventrikel an seiner Spitze an der Spritze, durchstechen eine 21-25 G-Nadel (während das Herz sanft zwischen Pinzette) und langsam den linken Ventrikel mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS) über den Verlauf perfusevon 1-2 min. Anmerkung: Das Herz sofort nach den ersten paar Milliliter Perfusion blanches. Beachten Sie die Leber für blanchiert, da dies zeigt, dass die Perfusion Blut aus der Leber über den venösen Rückstrom durch die Hohlvene abzulassen. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass die Lunge nicht während der Infusion erweitern, da diese Einstich des rechten Ventrikels anzeigt. Wenn die Lunge zu erweitern waren, ziehen Sie die Nadel leicht nach hinten in den linken Ventrikel und die Perfusion fortzusetzen. Die Zeit vom ersten Schnitt bis Euthanasie genommen wird erreicht, weniger als 2 min </li></ol> 2. Dissection von Kidneys <ol><li> Nach Perfusion abgeschlossen ist, mit einer Schere und Pinzette die rechte Niere von ihrer Anhänge (Blutgefäße, Fett und Nebennieren) und die Verbrauch zu sezieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Kapsel die Niere Abdeckung durch Schneiden und mit einer Zange zu sezieren. Wiegen Sie die Niere. Hinweis: Mit einem Gewicht der Niere ist optional. Jedoch einige Experimentekann in Änderung Nieren Größe / Gewicht führen, die verwendet werden können, Zellausbeute pro Gramm Gewebe zu normalisieren. </li><li> Nach der Niere mit einem Gewicht, legen Sie sie in 1 ml RPMI-1640 0,5% FBS oder Zytometrie Lösung Färbepuffers (50 ml konischen Schraubdeckel Rohr) fließen und das Rohr auf Eis bis zur weiteren Verwendung in Verkehr bringen. Anmerkung: Zur Vereinfachung der Beschreibung werden wir den Rest der Isolierung von Immunzellen in der Durchflusszytometrie Färbepuffer Lösung beschreiben. Darüber hinaus werden wir die Isolierung von Immunzellen aus einem einzigen Niere beschreiben, obwohl beide Nieren oder 1 + 1/3 rd der Niere in Abhängigkeit von den nachgeschalteten Experimenten verwendet werden können (optional). 1/3 der Niere könnte für Protein / RNA - Experimente eingefroren werden und 1/3 rd kann in Puffern für die Immunhistochemie oder Transmissionselektronenmikroskopie platziert werden. </li></ol> 3. Homogenisieren von Kidneys <ol><li> Beschriften Sie eine 5-80 ml Kapazität Homogenisieren Beutel mit Probenidentifikationsinformationen,Entfernen Sie das Innere Sieb (STR) und entsorgen. Füllen Sie den Beutel mit 5 ml eiskaltem Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und übertragen Niere in den Puffer. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine zweite Probe oder mehrere Proben, die verarbeitet werden müssen. </li><li> Falten Sie die Homogenisierung Beutel in der Hälfte, so dass die eine Hälfte der Niere in der Durchflusszytometrie Färbung Pufferlösung und die andere Hälfte wird einfach umgefaltet es unter Wasser hat. </li><li> Schalten Sie das Gewebe-Homogenisator und legen Sie es auf schnelle (Einstellung) Umdrehungen pro Minute. Legen Sie das gefaltete Homogenisieren Beutel mit der Niere das Paddel zugewandt, in der Nähe der unteren Kante, aber stellen Sie sicher, dass das untere Ende der Beutel sind nicht unter dem unteren Rand der Paddel schieben. <ol><li> Verarbeiten Sie die zweite Probe gleichzeitig, wie es 2 Paddel. Wählen Sie Zeit als 120 Sekunden. Beachten Sie die Paddel hin und her bewegen, um die Nieren zu homogenisieren. Anmerkung: In der Zwischenzeit können diese Ausfallzeiten verwendet werden 2 weitere Niere herzustellen (oder anderem Gewebe) Proben während der ersten beiden verarbeiten. </li></ol&gt; </li><li> Nach dem mit dem ersten Satz der Homogenisierung Abschluss übertragen, die Taschen zu Eis und das Gewebe-Homogenisator mit dem nächsten Satz von Proben neu zu laden und so weiter. Optisch sorgen, dass die Nieren sind ausreichend homogenisiert und keine großen Brocken sind sichtbar. Hinweis: Im Allgemeinen, 2 min in das Gewebe-Homogenisator bei schnellen rpm für die Niere ausreichend ist. </li><li> Legen Sie eine 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb in den 50 ml konischen Röhrchen auf Eis. Als nächstes Pipette vollständig auf das Homogenat in die Zelle Sieb. Stellen Sie eine Bodenzentrifuge bei 50 × g für 1 min bei 4 ° C und laden Sie die Proben in die Zentrifuge. Hinweis: Die Zentrifugation wird sichergestellt, dass alle Homogenat (mit Zellen) durch die Zelle Sieb passiert hat. </li><li> Entfernen Sie die Röhrchen aus der Zentrifuge und legen Sie sie wieder auf dem Eis. Entsorgen Sie die Zelle Siebe und das Homogenat halten. In gleichem Volumen (~ 6 ml) 1x RBC Lysispuffer zu dem Zellpellet / Überstand und Pipette nach oben und unten mehrmals eine einheitliche Zellsuspension zu machen. Visually, sofort ein Teil der roten Farbe in der Suspension Abnahme beobachten. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 5 min maximale RBC-Lyse zu erreichen. Hinweis: der Schritt RBC-Lyse kann übersprungen werden, wenn die Ermittler der Nierenperfusion zuversichtlich ist und weniger Zellmanipulation erwünscht ist. Wir haben nicht durch Unterwerfen der Zellsuspension auf RBC-Lyse eine signifikante Zunahme der Nierenzellausbeute beobachtet. </li><li> Dreh die Röhrchen in der Zentrifuge, die mit 500 xg eingestellt wurde, 4 ° C für 5 min ein Zellpellet zu bilden. Hinweis: Während der Schritte 3.6 und 3.7, bereiten für kolloidales Siliciumdioxid (Percoll) basiert Dichtegradientenzentrifugation. <ol><li> Nehmen Sie sich 10 ml Rundbodenpolypropylenröhrchen und beschriften sie mit entsprechenden Probennummern und legen Sie sie in einem Rohrgestell. Hinweis: Im Folgenden wird beschrieben, wie genug Dichtegradienten Reagenzien für 4 Nierenproben zu machen. </li><li> Nehmen Sie 7 ml Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und Pipette in eine 15 ml konischen Röhrchen. 1 ml 2 M Sucrosevorbereiten 0,25 M Saccharose. </li><li> Dann nehmen Sie es 7,2 ml Dichtegradient Reagenz und Pipette in weiteren 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen 1,55 ml Durchflusszytometrie Staining Pufferlösung und 1,25 ml 2 M Saccharose 72% Dichtegradienten-Reagenz herzustellen und 0,25 M Sucrose. </li><li> Pipette 1 ml 72% Dichtegradienten Reagenz in einem runden Boden Polypropylen-Röhrchen für jede Probe. </li></ol></li></ol> 4. Gradientenzentrifugation <ol><li> Nach dem Schritt 3.7, nehmen Sie die Schläuche aus und vorsichtig den Überstand in einer fließenden Bewegung dekantieren und auch den nächsten Tropfen Flüssigkeit abgießen, die das Rohr bildet, während der Oberseite nach unten gehalten wird. Hinweis: Dieser Schritt seit dem Verlassen hinter überschüssige Flüssigkeit wichtig ist, kann genug, um die Dichte Gradienten ändern Variation der Renditen zu schaffen. Wenn das Rohr zurückversetzt ist aufrecht, ~ 200-300 ul Flüssigkeit bleibt mit dem Zellpellet. </li><li> Pipette 1 ml 0,25 M Saccharose auf die Pellet-Zelle und vorsichtig, aber kräftig pipettieren nach oben und unten zu bring die Zellen zu einer einheitlichen Suspension. Als Nächstes fügen Sie 1 ml 72% Dichtegradienten Reagenz (3.7.4) und erneut kräftig pipettieren um die Zellen zu mischen, um eine 36% Dichtegradienten Reagenz zur Bildung der Zellsuspension. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der 72% Dichtegradienten Reagenz in einem Polypropylen-Pasteur (Transfer) Pipette. Mit gleichmäßigen Druck auf die Lampe (hält die Flüssigkeitssäule in der Spitze und verhindert Blasenbildung), legen Sie die Pasteur-Pipette auf den Boden der Zellsuspension (36% Dichtegradienten Reagenz) sanft und Entladen der 72% Dichtegradienten Reagenz zur Bildung eines deutliche schwerere Schicht. </li><li> Wählen Sie die Probenröhrchen vorsichtig aufnehmen und in die Zentrifuge, die bei Raumtemperatur für diesen Schritt ist. Spin für 20-30 Minuten bei 500 x g. </li><li> Inzwischen bereiten zwei weitere Sätze von Polypropylen Rundboden-Zentrifugenröhrchen mit den entsprechenden Probenkennungen. </li><li> Nach dem Schritt 4.4 abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe vorsichtig Polypropylen-Röhrchen, die mit minimalem Schütteln und setzte es abauf dem Rohrgestell. </li><li> Pick-up die erste Probenröhrchen und der entsprechenden Leerrohr. Mit einer Polypropylen-Pasteur-Pipette vorsichtig, aber gründlich mit gemessenen Sog, entfernen Sie die obere &quot;Junk-Schicht&quot; oder &quot;klebriges Material&quot; und legte sie in den leeren Rundbodenzentrifugenröhrchen. <ol><li> Gehen Sie den oberen Teil des Gradienten, bis die &quot;Leukozytenmanschette&quot; Entfernen erreicht ist (mit einem Rotstich [roten Blutkörperchen] off-weiß erscheinen). Stop Absaugen wenn eine Höhe von ca. 3 mm aus der &quot;buffy coat&quot; erreicht ist. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass dieses Zeug vollständig aus dem oberen Teil des Gradienten, bevor Sie fortfahren Sog weg ist. </li></ol></li><li> Nehmen Sie eine frische Pasteur-Pipette und eine neue Rundboden-Zentrifugenröhrchen und sanft die Leukozytenmanschette entfernen. Weiterhin abzusaugen 3 bis 5 mm unterhalb der buffy coat, um sicherzustellen , dass die meisten Zellen werden gesammelt und zu der 2 nd neue Rundbodenröhrchen mit geeigneten Abtastidentifizierer. </li><li> In 1-2 ml of Flow Cytometry Färbepuffers Lösung der 2. Röhre und gründlich durch Auf- und Abpipettieren mischen. </li><li> Drehen, um die Zellen bei 500 · g für 5 min bei 4 ° C. A 2. Waschschritt mit Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung ist optional. Resuspendieren in 500 ul Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und gehen Zellen zu zählen eine Zählkammer. </li></ol> 5. Optional (Cell Labeling) <ol><li> Aliquot jeder Probe für die gleiche Anzahl von Zellen. Fügen Sie den blockierenden Antikörper bei einer Verdünnung von 0,5 g pro 10 6 Zellen (Anti - CD16 / CD32 FcR) und Inkubation auf Eis für 15 min. </li><li> Fügen Sie die gewünschte Cocktail von primären Antikörpern (konjugiert an die entsprechenden Fluorophore), die bestimmt sind gut durch den Prüfer miteinander zu arbeiten, vor den eigentlichen Experimenten. Inkubieren auf Eis für 30 min. Waschen der Zellen mit PBS. Hinweis: Für die Demonstration der Niere Immunzellmarkierung für dieses Manuskript verwendeten wir ein T-lymphocyte und Makrophagen / dendritischen Zellen-Panel. Die T-Lymphozyten-Panel bestand aus Fixable Viability Stain FVS510, anti-CD45 (Klon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (Klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Klon: 53-6,7) BV785. Die Makrophagen-Panel bestand aus Fixable Viability Stain FVS510, anti-CD45 (Klon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, Anti-CD11b (Klon: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Klon: BM8) APC, Anti-CD11c (Klon: N418) BV785. </li><li> Fügen Sie den Fixable Viability Fleck und lassen auf Benchtop-5 min. Waschen Sie die Zellen mit Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung Überschuss der fixierbaren Viability Fleck zu entfernen. </li><li> In Fixierung / Permeabilisierung Reagenz und Inkubation über Nacht bei 4 ºC. Waschen Sie in Permeabilisierung Lösung. </li><li> Für die intrazelluläre Fleck, Block wieder mit anti-CD16 / 32 FcR 10min. Fügen Sie die intrazellulären Flecken und Inkubation für 20-30 min. Wash 2x in permeabilization Lösung. </li><li> Resuspendieren in Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und Laufproben durch FACS - Maschine 3,9. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben hier eine Methode vorgestellt, um Immunzellen aus der Niere in einer zuverlässigen und effizienten Weise zu erhalten. Der Haupt Modifikation der weit verbreiteten Kollagenaseverdau Schritt (mechanische Zerstörung von Gewebe) spart ca. 30 min und die Isolierung einer großen Anzahl von lebensfähigen Immunzellen dauert weniger als zwei Stunden für 4 Nierenproben. Darüber hinaus abhängig von unserer Forschungsfrage, wir jetzt nur eine einzige Niere verwenden für unsere Immunzellisolierung und routinemäßig 2 x 10 6 Zellen erhalten ~ (die andere Niere kann für die Proteinanalyse durch Western - Blots, Immunhistochemie und mRNA - Analyse mittels PCR verwendet werden) pro Isolation. Wir haben dieses Verfahren verwendet, um große Anzahl von Immunzellen aus der Leber und Herz zu isolieren (Multienzymdigestion für das Herz mit einer mechanischen Störung kombiniert, Daten nicht gezeigt), sind aber sicher, dass das mechanische Zerreißen kann auf andere nicht-faserige Gewebe wie die angewendet werden Gehirn 16. Wie bei jedem Protokoll istolade Immunzellen aus dem Gewebe, zum Detail haften für den Erfolg entscheidend ist. Wenn Perfusion der Niere kritisch ist, dann wird der Praxis benötigt, um die Nadel in das Herz bei der Platzierung aus Fibrillieren zu verhindern oder zu weit an den rechten Ventrikel eindringt. Eine Alternative eine Nadel in das Herz zu bringen ist , die Aorta oberhalb der Nierenarterie und kanülieren perfundieren die Nieren 8. Darüber hinaus gibt es weitere Vorschläge von den Autoren die Isolierung von Immunzellen zuverlässig und gleichmäßig zu machen. Die Nieren sollten ausreichend püriert und keine großen Brocken sollte sichtbar sein. Ist dies nicht der Fall ist, dann Wiederholung der mechanischen Störung sollte das Problem lösen. Die mechanisch zerstört Gewebe sollte durch die richtige Größe Filter geleitet werden, um Zellen aller Größen aufzunehmen. Zum Beispiel können einige Makrophagen / dendritischen Zellen Populationen bei Verwendung eines 40 &amp; mgr; m mesh, im Gegensatz ausgeschlossen werden kann, um unter Verwendung variieren, um eine 100 &amp; mgr; m mesh (Makrophagen / dendritischen Zellgrößen zwischen10-40 &amp; mgr; m). Jedoch auf der anderen Seite mehr Nierenepithelzellen und anderen Zellen konnten in der abschließenden Analyse Veränderung der Prozentsätze der Immunzellpopulationen enthalten sein. Wir glauben, dass alle erhöht die Vertretung unterrepräsentierter Bevölkerungsgruppen einschließlich sein und verbessert somit die Zuverlässigkeit der prep. Bei der Zugabe der Zellsuspension zu dem Dichtegradienten Reagenz sollten die Zellen in nicht mehr als 200-300 ul der Lösung Färbepuffer Durchflusszytometrie resuspendiert werden. Die Bildung des 36%: 72% Steigung sollte sichergestellt werden. Dazu Einführung der Transferpipette die 72% Dichtegradienten Reagenz in die 36% Dichtegradienten Reagenz tragen sollte schonend sein, sollten keine Blasen und eine klare Abgrenzung lassen zwischen den Steigungen gesehen. So weit wie möglich, Zentrifugation von Zellen in Dichtegradienten Reagenz sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Vollständige Entfernung der &quot;Zelltrümmer&quot; an der Oberseite des Gradienten nach dem sStift sollte sichergestellt werden. Ansonsten wird es mit der Zellausbeute und die Qualität der prep stören. Achten Sie darauf, die kleinsten Zellen auf dem Hämocytometer auszuschließen. Diese werden über RBCs links. Dies ist besonders wichtig, wenn die RBC-Lyse Schritt weggelassen wird. Es gibt eine Einschränkung auf das Verfahren. Nicht jeder Zelle diese Methode isoliert unter Verwendung ist eine Immunzelle. Ein großer Prozentsatz der Zellen sind Epithelzellen (einschließlich des proximalen Tubulus, distalen Tubuli und Glomeruli). Allerdings kann diese Einschränkung Vorteil eines Forschers als Fragen können in Bezug auf Nicht-Immunzellen werden beantwortet werden. Zum Schluss wird das Verfahren zur Isolierung von Immunzellen aus der Niere hier präsentierten breit anwendbar und kann von den meisten Labors zu ihrer Forschung angepasst werden. Wir glauben, dass diese Technik kann auch für andere nicht-faserige Gewebe wie Leber und im Gehirn verwendet werden. Isolierung einer großen Anzahl von Immunzellen wird auch anspruchsvollere Downstream Experimente wie Pro-Hilfe zu entwerfenProliferation-Assays, Assays Zytokinsekretion und die Isolierung einer Teilmenge von Oberflächenantigenen auf Zellen basiert. Letztlich hoffen wir , dass diese Methode Immunzellisolierung standardisieren wird also verschiedene Ebenen der enzymatischen Abbau von Oberflächenantigenen zu vermeiden.

Aktivierung des Immunsystems kommt in mehrere Nierenerkrankungen und pathophysiologischen Prozessen 6,10,11,13. Mögliche Bereiche der aktiven Forschung umfassen die verschiedenen Auslöser für die Aktivierung des Immunsystems, verschiedene Zelltypen beteiligt sind, das Cytokin / Chemokin-Muster in einer bestimmten Krankheit Einstellung, Modulation aller der zuvor genannten Verfahren durch ein bestimmtes Medikament usw. Zur Veranschaulichung, in der Ischämie-Reperfusion Schädigung (ein Modell für akutes Nierenversagen), eine Zunahme der Immunzellen oder Knochenmark hämatopoetische Zellen oder CD45 + Zellen innerhalb weniger Stunden abgeleitet ist, die durch die Zeit der Reparatur oder Fibrose (6 Wochen später) 5 aufrechterhalten wird, 12. Diese Immunzellen sekretieren sowohl pro-inflammatorische und anti-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen , den Prozess der Reparatur 5,12 zu dirigieren. Derzeit ist die Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Fluorophore zu verwenden Zellpopulationen in einer Einzelzellsuspension zu etikettieren ist mit der Anzeige erhöhtEntlüftung der modernen Durchflusszytometrie Maschinen mit vier vor fünf Lasern. Dies hat zu der Fähigkeit , im wesentlichen zugegeben , um die Zellpopulationen auf ihren funktionellen Status 3,7 basierend zu unterscheiden. Zum Beispiel, beschriften , um genau die Makrophagen als F4 / 80 niedrig CD11b hoch Ly6b hohe CD206 niedrig, mindestens 3 weitere Fluorophore würde in der gleichen Probenvolumen Tor für lebende Zellen, CD45 + (Leukozyten) und Ly6G- (Neutrophile) benötigt werden und dies ist sehr viel möglich mit der neueren Durchflusszytometer 3. Jedoch sind die stromabwärts Assays für Zytokinsekretion, Zellproliferation, Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung und die Quantifizierung der Anzahl von verschiedenen Untergruppen von Lymphozyten und Monozyten braucht nicht nur gute Qualität (lebenden Zellen, Singuletts), aber eine ausreichende Anzahl von Zellen. Das Immunsystem in der Niere wird sowohl nach oben als adaptiver und angeborene Komponenten und mehrere Zelltypen 1,7,13. Zum Beispiel bei Mäusen die zwei Kinderneys zusammen berichtet 2-17% (28,000-266,000) CD45 + Zellen der Niere Gesamtimmunzellen zu enthalten , isoliert (1,4 x 10 6 Zellen) und etwa 5-15% (1,400-4,200) von diesen sind CD4 + Zellen 1 , 5,12. Ein kleiner Prozentsatz (5-15%, 70-630) dieser CD4 + FoxP3 + Zellen sind Zellen (Abbildung 1) 1. Aufgrund dieser schrittweise Verringerungen der Prozentsätze der Zellen, die manchmal der Zellpopulation von Interesse (in diesem Fall CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen) durch eine bloße ~ 100 Zellen dargestellt. Die geringe Zahl der CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen macht es zwingend notwendig, dass eine große Anzahl von Gesamtzellen werden isoliert und die Zellen sind von guter Qualität für nachfolgende Studien wie Zytokinsekretion Assays. Außerdem kann es notwendig sein, den Nieren von 2 bis 3 Mäusen zu kombinieren, da die Subpopulationen sind nicht in ausreichend hohen Zahlen repräsentiert, um quantifizierbare Assays durchzuführen. Daher zuverlässige und effiziente Isolierung von Nieren mononukleären Zellpopulationen ist wünschenswert, um zu verziereny die immunologische Spektrum mit Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht. Traditionell für die Isolierung von Nieren mononukleären Zellen, haben Forscher eine Vielzahl von enzymatischen Verdauungen wie Kollagenase 1A oder II einschließlich DNase 1 1,5,12 verwendet. Es ist bekannt , daß Kollagenasen enzymatische Aktivität haben , die mit Chargennummern und von der Firma Herstellungs variiert, erfordert Titration für die optimale Konzentration und Dauer der Inkubation 4,14,15. Zusätzlich Verdau mit Kollagenase Zeit für Zerhacken der Niere in kleine Stücke fügt erfordert Inkubation der Nierenstücke in einem geheizten (37 ° C) Bad und zusätzliche Zeit für die Inkubation in EDTA für die Reaktion zu stoppen. Zusätzlich können weniger Sterilität für einige nachgeschaltete Verfahren Kultur benötigen Zelle erreicht werden. Noch wichtiger ist, je nach Prüfer und alle beteiligten Variablen, führt es über Laboratorien in den Daten und Interpretation der Variabilität. Vor kurzem mit derEntwicklung der mechanischen Gewebe Disruptoren / Homogenisatoren 16 wird die Kollagenase - Verdauungsschritt vollständig vermieden und durch eine einfache mechanische Aufschluß der Nieren 2 ersetzt. Hier zeigen wir eine einfache, aber effiziente Methode zur Isolierung von Nierenimmunzellen für die tägliche Immunzellextrakte. Wichtig ist , dass diese Technik auf andere weiche und nicht-faserigen Geweben wie der Leber und im Gehirn 16 angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster lab system</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Classic bags</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Analytical flow cytometer</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tubes, no cap</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FVS510,&amp;nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&amp;nbsp; BV421&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m filter&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette fine tip</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow Cytometery Staining Buffer Solution</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC Lysis Buffer</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Die Anzahl der Platten, die von der Anzahl der Immunzellen kann ausgeführt abhängt, die aus den Nieren zuverlässig extrahiert werden kann. Hier zeigen wir die Möglichkeit, zwei Platten zu laufen, eine für T-Lymphozyten und eine für Makrophagen / dendritischen Zellen. Auf der T-Lymphozyten - Panel, wir in der Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Muster und beschreiben die Bevölkerung von Interesse schauen zuerst , wie in Abbildung 1 (oben links Punkt - Diagramm) gezeigt. Als nächstes wird eine Lebensfähigkeit Marker, in diesem Fall eine fixierbare Lebensfähigkeit Fleck (FVS510) die toten Zellen aus der Analyse (Abbildung 1, oben in der Mitte Dot - Plot) auszuschließen verwendet. CD45, einem Marker für die Knochenmark stamm hämatopoetischen Zellen wird typischerweise verwendet , um die Niere Immunzellen zu umreißen und diese liegt typischerweise im Bereich von 2 bis 18% der gesamten Nierenimmunzellen in Abhängigkeit von dem Alter, dem Geschlecht, Dehnung, entzündlicher Zustand der Maus (Fig 1, oben rechts Punktdiagramm). Von der CD45 + </<html> sup&gt; Knochenmark hämatopoetische Zellen abgeleitet sind , kann man entweder Tor auf CD3 epsilon als Marker für T-Lymphozyten oder weiter mit CD4 + / CD8 + der Effektor / zytotoxischen Zellen aus dem Knochenmark stamm hämatopoetischen Zellen (Abbildung 1, rechts unten zu trennen dot-Blot). Typischerweise mehr CD4 + als CD8 + Zellen zu sehen sind. Die weitere Charakterisierung der CD4 + Zellen ergab ~ 8,8% FoxP3 + Zellen , die wahrscheinlich T-regulatorischen Zellen (Abbildung 1, unten Mitte Punktdiagramm) sind. welche Teilmenge zu unterscheiden, verändert in Abhängigkeit von der Population von Interesse Weitere detaillierte Charakterisierung Marker wie CD25 und CD127 umfassen kann. CD127 ist weitgehend ein Marker für FoxP3- Zellen und dies wird durch Verwendung von CD44 als Marker für die Aktivierung, CD44 + CD127 lo / seziert - am besten aktivierte Effektor - Zellen ähneln im Vergleich zu CD44 + CD127 + Zellen, die am besten Effektor - Memory - Zellen ähneln. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Für die Makrophagen / dendritischen Zellen - Panel, sind die ersten Tore gleich, einschließlich der FVS510 basierte Trennung von Live / Dead (Abbildung 2, oben 2. von links dot Grundstück) und CD45 - Gates , die dem Knochenmark hämatopoetische Zellen (oben 2. von rechts Punktdiagramm zu trennen). Als nächstes werden die CD45 + Zellen mehrere Möglichkeiten gated werden können. Wir gated sie auf Ly6G hier Neutrophile aus dem Rest der Monozyten dh zu trennen Makrophagen / dendritischen Zellen, (Abbildung 2, oben rechts Punktdiagramm). Als nächstes wurden Ly6G- Zellen gated auf CD11b und F4 / 80 Untergruppen von Makrophagen und dendritischen Zellen (Abbildung 2, unten 2. von links Punktdiagramm) zu identifizieren. Gating auf Ly6C den Prozentsatz der Infiltration / entzündlichen Monozyten / Makrophagen (unten 2. von rechts Histogramm) und CCR2 und CX3CR1 identifiziert identifiziert die Makrophagen , die (Abbildung 2, unten rechts Punktdiagramm). unten links mos rekrutiertt-Panel identifiziert die meisten Zellen als dendritische Zellen, einen unteren Abschnitt, von denen über CCR2-Expression rekrutiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54368/54368fig1.jpg" /> Abb . 1: Repräsentative Dot Plots T-Lymphozyten - Subset Isolation angezeigte Bild oben links ist ein typisches nach vorne (FSC) und Seite (SSC) Streuprofil von Nierenimmunzellen in der Flo Jo - Software. Top Mitteltafel ist gated auf einem Fixable Viability Stain (FVS510) und der Live-Bevölkerung auf der linken Seite wird dann auf CD45 für Knochenmark abgeleiteten Immunzellen gated. CD45 + Zellen werden für CD4 (Effektor) und CD8 (zytotoxische) Zellen (Lower rechts) gated. Mittlere Feld zeigt die Anzahl von CD4 + Zellen , die FoxP3 + (T regulatorischen Zellen) sind. Die linke untere Platte versucht , wie viele der CD4 + Zellen Foxp3- herauszukitzeln aktiviert Effektor CD44 + CD127 lo / - im Vergleich zu Gedächtnis - Effektor - CD44 + CD127 <sup&gt; +. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54368/54368fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54368/54368fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54368/54368fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Monozyten-Cell Subset Isolation Repräsentative Dot - Plots angezeigt Wieder ist oben links ein typisches vorne (FSC) und Seite (SSC) Streuprofil von Nierenimmunzellen in der Flo Jo - Software. Top 2. von links Punktauftragung ist gated auf einem Fixable Viability Stain (FVS510) und der Live - Bevölkerung auf der linken Seite wird dann gated auf CD45 für Knochenmark abgeleiteten Immunzellen (Top 2.vr Punktauftragung). CD45 + Zellen werden für Ly6G (Neutrophile, oben rechts Punktdiagramm), um gated für Makrophagen und dendritischen Zellen zu trennen. Gating auf Ly6C identifiziert den Prozentsatz der Infiltration / entzündlichen Monozyten / Makrophagen (bottom 2.vr Histogramm) und CCR2 und CX3CR1 identifiziert die Makrophagen , die (Abbildung 2, unten rechts Dot - Plot) rekrutiert. Unten links die meisten Panel meisten Zellen wie dendritischen Zellen identifiziert, ein unterer Teil davon über CCR2 Ausdruck rekrutiert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54368/54368fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54368/54368fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Tabelle 1:. Reagenzien und Benötigte Ausrüstung für die Immunzellisolierung aus der Niere siehe Materialien Tabelle. Tabelle 2:. Die Tabelle , welche insgesamt Zellen und CD45 + Getrennt in den entsprechenden Prep <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54368/Table2.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54368/Table2.xlsx" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

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Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K Aufrufe.  Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital. Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Serie: Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Biotechnik

Rapid Depletion of Renal Macrophages using Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

Renal macrophages (RMs) are essential for kidney health, orchestrating immune surveillance, tissue homeostasis, and responses to injury. Previously, we reported the use of a human CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) cell ablation tool to study the distinct fate, dynamics, and niches of RMs of bone marrow or embryonic origin. RMs originate from yolk sac-derived macrophages, fetal liver monocytes, and bone marrow-derived monocytes and are maintained in adulthood through local proliferation and recruitment of circulating monocytes. Here, we report a detailed protocol for the selective ablation of RMs to study their regeneration, including 1) generation and characterization of the Cre-inducible expression of hCD59 in mouse RMs, 2) purification of ILY and characterization of ILY activity, 3) induction of hCD59 expression on RMs in compound mice, and 4) characterization of regeneration after ILY-mediated RM ablation. ILY specifically and rapidly depletes RMs in compound mice, with efficient macrophage ablation within 1 day of ILY administration. Renal macrophage regeneration began by day 3 post-ablation, with ~88% recovery by day 7. This model offers a powerful tool for studying macrophage biology and can be used for selectively ablating other cell populations in the kidney, liver, and fatty tissues to investigate their function and regeneration.

A protocol is reported here for the selective ablation of renal macrophages to study their regeneration using the human CD59/intermedilysin cell ablation tool. This method is also applicable for studying the function and regeneration of the other cell populations in the kidney, liver, and fatty tissue.

Schnelle Depletion von Nierenmakrophagen mit humanem CD59/Intermedilysin-Zellablationswerkzeug

Renal macrophages (RMs) are essential for kidney health, orchestrating immune surveillance, tissue homeostasis, and responses to injury. Previously, we ...

Entwicklungsbiologie

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and transplantation. Perivascular Stromal Cells (PSCs) share characteristics with bone marrow MSCs (bmMSCs). However, they also possess, most likely due to local imprinting, tissue-specific properties and play a role in local tissue homeostasis. This tissue specificity may result in tissue specific repair, also within the human kidney. We previously showed that human kidney PSCs (kPSCs) have enhanced kidney epithelial wound healing whereas bmMSCs did not have this potential. Moreover, kPSCs can ameliorate kidney injury in vivo. Therefore, kPSCs constitute an interesting source for cell therapy, particularly for kidney diseases and renal transplantation. Here we show the detailed isolation and culture method for kPSCs from transplant-grade human kidneys based on whole-organ perfusion of digestive enzymes via the renal artery and enrichment for the perivascular marker NG2. In this way, large cell quantities can be obtained that are suitable for cellular therapy.

Here we present a novel clinical grade isolation and culture method for kidney Perivascular Stromal Cells (kPSCs) based on whole organ perfusion with digestive enzymes and NG2-cell enrichment. With this method, it is possible to acquire sufficient cell numbers for cellular therapy.

Eine neue klinische Grade Isolationsmethode für menschliche Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Medizin

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal failure. In recent years, the involvement of microRNAs (miRNAs) has been reported in the pathogenesis of IgA nephropathy. However, there is no established method for profiling miRNAs in IgA nephropathy using small animal models. Therefore, we developed a reliable method for analyzing miRNA in the kidney of an IgA mouse model (HIGA mouse). The goal of this protocol is to detect the altered expression levels of miRNAs in the kidneys of HIGA mice when compared with the levels in kidneys of control mice. In brief, this method consists of four steps: 1) obtaining kidney samples from HIGA mice; 2) purifying total RNA from kidney samples; 3) synthesizing complementary DNA from total RNA; and 4) quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) of miRNAs. Using this method, we successfully detected the expression levels of several miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p, and miR-21-5p) in the kidneys of HIGA mice. This new method can be applied to other studies profiling miRNAs in IgA nephropathy.

microRNAs are involved in the pathogenesis of IgA nephropathy. We have developed a reliable method for detecting microRNA expression levels in the kidneys of an IgA nephropathy mouse model (HIGA mice). This new method will facilitate to check for miRNAs involvement in IgA nephropathy.

Nachweis der MicroRNA-Expression in den Nieren von Immunglobulin A nephropathischen Mäusen

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

Eine effiziente Methode der Absiebung, intakten Glomeruli von Erwachsenen Ratte Niere zu isolieren

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Biologie

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for isolating, purifying, and culturing glomerular MCs have been developed and optimized since the 1980s for use in biomedical research, particularly in the field of nephrology. Mice are the most frequently used experimental animal models in research on renal diseases. In this study, we developed an optimized protocol for murine MCs isolation and ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression. This optimized approach significantly reduces the study duration for researchers and enables long-term cell preservation. The necessary equipment for the procedures is easily accessible in a basic biomedical laboratory, and the procedural steps are straightforward. The acquisition of target cells requires only 2-3 weeks, a reduction of at least 1 week compared to existing methods.

This study developed an optimized protocol for the isolation of murine mesangial cells (MCs) and their ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression.

Optimierung der Isolierung und Reinigung von murinen glomerulären Mesangialzellen

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for ...