This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Ethik-Erklärung: Die Vollblut-Proben in dieser Studie verwendet werden, nicht am Menschen zu sein Forschung. Die Proben wurden für klinische Diagnosezwecke erhalten, die erfüllt waren, und der restliche Teil dieser Proben wurde für die FINA Forschungs Assay bereitgestellt. Die Proben wurden so codiert, daß die Forscher die Identität von Personen nicht in der Lage, ohne weiteres festzustellen waren. 1. Herstellung von FINA Probenvorbereitungsmodul <ol><li> Bereiten Sie Pad Blotting eine 35 x 35 mm 2 einer 2,6 mm dicken 100% Baumwolle - Pad durch Schneiden. Schneiden Sie ein Pad pro Probe. </li><li> Bereiten Kunststoff Paraffinfilm mit einem Papierträgerband durch ein Schneidstück Paraffinfilm (25 mm (h) von 50 mm (w)) und dann eine 7,14 mm Durchmesser Loch in der Mitte des Bandes Stanzen eines Hammer angetrieben Locher mit. Bereiten Sie eine Band pro Probe. </li><li> Bereiten Sie ein gebundenes Glas Bluttrennmembran (Capture-Membran) Scheibe durch einen 8,35 mm Durchmesser-Kreis Stanzenmit einem Hammer angetrieben Locher. Lochen eine Platte pro Probe. Die Scheibe hat eine Partikelrückhaltevermögen von 2,3 &amp; mgr; m. </li><li> Montieren Sie die FINA Probenvorbereitungsmodul durch die Aufnahmeplatte in der Mitte der Schreibunterlage mit einer Pinzette platziert. Legen Sie das Paraffin Filmband über die Capture-Scheibe, so dass das Loch des Paraffins Band in der Mitte der Fangplatte ausgesetzt verlässt. </li><li> Stellen Sie sicher, einen maximalen Kontakt zwischen der Platte und dem Löschblatt durch das Paraffin Band dehnen leicht die Schreibunterlage und Drücken des Paraffin Band zu bedecken fest an die Schreibunterlage zu bleiben, um alle Kanten der Platte. </li><li> Machen Sie so viele Module wie für das Experiment oder Halde für die zukünftige Verwendung benötigt. </li></ol> 2. Herstellung von qPCR-Schlauch <ol><li> Vorbereiten eines 5,1 mm-Bandscheibe, die die Zelle Einfangmembran auf der Seite der qPCR Röhre verankern wird die Membran von Blockierung der Fluoreszenzdetektion durch Stanzen eines Kreises von doppelt beschichteten polye zu verhindernster Diagnoseband mit einem Hammer angetriebenen Stempel aus einem Blatt des Bandes. Bereiten Sie eine Bandscheibe pro Probe. </li><li> Entfernen Sie eine Seite der Aufkleber Schiff der Band. Legen das Band in einem 200 &amp; mgr; l PCR-Röhrchen, das auf der einen Seite und in Richtung der Unterseite des Rohres haften. Entfernen Sie den zweiten Sticker-Liner. Das Rohr ist nun fertig vorbereitete Platte zu erhalten. </li><li> Produzieren Sie so viele Rohre wie für das Experiment oder Halde für die zukünftige Verwendung benötigt. </li></ol> 3. Contrive Blutprobe Hinweis: Wenn ein echter Testprobe vorbereitet wird, gehen Sie zu Schritt 4. <ol><li> Thaw 8E5-LAV - Zellen 15 eine einzige Kopie der HIV-1 - Provirus erhalten aus der Virologie Qualitätssicherung Labor beherbergen (VQA; Eile Presbyterian / St Lukes Medical Center, Chicago, IL.). Hinweis: sie gespeichert sind, als gefrorene Zellpellets in einer Konzentration von 4.000 Zellen / &amp; mgr; l. Zellzahl wurde zuvor 9 wie beschrieben verifiziert. </li><li> bereiten serial Verdünnungsmedium (90% fötales Rinderserum, 10% Dimethylsulfoxid) auf Konzentrationen von 1 bis 400 Zellen / ul in einfriert. </li><li> Pipette 10 ul Zellen aus jedem der seriellen Verdünnungen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l Frisch HIV-1 negativen EDTA behandelt Vollblutprobe in jedes Röhrchen 10-4,000 eine Standardkurve von 8E5-LAV-Kopienzahlen zu erstellen. Mischen Sie vorsichtig den Boden der Röhre 5 mal schnippen. </li></ol> 4. Führen Sie FINA-Extraktion <ol><li> Lyse Blutzellen durch Zugabe von Triton-X100) bis zu einer Endkonzentration von 1% (11 &amp; mgr; l 10% Triton-X100 bis 110 &amp; mgr; l Vollblut und Zellen aus Schritt 3.3). </li><li> Mischen Sie vorsichtig den Boden der Röhre 5 mal schnippen. Das Blut sollte durchscheinend rot. </li><li> Pipettieren alle der Blutprobe auf die Capture-Platte. Hinweis: Eine wasserdichte Abdichtung zwischen dem Paraffin Band und der Einfangmembran stellt sicher, daß das Blut die Membran fließt, und einen guten Kontakt zwischen dem Erfassungs membrane und Schreibunterlage Montage sorgt für eine schnelle Probe Feuchtigkeitstransport. </li><li> Lassen Sie Probe durch den Filter zu tränken. Hinweis: Die Blut-Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Capture-Platte zu erfassen. Das Lysat wurde in die Scheibe eingetaucht, wenn es matt erscheint. </li><li> In 600-1.000 &amp; mgr; l 10 mM NaOH tropfenweise auf die Capture-Platte. Hinweis: Die Pufferwäsche kann auch als bulk Zugabe von 600 &amp; mgr; l zugegeben werden. Der Puffer wird ein Tröpfchen auf dem hydrophoben Paraffinband bilden und in etwa 20 sec auf die Platte durch das Loch Docht. Der Filter wird von rot auf weiß anzeigt, Clearance von Hämoglobin ändern. </li><li> Trennen Sie die Diskette aus dem Löschblatt mit einer Zange und ziehen Sie die Platte auf das Band in die vorbereitete PCR-Röhrchen. Wenn es eine rote Farbe auf dem Filter hinzufügen, 50-100 &amp; mgr; l Waschpuffer gelassen ist, den Filter zu löschen, bevor in die Röhre platzieren. Hinweis: Gelegentlich kam es Überdruck angewendet bei der Herstellung vondie FINA-Module Ergebnisse in Partitionierung der Membranschichten während der Trennung von der Schreibunterlage. Entsorgen Sie diese Disketten und bereiten eine neue Probe. </li><li> Nachdem der Filter in dem PCR-Röhrchen platziert wird, analysieren die Proben sofort. Alternativ trocken über Nacht in einem Karton mit Calciumsulfat Trocken, dann verschließen und in einen Folienbeutel mit Kieselsäure Trocken- und Speicher bis zur Analyse bereit. </li></ol> 5. qPCR-Reaktion <ol><li> Bereiten Sie 100 ul qPCR Mastermix pro Reaktion unter Verwendung von HIV - spezifische Primer und Sonden , wie zuvor beschrieben 9,11. Umfassen eine interne Amplifikationskontrolle für die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten Inhibitoren zu überwachen und zu überprüfen, ob eine negative Probe ein wahrer negativ ist. Stellen Sie sicher, dass der Filter vollständig mit Mastermix abgedeckt ist und dass der Filter zur Seite des Rohres während der gesamten Reaktions fixiert bleibt. </li><li> Für die Amplifikation eine Echtzeit - PCR - Gerät , wie zuvor 9 beschrieben. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

EID verbunden schnelle Behandlung Zugang hat sich gezeigt , die Kindersterblichkeit zu reduzieren aufgrund einer HIV - Infektion 16. Aufgrund der Persistenz der mütterlichen Antikörper bei einem Säugling Blut haben Dienstprogramm schnellen HIV-Antikörper-Tests begrenzt den Status von HIV-exponierten Neugeborenen bei der Bestimmung. Die WHO empfiehlt , dass alle Kinder von HIV-1 - positiven Müttern geboren sollte bei 4-6 Wochen alt getestet werden, eine virologische Test 17 ​​verwendet wird . Wir haben die Entwicklung eines Assays für den Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1 proviralen DNA in Vollblutproben berichtet , die mit zeigten 100% Sensitivität und Spezifität in einem kleinen Feldauswertung von 61 South African Säuglinge 11 fähig Einzelkopie - Erkennung ist. Einhundert Mikroliter oder mehr Vollblut können über Finger oder Ferse - Stick und verarbeitet über die FINA - Module 18,19 gesammelt werden. Diese Blutproben können dann für mindestens einen Monat gelagert werden, vor der Verstärkung macht diese Methode ideal für Säuglinge zu testen, die weit von den Labors sind. In der Studie in Abbildung 3 wird eine Standardkurve von gekünstelt Proben von HIV-1 negativen Vollblut gespickt mit aufgetauten Zellen DNA - HIV-1 - Provirus beherberge dargestellt. Eine Einschränkung dieser Studie ist, dass einige der zur Probe gegeben Zellen bereits aufgrund der Frost / Tau-Lyse haben könnte, die möglicherweise die Nachweisgrenze des Ziel verbessert haben könnte. Eine strengere experimentelle Design wäre gewesen, die Probe haben, haben zu gekünstelt mit frisch gezüchteten Zellen, die genauer Vollblut nachgeahmt hätte. Die FINA Probenvorbereitungsmethode wurde zum Einbau in eine EID POC qPCR - Gerät (in Entwicklung) für den Einsatz in begrenzten Ressource - Einstellungen 8; jedoch kann das manuelle Format hier beschrieben auch eine sinnvolle Ergänzung zu einem Probenvorbereitungsportfolio Labor sein. FINA nicht die Bind verwenden, waschen und Strategie in dri verwendet eluierened Blutflecken und andere papierbasierten Extraktionssysteme, der die extrahierten Nukleinsäuren verdünnt, was möglicherweise zu einer suboptimalen Nachweisempfindlichkeit 5. Die FINA System ist sehr flexibel und kann leicht für andere genetische Tests neben provirale HIV DNA-Nachweis angepasst werden. Geringere Mengen von Blut oder anderen biologischen Proben können für reichlich Ziele und höhere Mengen für weniger reichlich diejenigen verarbeitet werden. In unseren ursprünglichen Ausführungsform der FINA System erfassen wir die Zellen aus Vollblut eine Bluttrennungsmembran und dann durch die Zugabe von 10 mM NaOH 9 lysieren. Diese Version hat den Vorteil einer geringeren Benutzer Schritte, aber die Zellzahl / Blutvolumen, das verarbeitet werden kann, ist kleiner. Zusätzlich zu dem gebundenen Glasmembran in diesem Bericht, andere Bluttrennung oder Blutsammelfilterpapiere verwendet wurden mit diesem Verfahren erfolgreich verwendet haben, und mehrere verschiedene quantitative PCR Instrumente wurden auch in der f eingebettet gezeigt Vorlage zu amplifizierenilter Scheibe 9. Die einzige Bedingung ist, dass der Filter nicht die Fluoreszenz Lesen der Echtzeit-PCR-Instrument blockiert. Eine erhebliche Einschränkung der FINA Extraktion ist, dass es eine Größenbeschränkung auf den Durchmesser der Erfassungsmembran ist. Eine Scheibe mit einer Membran, die größer als 9 mm kann nicht ohne die Membran überlappend in dem Rohr in einem 200 &amp; mgr; l qPCR Röhrchen gegeben werden, die den Oberflächenbereich zu dem Reaktionsgemisch ausgesetzt begrenzt. Zusätzlich wird je größer der Scheibendurchmesser ist, desto qPCR Reaktionsvolumen erforderlich, um den Filter zu bedecken, was die Kosten erhöht und die Turn-Around-Zeit des Assays. Wenn der Filter zu klein ist, um effizient die DNA in der Probe zu erfassen, kann es verstopfen effizientes Waschen zu verhindern. Unter Verwendung der gebundenen Glas Einfangmembran konnten wir nur HIV-1 proviralen DNA und nicht die virale RNA aus Vollblut Proben zu erfassen (Daten nicht gezeigt). Wir wissen nicht, ob alternative Membranen oder Puffer könnte t verwendet werdeno fördern Isolierung von RNA anstelle von oder zusätzlich zu DNA. Wenn der Leser möchte nur DNA aus der Probe zu isolieren Dieses Protokoll erfordert nicht die enzymatische Entfernung von RNA mit einigen Protokollen erforderlich. Erkennen von sowohl HIV-1-RNA und DNA in klinischen Proben würden die Empfindlichkeit von EID und diesen Mangel an RNA-Detektion ist eine Einschränkung unseres diagnostischen Tests zu verbessern. Der wichtigste Schritt in der FINA Prozess zu einem neuen Test Anpassung ist , die Größe des Filters zur Validierung der Menge an DNA aufzunehmen, dh die Anzahl von Zellen in der Probe getestet werden. Im allgemeinen FINA Extraktion funktioniert am besten mit Proben mit einer kleineren Anzahl von Zellen, so dass kleinere Erfassungsplatten verwendet werden können. Um die Bindungskapazität des Filters bestimmen, fügen Sie einfach eine zweite Filterscheibe auf die FINA-Modul unter der Sammelmembran gestapelt. Fügen Sie die Probe und waschen Sie die Membranen wie in den Schritten 4,1-4,5. Platzieren Sie jede der DNA-Fängerplatten in einzelne qPCR Röhren und VerstärkerLiFY. Unter Verwendung einer Standardkurve, bestimmen die Prozent der Input-DNA auf jedem Filter aufgefangen. Die Größe des Filters kann auf die Bedürfnisse des Assays optimiert werden. Für die FINA provirale DNA Assay hier beschrieben, zu mehr als 99% der menschlichen genomischen DNA erfasst wird, wenn Zelllysat zu dem Filter (nicht veröffentlichte Beobachtungen) ermöglicht superior Detektionsfähigkeiten hinzugefügt wird. Neben EID, zukünftige Anwendungen von FINA könnte den Nachweis und die Quantifizierung von proviralen DNA als Biomarker für HIV-1-Überwachung mit Patienten umfassen, die aufgrund einer antiretroviralen Therapie virale Suppression erreicht haben. Behandlung und Überwachung von HIV-Eradikation abzielen könnten Reservoire von HIV-1-infizierten Zellen durch Screening anderen Eingänge neben peripherem Blut durchgeführt werden. Provirale HIV-Test könnte auch verwendet werden, Impfstoff Versuchspersonen für eine echte Infektion zu screenen. Die Blutproben sind stabil während der Lagerung auf FINA-Modulen und kann unter Feldbedingungen für den späteren Versand an ce gesammelt werdenntral Laboratorien für die PCR-Analyse dieses Verfahren ideal für epidemiologische Studien zu machen. Zusätzlich zu HIV-1-Erkennung, diese hochflexible Verfahren könnte auch Präzisions Medizin Ziele verwendet werden in biologischen Proben wie Pharmakogenetik Screening oder andere SNP-Nachweis oder zur schnellen Genotypisierung von Tiermodellen gefunden zu amplifizieren. Isotherme Amplifikationsverfahren wie Helicase abhängigen Amplifikation (HDA) oder loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) könnte auch mit FINA verwendet werden extrahierte Vorlage oder die DNA-embedded auf dem Filter kann als Vorlage für die herkömmliche PCR-Amplifikation verwendet werden.

Mehrere Berichte haben die Entwicklung von papier- oder membranbasierten Extraktionsverfahren für die Verwendung in Point-of-Care (POC) -Geräte 1-5 mit dem Ziel, die exquisite Sensitivität und Spezifität der molekularen Diagnostik zur Verfügung zu allen diskutiert. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) Sexuell übertragbare Krankheiten Diagnostics Initiative prägte den Begriff ASSURED (Bezahlbar, empfindlich, spezifisch, benutzerfreundliche, schnelle und robuste, Ausrüstung frei und Lieferung für diejenigen, die es brauchen) die idealen Eigenschaften eines POC zu beschreiben Test 6. Von diesen Richtlinien ist die Ausrüstung freie charakteristische besondere Herausforderung für die molekulare Diagnostik zu erreichen. Jede Innovation auf dem Gebiet wird jedoch voran das Ziel , die in den meisten Bedürftigen erreicht, und es gibt Hoffnung für kurzfristige Verbesserungen der Testleistung von bestehenden Technologie zur Anpassung 7. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die DNA aus Vollblut zu extrahierendass erfordert keine komplexe Chemie oder Laborinstrumente. Die FINA (Filtration Isolierung von Nukleinsäuren) Probenvorbereitung wurde ursprünglich um DNA aus Vollblut zu extrahieren Leukozyten entwickelt, um die HIV-1-Provirus als Teil einer Probe zu beantwortende Point-of-Care (POC) quantitative PCR zu erkennen (qPCR) frühkind Diagnose (EID) Plattform für den Einsatz in begrenzten Ressource - Einstellungen 8-11. FINA Extraktion unterscheidet sich von herkömmlichen Reinigungsverfahren Silikamembranen oder Silika-beschichteten paramagnetischen Partikeln verwenden , um reversibel DNA in Gegenwart von chaotropen Mitteln 12 binden. Stattdessen verwendet FINA vertikale Filtration über eine Trennmembran direkt zelluläre DNA aus Vollblut zu extrahieren. Die Membran , die die eingeschlossene DNA enthält , kann direkt in einem PCR - Röhrchen gegeben werden und entweder sofort in einer PCR - Reaktion oder Luft für die spätere Amplifikation 9 getrocknet eingesetzt. Keine chaotropen Mitteln, Phenol oder Alkohole werden in der Probenextraktion verwendet, eliminating die umfangreichen Waschschritte benötigt starke qPCR - Inhibitoren aus dem Extraktionsprozess 13,14 abgeleitet zu entfernen. Die FINA Membran kann entweder Zellen 9 oder genomische DNA erfassen durch Zelllyse freigesetzt 11 , bevor die Probe auf die Membran gegeben wird. Für die Zell capture wird Vollblut direkt auf die Membran gegeben. Anschließend werden die Zellen in der Membran lysiert durch Zugabe von 10 mM NaOH. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nur drei Schritten durchgeführt: 1) Probenzugabe; 2) Zelllyse / Wäsche und 3) Filterscheibe Platzierung in qPCR Rohr. Der Nachteil dieser Methode ist, dass die Membran nur eine definierte Anzahl von Zellen direkt proportional zum Durchmesser der Membranscheibe halten kann. Um die Nachweisgrenze zu erreichen für EID benötigt wurden 100 ul Vollblut wird für die Probeneingabe erforderlich, die einen Filter beinhaltet, der zu groß ist, in einem qPCR Rohr platziert werden. Lyse der Blutzellen mit einem Reinigungsmittel, bevor die Probe in die Auflistung hinzufügenMembran fügt einen Verarbeitungsschritt, jedoch ermöglicht die Verwendung eines kleineren Filters für die gleiche Probengröße. Wir konnten eine hohe Reproduzierbarkeit, einzelne Kopie Erkennung und Quantifizierung von weniger als 10 Kopien des HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Blut Konfiguration 11 mit diesem Test zu demonstrieren. In diesem Bericht beschreiben wir die FINA-Protokoll, wie sie ursprünglich für den Laboreinsatz entwickelt. Die Membran / Filter-Sandwich als FINA Probenvorbereitungsmodul bekannt sind, können in großen Chargen und auf Halde für die spätere Verwendung vorbereitet werden. Wenn die Proben in diesem Prozess, 2 dauert min extrahiert werden und kann in unterschiedlicher Größe Chargen durchgeführt werden. Die qPCR können sofort ausgeführt werden oder die Filter die eingebettete DNA enthalten, können gespeichert werden, bis es bequem ist, qPCR auszuführen. Diese Methode ist sehr bequem für die Routineanalyse von Proben in niedrigen und hohen Ressourceneinstellungen.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 blotting pad</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&amp;nbsp;</td><td>3M Medical Specialties</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l qPCR strip tubes</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>optical strip caps</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p qPCR System</td><td>Agilent</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>A.C.S. Reagent</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>for molecular biology</td></tr><tr><td>fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 3/16&quot; hole diameter (5.1 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 1/4&quot; hole diameter (7.14 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 5/16&quot; hole diameter (8.35 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, Filtration Isolierung von Nukleinsäuren, ist ein neuartiges Extraktionsverfahren, das über eine Trennmembran und absorbierendes Kissen zum Extrahieren der zellulären DNA aus Vollblut in weniger als 2 min vertikale Filtration verwendet. Die Blutprobe wird mit einem Detergens, behandelt kurz gemischt und mit einer Pipette auf die Trennmembran aufgebracht. Das Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Trennmembran zu erfassen. Die extrahierte DNA wird auf die Membran während einer einfachen Waschschritt zurückgehalten, wobei PCR-Inhibitoren Schlechten in das absorbierende Löschblatt sind. Die Membran, die die eingeschlossene DNA enthält, wird dann ohne weitere Reinigung der PCR-Reaktion zugesetzt. Diese einfache Methode nicht Laborausrüstung erfordern und kann leicht mit preiswerten Labormaterialien realisiert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum hochempfindlichen Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Vollblut als ein Modell für frühfant Diagnose von HIV, die ohne weiteres auf andere genetische Ziele angepasst werden könnte.

Der Workflow für provirale DNA aus Vollblut extrahieren gespickt mit 8E5-LAV - Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt die FINA Probenmodul und vorbereitet qPCR Rohr. Dieses Verfahren ermöglicht eine effiziente Amplifikation von HIV-1 - Provirus von 8E5-LAV - Zellen bei unterschiedlicher Kopienzahl, wie in der Standardkurve von künstlich Proben (Figur 3) dargestellt. PCR hatte einen Wirkungsgrad von 103%, wie aus Efficiency berechnet = -1 + 10 (-1 / Steigung). Die Gleichung der Linie war y = -3.25x + 27.95, mit einer Korrelation von R² = 0,996. Die provirale HIV DNA - Standardkurve repliziert auch in hohem Maße reproduzierbar Verstärkung haben, wie in Tabelle 1 zeigt. Darüber hinaus eine interne Kontrolle von 500 Exemplaren Hydroxypyruvat Reductase vorhanden ist , zu zeigen , dass es keine PCR - Hemmung ist aus extra Blut mit FINA, unabhängig von der Anzahl von Kopien von HIV-1-Provirus vorhanden ist (Abbildung 4). IC-Amplifikation wurde in allen 18 Proben getestet, mit einer durchschnittlichen Cq von 21,92 ± 0,25 und einem CV von 1% effizient erhalten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow für provirale DNA aus Vollblut Nachweis gespickt mit 8E5-LAV - Zellen zu qPCR. (A) von links nach rechts, die vorbereitete FINA - Modul nach dem Blut in die Capture - Membran hinzugefügt wird und nach dem Waschpuffer hinzugefügt wurde. (B) qPCR Rohre mit Fängerplatten stecken doppelt beschichtete Band mit qPCR Master Mix hinzugefügt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54289/54289fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54289/54289fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig2.jpg" /> Abbildung 2: FINA in-house - Modul und qPCR Rohrvorbereitung. </strong&gt; (A) Ein 8,35-mm - Durchmesser - Scheibe - Capture - Membran zwischen einem Quadrat 707 Blotting - Pad und eine dünne Schicht aus Paraffin Band eingelegt wurde , wurde ein 7,14-mm-Durchmesser - Loch in der Mitte enthält , so dass das Loch des Paraffins Band zentriert auf der Fangplatte für die direkte Anwendung von lysierten Blut durch pipettieren. (B) A 5,1 mm doppelt beschichtete Polyester - Diagnoseband an der Seite von 200 ul qPCR Rohr stecken. Der zweite Liner von Band wird entfernt für die Anwendung Capture - Platte , wenn bereit klebrige Oberfläche zu belichten. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54289/54289fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54289/54289fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig3.jpg" /> Fig . 3: Standardkurve von HIV-1 proviralen DNA ersonnen Proben (A) Amplification Plots erhalten aus 100 ul 4 repliziert HIV-1 negative Vollblut versetzt mit 4000, 400, 40 und 10 8E5-LAV-Zellen mit 500 Kopien / Reaktion der internen Kontrolldurchgezogene Linien = Verstärkung Plots; Die gestrichelte Linie = Schwelle. Y-Achse ist die Fluoreszenzeinheiten und X-Achse ist qPCR Zykluszahl. (B) Standardkurven von Cq Werte von Amplifikationsplot berechnet gegenüber dem Log - Kopienzahl von 8E5-LAV - Zellen pro 100 &amp; mgr; l Vollblut. Die Gleichung der Linie: y = -3.25x + 27.95; R² = 0,996; PCR - Effizienz = 103,23% über Effizienz berechnet = -1 + 10 (-1 / Steigung) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54289/54289fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54289/54289fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig4.jpg" /> Abbildung 4: Interne Kontrolle gibt keine qPCR Hemmung 500 Kopien Hydroxypyruvat Reductase Amplification Kontroll - Plasmid pro Reaktion zugegeben.. SolideLinien = Verstärkung Plots; Die gestrichelte Linie = Schwelle. Durchschnittliche Cq von IC = 21,92 ± 0,25. Cqs reichte von 21,21 bis 22,32. Variationskoeffizient (CV%) = 1%; N = 18 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54289/54289fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54289/54289fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 8E5-Zellen LAV / </td></tr><tr><td> 100 &amp; mgr; l WB </td><td> Ave. cq </td><td> SD </td><td> LEBENSLAUF (%) </td></tr><tr><td> 4000 </td><td> 16.27 </td><td> 0,14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 19.54 </td><td> 0,15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 22.56 </td><td> 0,3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 24.83 </td><td> 0,15 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>Tabelle 1: Durchschnittliche Cq, Standardabweichung (SD) und Variationskoeffizient (CV%) von 4.000, 400, 40 und 10 Kopien von 8E5-LAV - Standardkurve mit FINA - Extraktion und HIV-1 - spezifische Primer und Sonden. N = 4. WB = Vollblut.

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Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Aufrufe.  Northwestern University.  Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden. 

Serie: Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

Bewertung der Auswirkungen von Hydraulic Fracturing auf Bäche mit mikrobiellen molekularen Signaturen

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Forschung

Umwelt

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Biologie

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both with and without preexisting conditions. Rapid processing of these samples is essential to avoid degradation of key cellular components. Included here are methods for simultaneous peripheral blood mononuclear cell (PBMC), DNA, RNA and serum isolation from a single blood draw performed in the homes of consenting participants across a metropolitan area, with processing initiated within 2 hr of collection. We have used these techniques to process over 1,600 blood specimens yielding consistent, high quality material, which has subsequently been used in successful DNA methylation, genotyping, gene expression and flow cytometry analyses. Some of the methods employed are standard; however, when combined in the described manner, they enable efficient processing of samples from participants of population- and/or community-based studies who would not normally be evaluated in a clinical setting. Therefore, this protocol has the potential to obtain samples (and subsequently data) that are more representative of the general population.

We outline a methodology for the processing of whole blood to obtain a variety of components for further analysis. We have optimized a streamlined protocol that enables rapid, high-throughput simultaneous processing of whole blood samples in a non-clinical setting.

Schnelle Fraktionierung und Isolierung von Vollblutkomponenten in Proben aus einer Gemeinschaft basierende Einstellung Erhalten

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Medizin

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Immunologie und Infektion

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Effiziente Technik zur Bewertung von antimikrobiellen Resistenzen in der Umwelt durch Anreicherung von DNA mit niedrigem MW

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has emerged as the source of choice to sample pathogen burdens in the environment. Wastewater from open drains and community water treatment plants is a reservoir of both pathogens and antimicrobial resistance (AMR) genes, and frequently comes in contact with humans. While there are many methods of tracking AMR from water,&#160;isolating good-quality DNA at high yields from heterogeneous samples remains a challenge. To compensate, sample volumes often need to be high, creating practical constraints. Additionally, environmental DNA is frequently fragmented, and the sources of AMR (plasmids, phages, linear DNA) consist of low-molecular-weight DNA. Yet, few extraction processes have focused on methods for high-yield extraction of linear and low-molecular-weight DNA. Here, a simple method for high-yield linear DNA extraction from small volumes of wastewater using the precipitation properties of polyethylene glycol (PEG) is reported. This study makes a case for increasing overall DNA yields from water samples collected for metagenomic analyses by enriching the proportion of linear DNA. In addition, enhancing low-molecular-weight DNA overcomes the current problem of under-sampling environmental AMR due to a focus on high-molecular-weight and intracellular DNA. This method is expected to be particularly useful when extracellular DNA exists but at low concentrations, such as with effluents from treatment plants. It should also enhance the environmental sampling of AMR gene fragments that spread through horizontal gene transfer.

Autor im Rampenlicht: Verständnis und Nachweis von antimikrobiellen Resistenzen in der Umwelt durch Kombination kulturbasierter Techniken und Genomik

Here, we present a simple technique to assess environmental antimicrobial resistance (AMR) by enhancing the proportion of low-molecular-weight extracellular DNA. Prior treatment with 20%-30% PEG and 1.2 M NaCl allows detection of both genomic and horizontally transferred AMR genes. The protocol lends itself to a kit-free process with additional optimization.

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen 

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has ...

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

Zusammenfassung

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Bewertung der Auswirkungen von Hydraulic Fracturing auf Bäche mit mikrobiellen molekularen Signaturen

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

Schnelle Fraktionierung und Isolierung von Vollblutkomponenten in Proben aus einer Gemeinschaft basierende Einstellung Erhalten

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen