We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. In Vitro Transcription <ol><li> Linearisieren pCS2-H2A.F / Z-EGFP und / oder pCS2-mCherry-CAAX Vektoren durch NotI - Restriktionsenzym 31 verdauen. Unter Verwendung einer RNA in vitro - Transkription - Kit, erzeugen 5 &#39;mRNA mit Cap - Produkte aus jeder Vorlage, nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Reinige die verkappte mRNA eine Reinigung Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Eluieren mit RNase-freiem H 2 O. </li><li> Bestimmung der RNA-Konzentration durch Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. (OD 260 x Verdünnung x 40 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Verdünnen Sie die RNA zu 100 ng / &amp; mgr; l für jede H2A.F / Z-EGFP und mCherry-CAAX mit RNase-freiem H 2 O. Wenn die RNA-Konzentration zu niedrig ist, wird die Fluoreszenz vermindert oder abwesend sein. Hellere Proben werden die Bedenken hinsichtlich einer Phototoxizität und Photobleaching verringern. Auf der anderen Seite kann zu viel RNA toxisch und / oder verursachen Tor Wirkungen. Hinweis: Bewahren Sie die restlichengereinigte mRNA in -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 2. Zebrabärbling Zucht, Besamungs und mRNA Injection 36-38 <ol><li> Montieren Zuchtbecken mit einer Barriere, den Tank in zwei Bereiche zu trennen und jede Zuchtbecken mit Fischzuchtanlage Wasser zu füllen in der Zebrabärbling-Anlage eingesetzt. </li><li> Um vorzeitige Zucht zu verhindern, legen Sie zwei männliche Fische auf einer Seite der Barriere und zwei weiblichen Fische auf der anderen Seite in der Nacht vor der Zucht. </li><li> Am nächsten Tag, tauen die vorher hergestellten mRNA Mischung auf Eis. Ersetzen Sie das Wasser in Zuchtbecken mit frischem Wasser Aquakultur System und die Hindernisse zu beseitigen. Unmittelbar nachdem die Schranken gezogen werden, erwärmen eine Spritzgießform auf 28,5 ° C und die Ausrüstung für die Mikroinjektion eingerichtet. Hinweis: Weitere Informationen zu Spritzgießwerkzeugen entnehmen Sie bitte Gerlach 36. </li><li> Sammeln Sie alle Eier 10 bis 15 min ein Teesieb mit und spülen Sie die Eier in einen sauberen 100 x 15 mm Petrischale mit E3 Blau (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% Methylenblau). E3 Blau wird verwendet, Pilzwachstum zu verhindern und die richtige Entwicklung von Fischlarven zu gewährleisten. Weitere Informationen über die Paarung und Embryo - Entnahme siehe Gerlach 36 und Porazinkski 37. </li><li> Einbettungs one-Zelle statt Embryonen in einer Spritzgußform erwärmt und die RNA in den Dotter in der gewünschten Menge von Embryos (1A) einzuspritzen. Konto für natürliche Absterben von Embryonen und befruchteten Embryonen, die durch embryonale Injektionen auf 15% mehr Embryonen durchführen als für das Experiment benötigt. Weitere Einzelheiten über die Mikroinjektion von Zebrafischembryonen, finden Sie in Gerlach 36 und Porazinkski 37. HINWEIS: Bei der ersten Verwendung von mRNA, führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve Analyse die optimale Dosis für die Fluoreszenz und die Lebensfähigkeit (definiert als keine grobe Entwicklungsstörungen bis zu 5 dpf) vor der Durchführung der 5D-Bildgebung zu bestimmen. 150-200 ng / ulInjektion in Embryonen ist oft die optimale Konzentration, daher ist es ein guter Startpunkt für die Endkonzentration ist. </li><li> unter Verwendung eines modifizierten 9 &quot;Glas Pasteur Pipette vorsichtig die injizierten Embryonen aus der Form zu extrahieren. Die Pipette zu ändern, schmelzen das Ende einen Bunsenbrenner, bis er eine Kugel bildet. </li><li> Legen Sie injizierten Embryonen in einer 100 x 15 mm Petrischale in der E3-Blau und Haus in einem 28,5 ° C Inkubator. </li><li> Sechs Stunden nach der Injektion, entfernen Sie alle tot oder unbefruchtete Embryonen aus den Platten und fügen Sie auch saubere E3 Blau. Haus die Embryonen bei 28,5 ° C. </li></ol> 3. Herstellung und Einbettung von Live-Zebrafischembryonen für Imaging (Abbildung 1B) <ol><li> Zwei Stunden vor der Bildgebung, Bildschirm die injizierten Embryonen für die GFP ein fluoreszierendes Binokular mit. Legen Sie hellgrünes GFP-exprimierenden Embryonen in einem neuen 100 x 15 mm Petrischale mit E3-Blau. </li><li> Kochen Sie eine Stammlösung von 1% niedriger Schmelz Agarose durch Zugabe von 1 g niedrigschmelzende Agarose zu 100 ml E3 Blau. Nach der Verwendung des Agarose, decken den Kolben, der mit Aluminiumfolie. Die Stammlösung bleibt für bis zu einem Monat nützlich. </li><li> Aliquot 3 ml der geschmolzenen Agar in einer 17 x 100 mm Kulturröhrchen. in einem 42 ° C Wasserbad bis zur Verwendung Halten Sie die Agarose warm, indem die Kulturröhrchen platzieren. Bereiten Sie eine 15 mM Tricaine Lösung in VE - Wasser , um die Genaktivität zu betäuben 36. HINWEIS: Wenn Bildgebung zu früheren Zeitpunkten gewünscht wird, kann die Konzentration von Agar als niedrig 39 als 0,3% verringert werden. </li><li> Bringen Sie die 15 mM Tricaine, abgeschirmt Embryonen, niedrige Schmelz Agarose, E3 Blau, und ein 35 mm Deckglas Boden Kulturschale zu einer Dissektion Lichtmikroskop. Sorgfältig das Chorion mit # 5 Pinzette des Embryos zu entfernen. Tun Sie dies für drei Embryonen. </li><li> Legen Sie die dechorionated Embryonen in einem separaten Behälter betäubt werden. Der Deckel des Deckglases Bodenschale wird oft für diesen Zweck verwendet. Mit Hilfe einer Transferpipette, fügen Sie drei Tropfen (ungefähr 150 ul)von 15 mM Tricaine in die Schale von 5 ml E3 blau (wenn Sie den Deckel des Deckbodenschale verwenden) oder bis Embryonen ausreichend betäubt wurden. Darüber hinaus fügen Sie 3-4 Tropfen (ca. 150 bis 200 &amp; mgr; l) von 15 mM Tricaine Lösung für das 1% geschmolzener Agarose Rohr. </li><li> Mit einer p200 Pipette mit 1 cm der Pipettenspitze abgeschnitten; übertragen Sie die narkotisierten Embryonen auf dem Deckglas Boden Gericht. Entfernen Sie überschüssiges E3 Blau: Tricaine Lösung. </li><li> Langsam von 5 bis 10 &amp; mgr; l von niedrigschmelzende Agarose: Tricaine Lösung über die Embryonen, jeden Tropfen zu halten trennen die Embryonen versehentlich geschlossen haben, um sicherzustellen, nicht driften zueinander. Achtung: Wenn die Agarose zu warm ist, wird es den Embryo schädigen. Eine gute Temperatur des Agar zu halten, bei 42 ° C. </li><li> Unter Verwendung einer 21 G 1 ½ Nadel auszurichten sanft den Embryo in der Agarose auf die gewünschte Position. Wenn ein inverses Mikroskop für Zeitraffer-Bildgebung unter Verwendung richten Sie die Region of Interest (ROI) so nah an dem Deckglas als possible. Anmerkung: Für allgemeine Zwecke, der Schwanzbereich bietet eine einfache Ausrichtung und Klarheit aufgrund der relativ dünnen Gewebe (1A). Andere Gewebe, wie beispielsweise die Epithelschicht umgeben Eigelb und fin Falten können 28,29 verwendet werden. Diese Gewebe bieten große Klarheit, aber diese Regionen sind nur wenige Zellschichten dick. Für den Zweck dieses Protokolls ist es dem Bild vorteilhaft Schwanzbereich, um so viele Zellteilungen wie möglich erfassen. </li><li> Lassen Sie ein paar Minuten zur teilweisen Verfestigung des Agar. Verwenden Sie die Nadel ein kleines Stück Agar auseinander zu brechen, um seine Verfestigung zu testen. Wann kann ein Stück Agar weg aus dem Drop gezogen werden, gehen Sie zum nächsten Schritt. </li><li> Decken Sie die gesamte Deck mit niedriger Schmelz Agar eine Kuppel über den eingebetteten Embryonen zu bilden. Lassen Sie das Agar , bevor die Schale für die konfokale Abbildung (Abbildung 1A) zu festigen. </li><li> Während der Agar Erstarrungsprozesses (ca. 10 min dauert), bereiten Sie 3 ml of E3 Blaue Lösung mit fünf Tropfen (etwa 250 &amp; mgr; l) 15 mM Tricaine auf über den eingebetteten Embryonen während der Bildgebung platziert werden. </li></ol> 4. 5D konfokale Bildgebung von Live Zebrafischembryonen 40,41 HINWEIS: Siehe Ariga 40 und O&#39;Brien 41 für Details, wie 5D Bildgebung mit anderen konfokale Systeme durchzuführen. Für Z-Intervall, Z-Stack, Z-Tiefe, Zeitintervall und 5D Definitionen siehe Abbildung 1C. <ol><li> Öffnen Sie die Imaging-Software und stellen Sie das Mikroskop 60x NA 1,4 Objektivlinse. Bewerben Sionsöl auf die Objektivlinse und legen Sie die Kulturschale in den Diahalter auf dem Mikroskoptisch. Mit Hilfe der Achsensteuerung, zentriert um den Embryo von Interesse über der Objektivlinse und bringen nach oben in die Objektivlinse die Kulturschale zu erfüllen. </li><li> Klicken Sie auf das Okular-Symbol und wechseln Sie in das GFP-Filter auf dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf den ROI. Die Konzentration auf das Gewebe am nächsten an der Deck wird offer die besten Bildergebnisse. </li><li> Entfernen Sie die Verriegelung. Wählen Sie die GFP und mCherry Kanäle (voreingestellten Wellenlängen in Software) und stellen Sie die Zeile mit durchschnittlich Option normal. </li><li> Verwenden Sie &quot;Ansicht / Erfassungs-Bedienelemente / A1 Scanbereich&quot; Befehl auf der A1 Scanbereich Werkzeug zu öffnen. </li><li> Beginnen Sie das Scanning. Unter Verwendung des Achs-Controller, positionieren Sie den Embryo, so dass der Scan-Bereich mit so viel von der Zebrabärbling wie möglich gefüllt ist. Die Laserleistung muss nicht zu diesem Zeitpunkt optimal. Senken Sie die Laserleistung, um unnötige Photobleichens vermeiden. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Ansicht / Acquisition Kontrollen / ND Erwerb&quot; Befehl, um die ND Erwerb Systemsteuerung zu öffnen. </li><li> Beginnen Sie das Scannen der Z-Stack-Parameter einzustellen. Stellen Sie den Z-Stack obere Grenze, wo die Zellen sind nicht im Fokus und untere Grenze, wo Zellen sind nicht mehr sichtbar. Ermöglichen eine 3 um Raum oberhalb der Probe für das Wachstum und die Zellbewegung, die in das Bildfeld erweitern kann. Der Z-Stack für die Figuren in diesem Pro gezeigtkoll bedeckt eine Z-Tiefe von 40 &amp; mgr; m im Embryo Schwanz. </li><li> Stellen Sie den Z-Intervall bis 2 um Schrittweite. Im Durchschnitt eine Zelle ist 10 &amp; mgr; m im Durchmesser; daher 2 &amp; mgr; m werden fünf Intervallen von Abbildungsdaten zu erzeugen für jede Zelle analysiert werden. HINWEIS: Die Tiefe des Bildes, das abhängig von der Z-Intervall erfasst werden können. Z Auflösung wird geopfert Bild so viele Zellen, um die Gesamttiefe in der Z-Dimension zu gewinnen Mitose wie möglich (große Z-Tiefe) unterzogen. Die inverse wahr ist, daß durch die Schrittgröße abnimmt, wird Z Auflösung gewonnen, während Z-Tiefe (kleine Z-Tiefe) geopfert wird. </li><li> Stellen Sie das Bild Laserleistung, HV, und Ebenen ausgeglichen. Für die Experimente in diesem Protokoll demonstriert, verwenden Sie die folgende Laserleistung, HV, und Pegel an den entsprechenden Ebenen versetzt sind, jeweils für die GFP-Kanal; 2 bis 5, 120-140, und -9 bis -11. Für den mCherry Kanal, verwenden Sie die folgende Laserleistung, HV, und Offset-Pegel sind; 3 bis 6, 120-140, und -3 bis-8. Nachdem die Parameter eingestellt sind, schalten Sie die Scan unnötig Laserbelichtung zu verhindern, die Phototoxizität und Photobleaching der Probe führen kann. </li><li> Wählen Sie die Mittelungs Symbol 2x Linie. &quot;Nein Lungs&quot; erzeugt ein körniges Bild, während &quot;4x Linie durchschnittlich&quot; drastisch erhöht die Scan-Zeit. Die Verwendung von 2x Linie Lungs bietet die beste Bildqualität und schnellste Scan-Zeit. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Zeitintervall und Zeitdauer, die für das Experiment. Für Wildtyp - Divisionen, zwei-Minuten - Zeitintervalle für 2 Stunden ist am besten für mitotische Dauer Bestimmung (verwendet in den 1, 2, 3A und 3B). Räume, die die Spindelanordnung Kontrollpunkt für länger als 30 Minuten sind besser geeignet für alle fünf Minuten für vier Stunden aktivieren , um Fluoreszenz zu erhalten , wie in 3C gezeigt. </li><li> Überprüfen Sie die &quot;Datei speichern&quot; ein und benennen Sie die Datei automatisch die Datei zu speichern, wie es erworben wird. Überprüfen Sie alle pametern richtig und drücken Sie &quot;Start Run&quot; gesetzt. </li><li> Nach dem Erwerb abgeschlossen ist, wird die Datei in einem dreidimensionalen Format, klicken Sie auf die Lautstärkeschwelle Symbol anzuzeigen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht eine Kernhülle Abbau, Bildung einer Metaphase Platte durch Mikrotubuli-kinetochore Anhänge und Segregation von Schwesterchromatiden zu schließen zwei neue Zellen in vivo zu bilden , und in einer zeitabhängigen Weise. Die Fähigkeit, die Mitose in Zebrabärbling zu beobachten ist vorteilhaft gegenüber fixierten Proben und Zellkultur-Systeme, da die Zellen in die natürliche Physiologie abgebildet wird, das Gewebe transparent ist, die für fluoreszierende Proteine...

Mitose ist ein wichtiger zellulärer Prozess essentiell für das Wachstum, Differenzierung und Regeneration in einem lebenden Organismus. Von der genauen Zubereitung und Replikation von DNA in der Interphase, wird die Zelle zu unterteilen grundiert. Die erste Phase der Mitose Prophase, wird durch die Aktivierung von Cyclin B / Cdk1 eingeleitet. Prophase wird durch Kondensation von Chromatin Material in Chromosomen charakterisiert. Kernhülle Schlag erfolgt am Übergang zwischen der Prophase und Prometaphase. In Prometaphase, Zentrosomen, die Keimzentrum für Spindelbildung, beginnen zu entgegengesetzten Polen während Verlängerung Mikrotubuli auf der Suche nach kinetochore Anlage zu migrieren. Nach Befestigung, bis Ende auf Conversions Mikrotubuli Befestigung und Spannungskräfte orientieren die Chromosomen eine Metaphaseplatte 1 bildet. Wenn alle Chromosomen korrekt, wird die Spindelanordnung Kontrollpunkt zufrieden, cohesin Ringe halten die Schwesterchromatiden zusammen gespalten gebunden sind, und Mikrotubuli verkürzen Schwester zu ziehenChromatiden zu entgegengesetzten Polen während der Anaphase 2,3. Die letzte Phase, Telophase beinhaltet Dehnung der Zelle und Rückbildung der Kernhülle um die beiden neuen Kernen. Zytokinese vervollständigt den Teilungsprozess durch das Zytoplasma der beiden neuen Tochterzellen 4-6 trennt. Änderung der Schlüssel mitotischen Wege (dh Spindelanordnung Kontrollpunkt, Zentrosom Vervielfältigung, Schwester-Kohäsion, usw.) Kann in der Metaphase Verhaftung missegregation von Chromosomen führen, und genomische Instabilität 7-10. Letztlich können Defekte in Wege steuern Mitose verursachen Entwicklungsstörungen und Krebs, erfordert die Visualisierung von Mitose und ihre Mängel in einem Live, Wirbel mehrzelligen Organismus 16.10. Zebrabärbling-Embryonen dienen als große Modellorganismus für die Live-Darstellung aufgrund des transparenten Gewebe, einfache Mikroinjektion und schnelle Entwicklung. Mit Zebrabärbling, ist das übergeordnete Ziel dieses Manuskriptein Verfahren der lebenden 5D (Abmessung X, Y, Z, Zeit und Wellenlänge) Abbilden von Mitose 17 (1C) beschreiben. Die Verwendung von Mutanten Zebrabärbling defekt in verschiedenen mitotischen Bahnen zeigen die Folge solcher Defekte. Für dieses Protokoll, Aurora B und ESCO2 Mutanten wurden diese Mängel zu illustrieren gewählt. Aurora B ist eine Kinase, die ein Teil des Chromosoms Fahrgast Komplex (CPC), die zur Spindelbildung und Mikrotubuli Befestigungs ist. Es ist auch für Spaltungsfurche Bildung in Zytokinese 18,19 erforderlich. In Zebrabärbling führt Aurora - B - Mangel zu Defekten in Furche Induktion, Zytokinese und Chromosomensegregation 20. ESCO2, andererseits ist eine Acetyltransferase, die Schwester - Chromatid - Kohäsions 21,22 wesentlich ist. Es acetyliert cohesin auf dem SMC3 Abschnitt des Rings so cohesin 23 korrekte Chromosomensegregation in der Metaphase-Anaphase Übergang zu gewährleisten stabilisieren. Der Verlust der ESCO2 in Zebrabärbling führt zu chromosome missegregation, vorzeitige Trennung der Schwesterchromatiden, genomische Instabilität und p53-abhängige und unabhängige Apoptose 24,25. Aufgrund der Verfügbarkeit, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 mutant Zebrabärbling (nachfolgend als Aurb m / m und ESCO2 m / m, jeweils) werden verwendet , um 25-27 um diese Technik zu veranschaulichen. Die Kopplung der konfokalen Mikroskopie mit Fluoreszenz-markierten Zellmaschinerie hat Forscher aktiviert Chromatin und Zellmembran Dynamik während der Mitose 25,28,29 visualisieren. Fluorescent-markierte Histone haben in der Vergangenheit verwendet wurden Chromatin sichtbar zu machen. Histone sind Kernproteine ​​bestehen aus vier verschiedenen Paaren (H2A, H2B, H3 und H4), die für die Nukleosomenstruktur verantwortlich sind, die 30 Chromosomen komponiert. Während H2B ist wohl das am häufigsten verwendete Histon für fluoreszierende ProteineMaus und Zellkultur, die Verwendung von Histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) ist für den Einsatz in Zebrabärbling 31,32 gut bewährt. Concanavalin A und Casein - Kinase - 1-gamma beispielsweise lokalisiert auf der Zellmembran und haben in Visualisierung der Zellmembran in Seeigeln und drosophila 33,34 vorher wirksam erwiesen. Andere Studien haben gezeigt , dass die CAAX fluoreszierend-markierte Protein bezeichnet die Zellmembran und war erfolgreich in Zebrabärbling 31. CAAX ist ein Motiv, das durch post-translationale Modifikationsenzyme wie Farnesyltransferasen und geranylgeranyltransferases erkannt wird. Änderungen durch diese Enzyme verursachen Proteine ​​membranassoziiertes zu werden, wodurch die Zellmembran Markierung 35. Aufgrund der Vorbenutzung in Zebrabärbling, wählte dieses Protokoll H2A.F / Z und CAAX zu etikettieren Chromatin und die Zellmembran zu verwenden. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht es dem Forscher Mitose auf Einzelzellebene zu überwachen einzelnen Chromosom zu beobachtenDynamik, sowie gleichzeitig mehrere Zellteilungen zu überwachen, die Gewebedifferenzierung und Entwicklung auswirken können. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Abbildung der Dynamik von Chromosomensegregation während der Mitose auf Einzelzellebene. Innerhalb dieses Manuskript, die Fähigkeit, mehrere mitotische Teilungen zu beobachten, Teilungszeit berechnen und die mitotische Phänotypen entziffern wird dargestellt und diskutiert werden. Durch die Verwendung dieser Parameter kann, physiologisch relevanten Daten durch mitotische Mängel betroffen mehrere Krankheitszustände gesammelt und angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vectors</td><td>Gift from K. Kwan</td><td></td><td>For plasmid of interest</td></tr><tr><td>NotI-HF restriction enzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>For restriction digest of plasmid</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For purifying mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For housing embryos</td></tr><tr><td>microinjection mold</td><td>homemade</td><td></td><td>For holding embryos during microinjection</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>For embedding embryos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>For anesthetizing embryos</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>100 mm culture tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>For melted agar</td></tr><tr><td>35 mm glass coverslip bottom culture dish&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&amp;nbsp;</td><td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td></tr><tr><td>#5 tweezers</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>For positioning embryos in agar</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>For time-lapse imaging</td></tr><tr><td>Confocal software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>For image acquisition and processing</td></tr></tbody></table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

Mitose ist entscheidend für organismal Wachstum und Differenzierung. Der Prozess ist sehr dynamisch und erfordert Ereignisse bestellt richtige Chromatin-Kondensation, Mikrotubuli-kinetochore Befestigung, Chromosomensegregation und Zytokinese in einem kleinen Zeitrahmen zu erreichen. Fehler in der heiklen Prozess kann in der menschlichen Krankheit, einschließlich Geburtsschäden und Krebs führen. Traditionelle Ansätze menschlicher Zustände mitotischen Krankheit untersuchen verlassen sich oft auf Zellkultursysteme, die die natürliche Physiologie und Entwicklungs / gewebespezifischen Kontext vorteilhaft fehlt, wenn die menschliche Krankheit zu studieren. Dieses Protokoll überwindet viele Hindernisse, die durch einen Weg, um sichtbar zu machen, mit hoher Auflösung, Chromosomendynamik in einem Wirbeltier-System, das Zebrafisch. Dieses Protokoll wird ausführlich ein Ansatz, der verwendet werden kann , dynamische Bilder von sich teilenden Zellen zu erhalten, die Folgendes umfassen: In - vitro - Transkription, Zebrabärbling Zucht / Sammeln, Embryo Einbettung und Zeitraffer-Bildgebung. Optimierung und modifikationen dieses Protokolls werden ebenfalls untersucht. Mit H2A.F / Z-EGFP (Etiketten Chromatin) und mCherry-CAAX (Etiketten Zellmembran) mRNA-injizierten Embryonen, die Mitose in AB - Wildtyp, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 Mutante Zebrabärbling visualisiert. Hochauflösende Live-Bildgebung in Zebrabärbling ermöglicht eine mehrere Mitosen zu beobachten, statistisch zu mitotischen Defekten und den Zeitpunkt der mitotischen Progression zu quantifizieren. Darüber hinaus Beobachtung der qualitativen Aspekte , die unsachgemäß mitotische Prozesse definieren (dh congression Defekte, missegregation der Chromosomen, etc.) und falsche Chromosomen Ergebnisse (dh Aneuploidie, Polyploidie, Mikronuklei, etc.) beachtet werden . Dieser Assay kann zur Beobachtung der Gewebedifferenzierung / Entwicklung angewendet werden und ist zugänglich für die Verwendung von mutierten Zebrafisch und pharmakologischen Mitteln. Visualisierung, wie Mängel in der Mitose zu Krebs und Entwicklungsstörungen führen wird starkVerständnis der Pathogenese der Krankheit zu verbessern.

Abbildung 2 zeigt die Fähigkeit , viele Zellteilungen mit einem weiten Feld Ansicht eines AB Wildtyp Zebrabärbling Schwanz zu beobachten. Über sieben mitotischen Zellen werden in einem 14 min Zeitrahmen (Film 1) abgebildet. Innerhalb der zwei Stunden Zeitverlauf über 40 mitotische Ereignisse wurden gefangen genommen. Im Durchschnitt 50 teilende Zellen wurden in der AB und 30 teilende Zellen in aur B m / m Embryonen <stron...

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Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

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Forschung

Entwicklungsbiologie

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genetik

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologie

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neurowissenschaften

<meta charset="utf8"></head><body>Verfeinertes Multiview-Lichtblattmikroskopie-Protokoll für Zebrafischembryonen

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Strategien für die Montage von Zebrafischembryonen für die hochauflösende Multiview-Lichtblattmikroskopie — Techniken zur Bildgebung und Bild

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen