We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

Hinweis: Das folgende Protokoll wird für die Synthese eines Proteins-Farbstoff - Biokonjugat ausgelegt wie in Figur 1 gezeigt , ist es ein allgemeines Protokoll für die Reaktion einer Maleimid mit freien Oberfläche Cystein enthaltenden Proteinen, mit Anmerkungen eingefügt gegebenenfalls mit Membranprotein zu unterstützen. Biokonjugate, Protein-Polymer-Biokonjugate und synthetische Protein-Dimer (Protein-Protein) Biokonjugate. In diesem speziellen Fall das Protein iso-1 - Cytochrom c hat eine Oberfläche Cysteinrest Verfügung zu reagieren , die auftreten , eine hochspezifische Kennzeichnung ermöglicht. Wenn ein Protein von Interesse mehrere Cysteinreste hat, gilt das gleiche Protokoll, wenn auch mit dem Verlust der Spezifität und Produkthomogenität. Chemie Targeting Oberfläche Lysinresten unter Verwendung von N -hydroxysuccinimidyl Ester oder Isothiocyanate kann ein einfacherer Ansatz, wenn Spezifität nicht erforderlich ist. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 1. Reaktionsschema Biokonjugation. Als Beispiel Fall einer Lichtsammlung, auf Rutheniumbasis Antennen Molekül wird über die Michael - Addition von einem Anhänger Maleimid auf der Basis von Ruthenium Antennen Molekül und einem freiliegenden Cystein - Rest (CYS102) an Cytochrom c befestigt werden auf dem Protein. Der rote Bereich des cyt c Oberfläche zeigt die Häm - Gruppe. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 1. Reinigung von Cytochrom c Hinweis: Dieser Schritt für alle Proteine, die nicht anwendbar ist. Jedoch ist es wichtig , dass ein Protein von einem kommerziellen Lieferanten erhalten wissen kann andere unerwünschte Protein - Isoformen enthalten , die durch weitere Reinigung 13 entfernt werden müssen. <ol><li> Man löst 2,4 g Natriumdihydrogenphosphat (M w = 120 g mol -1) in 1 l Reinstwasser prepare eine Pufferlösung 20 mM NaH 2 PO 4 enthält. Den pH-Wert mit 1 M NaOH auf pH 7 gestellt. Anmerkung: Die Phosphatpuffer in diesem Protokoll verwendet werden, sollten frisch auf einer täglichen Basis hergestellt werden, und filtriert durch ein 0,2 um Cellulose-Membranfilter vor der Verwendung. </li><li> Man löst 29,22 g Natriumchlorid (M w = 58.44 g mol -1) in 500 ml des 20 mM NaH 2 PO 4 Puffer 20 mM NaH 2 PO 4 und 1 M NaCl - Puffer zu machen. Dies ist der Elutionspuffer für die Reinigung in Schritt 1.6). </li><li> Man löst 12,0 mg lyophilisiertes Cytochrom C (cyt c) in 6 ml pH 7 20 mM Phosphatpuffer. </li><li> Auflösen Getrennt 14,7 mg Dithiothreitol (DTT, M w = 154,25 g / mol) in 95,3 ul Reinstwasser zu einer 1 M Stammlösung vorzubereiten. Hinweis: Die DTT-Stammlösung sollte frisch hergestellt werden, da dieses Reagenz zu oxidative Deaktivierung in wässriger Lösung anfällig ist. </li><li> Pipette 60 ul der 1 M DTT - Lösung in die Proteinlösung den cyt c zu reduzieren. Die Farbe der Lösung von dunkelrot bis hellrot ändern beim Mischen. </li><li> Filtern Sie die reduzierte Proteinlösung durch ein 0,22 &amp; mgr; m geringer Proteinbindung PVDF-Spritzenfilter, bevor sie auf jedem chromatographischen Medium zu injizieren. </li><li> Bringen Sie ein 3,3 ml starke Kationenaustauschsäule zwischen der Injektionsschleife und UV-Vis-Detektor eines Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Instrument. </li><li> Äquilibrierung der Säule mit 3 Säulenvolumina Reinstwasser, gefolgt von 3 Säulenvolumina 20 mM pH 7 Phosphatpuffer, eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min verwendet wird. </li><li> Last 1 ml reduziertes Rohöl cyt c in die Injektionsschleife, und starten Sie eine Gradientenmethode 328-450 mM NaCl, über 5 Säulenvolumen. Überwachen Sie die 280 nm und 410 nm Kanäle des UV-Vis-Detektor, und sammeln die größte Spitze. </li><li> Erhöhung der Salzkonzentration auf 1 M für 2 Säulenvolumina iso-2 Cytochrom zu eluierene c, und nachdem die Säule gespült wurde, Re-Äquilibrieren der Säule mit 2 Säulenvolumina von 20 mM Phosphatpuffer , bevor der nächste grobe Aliquot einzuspritzen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,9-1,10, bis das gesamte rohe Protein gereinigt worden ist. </li><li> Pool, die iso-1 enthaltenden Fraktionen und konzentriert sie mit einem 3,5 kDa Molekulargewichtsgrenze (MWCO) Spinfilter und Zentrifugieren bei 3000 x g. </li><li> Legen Sie das konzentrierte Protein in 3,5 kDa MWCO Dialysekassetten und dialysiert gegen Reinstwasser über Nacht, mit 2 Wasserwechsel. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration des reinen, konzentrierten Proteinlösung von 10 &amp; mgr; l nehmen, Verdünnen auf 100 ul mit Reinstwasser und unter ein Absorptionsspektrum. Verwenden Sie ein geringes Volumen, 100 &amp; mgr; l Quartzküvette Protein Absorptionsspektren zu erhalten. Typischerweise ist das unverwässerte Proteinkonzentration in der Größenordnung von 50 bis 100 &amp; mgr; M. <ol><li> Verwenden Sie die charakteristische 410 nm - Spitze von Cyt c , um den concentratio quantifizierenn mit dem Beer-Lambert - Gesetz mit einem molaren Absorptionswert von 97,6 cm -1 mM -1: A = ε × c × ι wobei A die Extinktion ist, ε der molare Extinktionskoeffizient, c die Konzentration in mM ist und ι die Weglänge der Küvette in cm 13. </li></ol></li><li> An dieser Stelle teilen das Protein in 1 ml Aliquots und gefroren halten bei -20 ° C, bis sie benötigt werden. Cyt c kann ohne Verlust der Struktur oder Funktion eingefroren und aufgetaut werden, aber Wiederholungszyklen beginnt das Protein zu denaturieren. Hinweis: Die Proteine ​​tolerieren Einfrieren in unterschiedlichem Ausmaß. Zum Beispiel sollte grün fluoreszierende Proteine ​​5,9 nicht eingefroren werden, statt in einem Kühlschrank gelagert. </li></ol> 2. Synthese von Cytochrom c -Biokonjugaten <ol><li> Man löst 0,9 mg Ruthenium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (jato) 2 -Maleimid, 0,975 &amp; mgr; mol, 6 Äquivalente) in 600 &amp; mgr; l Acetonitril. Hinweis: Bei Verwendung der Maleimid in Wasser löslich ist, um eine Stammlösung in Wasser herzustellen, anstatt Acetonitril. Es ist wichtig für das Maleimid löslich in dem Reaktionspuffer sein. Dimethylsulfoxid, N, N - Dimethylformamid und Acetonitril werden alle Hilfsstoffe gemeinhin verwendet in der Auflösung von niedrigem Molekulargewicht , 12 zu unterstützen, häufig hydrophobe Maleimid Reaktanden. </li><li> Bereiten einer Pufferlösung , enthaltend 100 mM Phosphatpuffer und 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, M w = 292,24 g / mol), die , wenn sie 7 bis 20 mM bei pH verdünnt festes Natriumhydroxid hinzu , bis das EDTA gelöst (mehrere Gramm typischerweise ) und stellen Sie den pH-Wert auf 7. </li><li> Man löst 2,87 mg Tris (2-carboxyethyl) phosphin - Hydrochlorid (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) in 1 ml Reinstwasser eine 10 mM Stammlösung herzustellen. Dieser Schritt ist der Important , um sicherzustellen , daß das Cystein auf dem Protein vollständig vor verringert Kupplung 15 an Maleimid. Anmerkung: Die Stammlösung sollte TCEP frisch für jede Reaktion hergestellt werden, da dieses Reagenz oxidative Deaktivierung in wässriger Lösung anfällig ist. </li><li> Kombinieren 11,4 ml Reinstwasser mit 3 ml 100 mM Phosphat / EDTA-Stammlösung in einem 50 ml Kunststoffröhrchen. Wenn weiter verdünnt mit Protein und Maleimid Stammlösungen der Pufferkonzentration 20 mM sein. Hinweis: Wenn das Protein markiert ist ein Transmembranprotein ist, stellen Sie sicher, dass ein geeignetes Reinigungsmittel zu dem Puffer hinzugefügt wird, das Protein löslich zu machen. Wenn ein Reinigungsmittel nicht verwendet wird, kann das Membranprotein langsam auszufallen, was sich negativ auf die Reaktionsausbeuten auswirken wird. Verwenden Sie das Waschmittel in allen nachfolgenden Reinigungsschritte. </li><li> 0.15 &amp; mgr; mol (3 ml einer 50 uM - Lösung, 1 Äquivalent) gereinigt cyt c mit dem Phosphat-EDTA - Puffer. </li><li> 7.5 ul der TCEP Lager solutIon (0,075 &amp; mgr; mol, 0,5 Äquivalente) zu der Proteinlösung und lassen Sie für 5 min Rühren jedes Protein zu reduzieren, die aufgrund Cysteinoxidation dimerisierte haben. Hinweis: TCEP nicht hinzufügen, wenn das Protein von Interesse nicht ohne weiteres dimerisieren. Überprüfen Sie dies durch ein Protein-Gel unter nicht reduzierenden Bedingungen läuft. </li><li> Hinzufügen 600 ul der Acetonitrillösung von Ru (II) (tpy) 2 -maleinimid der reduzierten, gepufferten Lösung von cyt c und lassen das Reaktionsgemisch unter Rühren im Dunkeln bei RT 24 h. </li><li> Konzentriere das Reaktionsgemisch mit 3,5 kDa MWCO Spinfilter, bei 3000 × g zentrifugiert, wiederholen 2-3 mal mit frischem 20 mM Phosphatpuffer, bis das Filtrat klar bleibt. Entfernen Sie so viel nicht umgesetzte Maleimid aus dem Reaktionsgemisch wie möglich, bevor die nächste Stufe der Reinigung. Anmerkung: An diesem Punkt kann die rohe Biokonjugation Gemisch im Kühlschrank aufbewahrt werden, in der Dunkelheit. Es ist wichtig, um nicht umgesetztes Maleimid centr Farbstoff zu entfernenifuge Dialyse vor der Lagerung als Maleinimid langsam und unspezifisch mit Lysinresten auf der Oberfläche des Proteins reagieren. </li></ol> 3. Reinigung von Cytochrom c -Biokonjugaten <ol><li> Man löst 2,4 g Natriumdihydrogenphosphat und 29.22 g Natriumchlorid in 1 l Reinstwasser eine Pufferlösung herzustellen , die 20 mM NaH 2 PO 4 und 0,5 M NaCl. Dies ist der Laufpuffer für die immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) Reinigung. </li><li> Man löst 17 ​​g Imidazol (M w = 68,077 g mol -1) in 500 ml des 20 mM NaH 2 PO 4 und 0,5 M NaCl - Puffer. Dies ist der Elutionspuffer für die IMAC-Reinigung. </li><li> Der pH-Wert beider Puffer pH 7 unter Verwendung von 1 M NaOH oder HCl, und filtern sie durch 0,22 um regenerierte Cellulosemembranen vor der Verwendung in der FPLC. </li><li> Da die IMAC Spalten gekauft werden ohne Metallionen ausgeliefert auf den col geladenUMN, bereiten Sie die Spalte für eine Ni 2+ -basierten Reinigung durch die Säule mit 3 ml Reinstwasser Waschen, 3 ml 100 mM Nickelacetat - Lösung und 6 ml Reinstwasser. Wenn die Spalte nicht sofort durch 3 ml 20% igem Ethanol und speichern die Säule im Kühlschrank waschen verwendet werden Bakterienwachstum zu verhindern. </li><li> Bringen Sie ein Ni 2+ -beladene 1 ml IMAC - Säule auf die FPLC zwischen der Injektionsschleife und UV-Vis - Detektor. </li><li> Äquilibrierung der Säule mit 3 Säulenvolumina 20 mM Phosphat, 0,5 M NaCl-Puffer mit einem Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min verwendet wird. </li><li> Last 100 ul des rohen Reaktionsgemisches (filtriert durch ein 0,22 um - Spritzenfilter) auf der Ni 2+ IMAC - Säule. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina Puffer läuft nicht umgesetztem cyt c zu eluieren, gefolgt von einem Imidazol - Gradienten von 0 bis 125 mM über 3 Säulenvolumina des Rutheniums bisterpyridine-Cytochrom c Biokonjugat zu eluieren (Ru (II) -cyt c) . </li><li> Waschen Sie die cPALTE mit 250 mM Imidazol-Puffer für 5 Säulenvolumina, anschließend erneut äquilibriert Die Säule wird mit 20 mM Phosphat, 0,5 M NaCl und wiederhole Schritt 3.7, bis das gesamte rohe Biokonjugat gereinigt wurde. </li><li> Pool die Biokonjugat Fraktionen und konzentrieren sie mit einem 3,5 kDa MWCO Spinfilter, Zentrifugieren bei 3000 x g. </li><li> Legen Sie das konzentrierte Biokonjugat in 3,5 kDa MWCO Dialysekassetten und dialysiert gegen Reinstwasser über Nacht, mit 2 Wasserwechsel. </li><li> Bestimmung der Konzentration des reinen, konzentrierten Biokonjugat Lösung durch UV-Vis, unter Verwendung der gleichen molaren Absorptionswert als iso-1 - Cytochrom c (97,6 mM -1 cm -1) bei 410 nm. Typischerweise ist die Biokonjugat Konzentration in der Größenordnung von 50 bis 100 uM. </li><li> Teilen Sie die Biokonjugat in 25 ul Aliquots und halten gefroren bei -20 ° C, bis sie benötigt werden. </li></ol> 4. Charakterisierung von Cytochrom c -Biokonjugaten <ol><li> AbhaltenDigen Biokonjugat Masse durch MALDI-TOF-MS <ol><li> Man löst 10 mg Kaffeesäure in 1 ml eines Acetonitril / Wasser / Trifluoressigsäure-Lösung (80: 20: 0,1, v / v / v). </li><li> Verdünne 5 &amp; mgr; l konzentrierte Proteinlösung mit 5 ul Kaffeinsäure Lösung. </li><li> Spot 0,5 ul Kaffeinsäure Lösung auf dem MALDI Zielplatte und die Lösung zu trocknen. </li><li> Spot 0,5 &amp; mgr; l der Probe / Matrix-Lösung im oberen Teil der Kaffeesäure Stelle, kann der Stelle zu trocknen. Beschmutzen weitere 0,5 &amp; mgr; l Probenmatrix auf dieses auf &quot;Sandwich&quot; der Probe zwischen den Schichten der Matrix und trocknen lassen. </li><li> Erwerben Massenspektren im linearen Modus geeignet Geräteeinstellungen für Proteine ​​16 verwenden. </li></ol></li><li> Untersuchung der Biokonjugate durch Gelelektrophorese <ol><li> Herstellung von 10 ul jeder Proteinprobe durch Verdünnen von Proteinproben mit vorgemischten Lithiumdodecylsulfat (LDS, pH 8,4) Puffer (4x) t zu laufenoa Endkonzentration von etwa 20 &amp; mgr; g pro Vertiefung. Für Brunnen, die reduzierenden Bedingungen benötigen, fügen 1 ul 500 mM Dithiothreitol (DTT) Reduktionsmittel (10x). </li><li> Wärme Proben bei 70 ° C für 10 min. </li><li> 50 ml vorgemischtes 1 M MES, 1 M Tris-Base, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7,7) Laufpuffergemisch (20x) von einer handelsüblichen Quelle auf 950 ml Reinstwasser des Gel-Laufpuffer herzustellen. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoff-Kamm aus dem Gel und legen Sie das Gel in dem Gel Lauftank. Füllen Sie den Tank mit Gel-Laufpuffer, so dass die Vertiefungen mit Puffer bedeckt sind. </li><li> Laden Sie die Proben vorsichtig auf eine Fertig 12% Bis-Tris, 1 mm, 10-Well-Gel lange Pipettenspitzen beim Laden zu unterstützen. Laden Sie das färbten 10 Protein-Molekulargewichtsmarker (3-188 kDa) in eine mittlere Vertiefung der Gel-Analyse zu unterstützen. </li><li> Führen Sie das Gel bei 200 V konstanter Spannung für 35 min. </li><li> Stain das Gel mit einem kommerziellen Coomassieblau-Lösung für 2 Stunden und waschen mit ultrapure Wasser für 48 Stunden. </li></ol></li><li> Bestimmung von Biokonjugat Reinheit durch UV-Vis - Spektroskopie <ol><li> Bereiten 120 &amp; mgr; l von 5 &amp; mgr; M Lösungen von Ru (II) (tpy) 2 -maleimid, iso-1 cyt c und Ru (II) -cyt c. </li><li> Messen der Basislinienspektrum der Quarzküvette nur Reinstwasser, von 250 nm bis 650 nm enthält. </li><li> Messen Sie das Spektrum der einzelnen Komponenten gewährleistet die Küvette gespült und zwischen jeder Messung getrocknet. </li><li> Plotten die Absorption jeder Komponente als eine Funktion der Wellenlänge, und vergleichen die lineare Summe der Ausgangsmaterialien mit dem Endprodukt zu bestimmen , ob eine 1: 1 - Verhältnis von Ru (II) (tpy) -maleinimid 2 bis cyt c reagiert hat. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-272 (1998).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+Fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).</li><li>Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+of+anticancer+drugs+through+endogenous+monoclonal+antibody+cysteine+residues.">Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues.</a> Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).</li><li>Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+site-specific+ScFv+PEGylation+for+tumor-targeting+pharmaceuticals.">Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals.</a> Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).</li><li>Hvasanov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Synthesis+of+High+Molecular+Weight+Synthetic+Heteroprotein+Dimers+Driven+by+Charge+Complementarity+Electrostatic+Interactions.">One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions.</a> J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).</li><li>Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+protein-polymer+conjugates--synthesis+and+potential+applications.">Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).</li><li>Lutz, J. F., B&#246;rner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+trends+in+polymer+bioconjugates+design.">Modern trends in polymer bioconjugates design.</a> Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).</li><li>Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+functionalization+strategies+and+biomedical+applications+of+targeted+biodegradable/biocompatible+polymer-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).</li><li>Wong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes+Prepared+from+Thermoresponsive+Fluorescent+Protein-Polymer+Bioconjugates:+Capture+of+and+Report+on+Drug+and+Protein+Payloads.">Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads.</a> Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (2013).</li><li>Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+cysteines+substituted+in+the+amphipathic+N-terminal+tail+of+a+bacterial+potassium+channel+with+hydrophilic+and+hydrophobic+maleimides.">Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).</li><li>Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+room+temperature+photo-induced+electron+transfer+in+biologically+active+bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome+c+bioconjugates+and+the+effect+of+solvents+on+the+bioconjugation+of+cytochrome+c.">Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c.</a> Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).</li><li>Borges, C. R., Sherma, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+Analysis+of+Cysteine+Sulfhydryls+and+Oxidative+Protein+Folding.">Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding.</a> Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).</li><li>Peterson, J. R., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+purification+of+terpyridine-cytochrome+c+bioconjugates.">Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates.</a> Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).</li><li>Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+synthesis,+polymer+membrane+encapsulation+and+photoreduction+performance+of+Ru(II)-+and+Ir(III)-bis(terpyridine)+cytochrome+c+bioconjugates.">Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates.</a> Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).</li><li>Signor, L., Boeri Erba, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+Laser+Desorption/Ionization+Time+of+Flight+(MALDI-TOF)+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Intact+Proteins+Larger+than+100+kDa.">Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa.</a> J. Vis. Exp. , e50635 (2013).</li><li>Foucher, M., Verdi&#232;re, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+a+non-trimethylated+iso-1+cytochrome+c+in+a+wild-type+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae).">On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae).</a> Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).</li><li>M&#252;ller, M., Azzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+beef+heart+cytochrome+oxidase+subunit+III+with+eosin-5-maleimide.">Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide.</a> FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).</li><li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Reinigung der Ausgangsmaterialien vor einer Biokonjugation ist von größter Bedeutung. Proteine, erhalten aus kommerziellen rekombinanten Quellen enthalten oft andere Isoformen des Proteins von Interesse, die unterschiedliche Oberflächenchemie und Reaktivität aufweisen. Beispielsweise in dem beschriebenen Biokonjugation, enthält das handelsübliche cyt c ein Gemisch aus beiden iso-1 und iso-cyt c 2 12,14,17. Iso-2 und iso-1 Formen von Cytochrom c sind weitgehend homolog mit der ...

Biokonjugation beinhaltet die Verknüpfung kovalent ein Biomolekül mit einem anderen oder mit einem synthetischen Molekül, wie ein Farbstoff, Arzneimittel oder einem Polymer. Protein Biokonjugation Methoden werden nun ausführlich in vielen Chemie, Biologie und Nanotechnologie Forschungsgruppen mit Anwendungen , die von fluoreszierenden Farbstoffmarkierung 1,2, Herstellung von Protein (Antikörper) -prodrugs 3 (Antikörper - Wirkstoff - Konjugate - ADCs) verwendet Synthese von Protein - Dimere 4,5 bis hin zu selbstorganisierenden Protein-Polymer - Hybriden 6,7 verwendet in den Bereich Nanomedizin 8 und Systemchemie 9. Spezifität der Chemie für die Biokonjugation verwendet, während nicht immer kritisch, ist von größter Bedeutung für die meisten funktionellen Protein Biokonjugate, um nicht mit der aktiven Stelle des Zielproteins zu stören. Die ideale Biokonjugation Reaktion muss mehrere Kriterien erfüllen, darunter: i) Targeting seltene oder einzigartige Stellen auf dem Protein von Interesse,ii) werden selektiv in Richtung auf dieses Ziel, iii) gehen unter nicht-denaturierenden Bedingungen Proteins zu vermeiden Entfalten und iv) werden mit hoher Ausbeute als das Zielprotein bei unteratmosphärischem millimolar Konzentration der Regel nur zur Verfügung steht. Das Maleimid - Cystein Michael Zusätzlich kommt in der Nähe , alle diese Kriterien zu erfüllen, und hat aus diesem Grund lange einen besonderen Status im Bereich der Biokonjugat Chemie 10 beansprucht. Dies ist, weil i) viele Proteine ​​nur einen Cysteinrest an ihrer Oberfläche enthalten, können genetisch es so konstruiert werden, ii) in der richtigen pH der Reaktion auf Cystein hochselektiv ist, iii) es verläuft glatt in wässrigen Puffern und iv) es ist sehr schnell mit der Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung von Maleimiden in Cystein enthaltenden Proteinen berichtet überschreiten 5,000 M -1 sec -1 in einigen Fällen 11. Sofern das Protein von Interesse einen kleinen (≈ 5-10%) Menge an organischem Co-Lösungsmittel 12, fast jede Maleimid-funktionalisierten Farbstoff tolerieren kann, polymer, Oberfläche oder ein anderes Protein können an Proteine ​​gebunden werden. Darüber hinaus sind Maleinimide spezifischer für Cysteine ​​an Proteinen als iodoacetamides, die Reaktion mit anderen Nucleophilen bei erhöhten pH anfälliger sind; und stabiler als Disulfid-basierte Konjugationen , die bei einem sauren pH gehalten werden müssen Disulfidaustausch 13 zu verhindern. Hier berichten wir über ein generisches Protokoll für die Konjugation von Maleimid-funktionalisierten Molekülen an ein Protein , einen einzelnen Cysteinrest unter Verwendung der Reaktion zwischen einem Ru (II) -Basis Chromophor und dem Redoxprotein Cytochrom c als Beispiel enthalten. Dieses Protokoll ist gleichermaßen auf die meisten anderen Proteine, die eine zugängliche Oberfläche Cysteinrest und das entsprechende Maleimid-funktionalisierten Ziel, sei es ein anderes Protein, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Chromophor oder ein synthetisches Polymer enthält.

<table><tbody><tr><td>sodium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71691</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>cytochrome &lt;em&gt;c&lt;/em&gt;, from saccaromyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2436</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Tosoh SP-5PW, 07161</td><td>3.3 ml strong cation exchange column</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15&amp;nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC900308</td><td>3.5 kDa spin filter</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td><td>Thermo Scientific</td><td>66333</td><td>3.5 kDa dialysis cassetes</td></tr><tr><td>Ru(II) bisterpyridine maleimide</td><td>Lab made</td><td></td><td>see ref (14)</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3396</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609</td><td></td></tr><tr><td>tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93284</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>nickel acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244066</td><td></td></tr><tr><td>AcroSep IMAC Hypercell column</td><td>Pall</td><td>via VWR: 569-1008</td><td>1 ml IMAC column</td></tr><tr><td>0.2 micron cellulose membrane filter</td><td>Whatman</td><td>Z697958</td><td>47 mm filter for buffers</td></tr><tr><td>0.2 micron PVDF membrane filter</td><td>Merck-Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>syringe filters for proteins</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84426</td><td>Extremely corrosive! Use caution.</td></tr><tr><td>caffeic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60018</td><td>MALDI matrix</td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td>extremely corrosive! Use caution</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC6060</td><td>Coomassie blue solution</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0342BOX</td><td>precast protein gels</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td>premade protein ladder</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td>premade gel sample buffer</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0004</td><td>premade gel reducing agent</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0002</td><td>premade gel running buffer</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acta FPLC</td><td>GE</td><td></td><td>Fast Protein Liquid Chromatography</td></tr><tr><td>Cary 50 Bio Spectrophotometer</td><td>Varian-Agilent</td><td></td><td>UV-Vis</td></tr><tr><td>Milli-Q ultrapure water dispenser</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>ultrapure water</td></tr><tr><td>Low volume UV-Vis Cuvette</td><td>Hellma</td><td>105-201-15-40</td><td>100 microliter cuvette</td></tr></tbody></table>

synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Die Synthese von Biokonjugaten wird durch drei primäre Methoden bestätigt: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), Polyacrylamid - Gelelektrophorese und UV-VIS (UV-Vis) Spektroskopie, wie in den 2, 3 und 4. Eine Massenzunahme der Masse des beigefügten kleine Molekül und das Fehlen eines nicht - umgesetztem Protein entspricht zeigt die erfolgreiche kovalente Verknüpfung von Ru (II) (tpy) -maleinimi...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry at JoVE.com

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte für die Biokonjugation eines Cysteins erforderlich Proteins an ein Maleimid enthalten, einschließlich Reagenz Reinigung, Reaktionsbedingungen Biokonjugat Reinigung und Charakterisierung Biokonjugat.

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

synthesis-of-protein-bioconjugates-via-cysteine-maleimide-chemistry

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

38.5K Aufrufe.  The University of New South Wales.  Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte für die Biokonjugation eines Cysteins erforderlich Proteins an ein Maleimid enthalten, einschließlich Reagenz Reinigung, Reaktionsbedingungen Biokonjugat Reinigung und Charakterisierung Biokonjugat. 

Serie: Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. The most common techniques utilized are imaging modalities such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emission Topography (PET), and Computed Topography (CT) and are optimal for understanding the physical structure of the disease but can only be performed once every four to six weeks due to the use of imaging agents and overall cost. With this in mind, the development of &#8220;point of care&#8221; techniques, such as biosensors, which evaluate the stage of disease and/or efficacy of treatment in the clinician&#8217;s office and do so in a timely manner, would revolutionize treatment protocols.1 As a means to exploring ferrocene based biosensors for the detection of biologically relevant molecules2, methods were developed to produce ferrocene-biotin bio-conjugates described herein. This report will focus on a biotin-ferrocene-cysteine system that can be immobilized on a gold surface.

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Synthesemethoden für Asymmetric Ferrocen abgeleitete Bio-Konjugat-Systemen über Festphasen-Resin-basierte Methodik

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

Forschung

Chemie

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf<em&gt; Mais rayado fino-Virus</em&gt; Virus-ähnliche Partikel Produziert in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Pflanzen und Vernetzung der Peptide an VLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Immunologie und Infektion

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different positions. Preclinical studies have shown that the therapeutic index of these traditional ADCs can be improved by the site-specific linkage of toxins. However, current approaches to produce homogeneous ADCs have several limitations, such as low protein expression and slow reaction kinetics. In this protocol we describe how to set up an expression system to incorporate a cyclopropene derivative of lysine (CypK) into antibodies using genetic code expansion. This minimal bioorthogonal handle allows rapid conjugation of tetrazine derivatives through an inverse-demand Diels-Alder cycloaddition. The expression system here reported enables the facile production and purification of trastuzumab bearing CypK in each of the heavy chains. We explain how to link the antibody to the toxin monomethyl auristatin E and characterize the immunoconjugate by hydrophobic interaction chromatography and mass spectrometry. Finally, we describe assays to assess the stability in human serum of the dihydropyridazine linkage resulting from the conjugation and to test the selective cytotoxicity of the ADC for breast cancer cells with high levels of HER2 receptor.

Incorporating a cyclopropene derivative of lysine into antibodies allows the site-specific, rapid and efficient linkage of tetrazine-bearing molecules to generate antibody-drug conjugates.

Durch eine schnelle Bioorthogonal Reaktion Konjugate genetischen Codierung einer nicht-kanonische Aminosäure für die Erzeugung von Antikörper-Wirkstoff

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>Herstellung von ortsspezifischen zytotoxischen Proteinkonjugaten mittels Maleimid-Thiol-Chemie und Sortase A-vermittelter Ligation

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Herstellung von ortsspezifischen zytotoxischen Proteinkonjugaten mittels Maleimid-Thiol-Chemie und Sortase A-vermittelter Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

Biochemie

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Synthese von Protein Biokonjugate

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Synthesemethoden für Asymmetric Ferrocen abgeleitete Bio-Konjugat-Systemen über Festphasen-Resin-basierte Methodik

Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Durch eine schnelle Bioorthogonal Reaktion Konjugate genetischen Codierung einer nicht-kanonische Aminosäure für die Erzeugung von Antikörper-Wirkstoff

Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Herstellung von ortsspezifischen zytotoxischen Proteinkonjugaten mittels Maleimid-Thiol-Chemie und Sortase A-vermittelter Ligation

Herstellung von ortsspezifischen zytotoxischen Proteinkonjugaten mittels Maleimid-Thiol-Chemie und Sortase A-vermittelter Ligation

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden