Name: stem-cell based engineered immunity against hiv infection in the humanized mouse model
Uploaded: 2016-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model at JoVE.com

We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)

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The authors have nothing to disclose.

Mit CAR und HSC-basierten entwickelt Immunität gewinnt an Dynamik zu klinischen Studien, ist es wichtig, eine richtige Tiermodell zu haben, um genau die Differenzierung und Funktion dieser gentechnisch veränderten Zellen zu untersuchen. In diesem Protokoll beschrieben wir die Methoden für die Konstruktion und Prüfung der humanisierten Mäuse mit genetisch veränderten Stammzellen gentechnisch gegen HIV. Es ist wichtig, eine effiziente Transduktion von Stammzellen vor der Transplantation zu haben. Jedoch aufgrund der Fähigkeit von T - Zellen bei Erkennung von Zielzellen zu vermehren, geringe Mengen an Stammzell Modifikation waren ausreichend , um eine robuste Antwort gegen HIV - Replikation 8 zu erzeugen. Dennoch hohe Stammzell Modifikation zu erreichen, empfehlen wir die Verwendung transduzierten CD34 + Zellen in gallertartig Proteinmischung mit autologem Thymus anstelle von Leber und Thymus Brocken für Mäuse Chirurgie , die an anderer Stelle 13 bis 15 beschrieben worden war. Gelatinous Proteinmischung ist ein solubilized Gewebe Basalmembran reich an extrazellulären Matrixproteinen. Unter normalen physiologischen Bedingungen polymerisieren gelatinösen Proteinmischung eine rekonstituierte, biologisch aktive und stabile Matrix zu erzeugen , die wirksame Anhaftung und Differenzierung der Stammzelle 20 ermöglichen würde. Menschliche Zelle Rekonstitution kann durch retro-orbitales Bluten überprüft werden und Durchflusszytometrie 6 - 8 Wochen nach der Operation. Um sicherzustellen, dass der Vektor für die Stammzellüberleben und die Erneuerung nicht toxisch ist, ist es empfehlenswert, den Vektor in CD34 + Zellen vor dem Experiment zu titrieren, wie in 1.2.6 beschrieben. Die Kapazität des NSG-BLT - Mausmodell mukosalen Infektion, konsistente Virämie und zelluläre Immunantworten ist es ein sehr nützliches Modell zum Studium von HIV immune Pathologie und zellbasierte Therapien zu unterstützen HIV - Infektion 1 zu behandeln. Am wichtigsten ist, erzeugt T-Zellen aus den NSG-BLT-Mäuse werden in der autologe Thymusgewebes ausgewählt, die Forscher ermöglicht, das Schicksal zu studierender Gen - modifizierten Stammzellen nach thymic Auswahl 8,21. Mit dem beschriebenen Verfahren konnten wir durchweg 40% -90% menschlichen Immunzellen Rekonstitution zu erhalten. Geringe Mengen an menschlichen Zell Rekonstitution können aus mehreren Faktoren ergeben, einschließlich der Fähigkeiten der Person, die Operation und die Qualität der Gewebe für die Transplantation durchgeführt wird. Auf einen hohen Pegel von menschlichen Zell Rekonstitution zu erreichen, ist es wichtig, die Transplantate zu gewährleisten sicher unterhalb der Nierenkapsel platziert. Darüber hinaus ist es sehr empfehlenswert, jedes Thymus Implantat für Chirurgie unter dem Lichtmikroskop und entsorgen Sie alle fragwürdigen Stücke vorbereitet zu untersuchen. Obwohl die humanisierte BLT Mausmodell zur Untersuchung von gentechnisch Immunität gegen HIV ( überprüft in 1,15,22) ein vielversprechendes Werkzeug ist, hat es seine eigenen Grenzen. Und zwar ist dieses Modell perfekt keinen menschlichen peripheren Immunsystem nachzuahmen. Studien haben beeinträchtigte Entwicklung von hyper-mutierten gezeigt, Klasse vermitteltes IgG Antibody 1,23. Darüber hinaus ist immun-defizienten Mäusen mit technisch anspruchsvoll und gesund erfordert diese Mäuse halten beträchtliche Ressourcen und Ausbildung. Subtile opportunistische Infektionen können als signifikante Unterschiede zwischen den Proben manifestieren und haben negative Auswirkungen auf die Experimente. Deshalb ist es wichtig , gut vorbereitet Einrichtungen zu haben und entsprechend geschultes Personal Integrität der zukünftigen Daten 1,24 zu halten. Mit diesen Einschränkungen im Sinn stellt die humanisierte NSG-BLT - Mausmodell noch ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von Stammzelle basierend engineered Immunität, wie sie durch diese Beispiele gezeigt wird , 4,8. Mit dem Trend chimären Antigenrezeptoren der Entwicklung basierend auf HIV - Antikörper breiten 10 und Änderung der Signal - Domäne für eine effizientere CAR 25, ist dieses Modell und Protokoll neutralisieren kann verwendet werden , um die Funktionalität des Gens modifiziert cel zu charakterisieren und zu untersuchenls mit einer neuen Generation von Autos. Darüber hinaus kann dieses Modell möglicherweise aufnehmen Studien zur Immun basierte Therapie (wie inhibitorische Rezeptor-Blockade) in Verbindung mit Engineered Immunität.

Trotz des Erfolgs der kombinierten antiretroviralen Therapie, ist eine HIV-Infektion noch eine lebenslange Krankheit. Die zelluläre Immunantwort gegen HIV spielt sehr wichtige Rolle in der HIV-Replikation steuern. Die jüngsten Fortschritte in der Stammzellmanipulation hat sich für die rasche Entwicklung der Gentherapie Ansätze zur HIV - Behandlung 1-3 erlaubt. Infolgedessen ist es wichtig , einen geeigneten Tiermodell zu haben , die der Wirksamkeit von zellbasierten Therapien gegen HIV in vivo Studie erlaubt. Arbeiten mit HIV in Tiermodellen wird durch die Tatsache kompliziert, daß nur das Virus menschliche Zellen infiziert. Um diese Einschränkung zu umgehen, haben die Wissenschaftler zur Verwendung von Krankheitsmodellen wie dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV) in Rhesus - Makaken gegriffen 4,5. Leider gibt es in diesem Modell wesentliche Einschränkungen aufgrund der inhärenten Unterschiede zwischen den Arten und die Unterschiede zwischen SIV und HIV. Darüber hinaus sind nur hoch spezialisierte Einrichtungen sind capable der Arbeit mit nicht-menschlichen Primaten zu unterstützen und jedem Makaken erfordert eine große Investition. Somit besteht ein dringendes Bedürfnis nach einem Modell, das das menschliche Immunsystem verwendet, die mit HIV-Infektion / Pathogenese geeignet ist, und ist weniger wirtschaftlich unerschwinglich. Die nicht-obese diabetic (NOD) -severe kombiniert immunodeficient (SCID) -common gamma - Kette Knockout (c γ - / -) (oder NSG) Blut / Leber / Thymus (BLT) humanisierten Mausmodell nachgewiesen wird zunehmend ein wichtiges Instrument sein , HIV-Infektion zu studieren. Hämatopoetischer Stammzellen (HSZ) und fötalen Thymus durch Implantation sind die Mäuse entwickeln können und ein menschliches Immunsystem 1-3 rekapitulieren. Eine Art von stammzellbasierten Gentherapie beinhaltet peripheren T-Zellen &quot;Umleitung&quot; HIV zum Ziel durch hämatopoetische Stammzellen Neuprogrammierung (HSZ) in Antigen-spezifischen T-Zellen zu unterscheiden. Wir haben bereits gezeigt, dass Engineering-HSCs mit einem molekularen geklont Anti-HIV-spezifischen T-Zell-reRezeptor (TCR) gegen die SL9 Epitop (Aminosäuren 77-85; SLYNTVATL) von HIV-1 Gag können Stammzellen zu bilden , reife T - Zellen leiten , die HIV - Replikation in dem humanisierten NSG-BLT Maus 6 - Modell unterdrücken. Der Nachteil eines molekularen geklont TCR ist, dass es zu einem bestimmten humanen Leukozyten-Antigen (HLA) Subtyp beschränkt ist, die die Anwendung dieser Therapie beschränken. Chimäre Antigenrezeptoren (CAR), auf der anderen Seite, ist universell für alle HLA-Subtypen angewendet werden. Erste Studien wurden ein Auto mit den extrazellulären und Transmembrandomänen des humanen CD4 an die intrazelluläre ζ fusioniert konstruiert durchgeführt unter Verwendung von Signal-Domäne von CD3 (der so genannten CD4ζCAR). CD4ζCAR ausgedrückt auf CD8 - T - Zellen können HIV envelope erkennen und eine zytotoxische T - Zellantwort auslösen, die zu der durch ein T - Zell - Rezeptor - vermittelten 7 ähnlich ist. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass menschliche HSCs mit CD4ζCAR modifiziert werden, die dann in mehrere hämatopoetische li unterscheiden kannneages, einschließlich funktionelle T - Zellen unterdrücken kann die HIV - Replikation in dem humanisierten Maus - Modell 8. Mit dem schnellen Fortschritt in chimären Antigen - Rezeptor - Therapien für Krebs 9 und der laufenden Charakterisierung potent breiten neutralisierenden Antikörpern gegen HIV 10-12, die die Konstruktion von Einzelketten - Antikörper CARs ermöglichen, ist es erkennbar , dass viele neue Kandidaten - Konstrukte, zusätzlich zu CD4ζCAR wird für Stammzellen basierten Gentherapie von HIV-Erkrankungen und andere Erkrankungen erzeugt und getestet werden. Darüber hinaus kann der humanisierte NSG-BLT - Mausmodell , diese antigenspezifischen CARs enthält auch ein nützliches Instrument zur eng humanen T - Zell - Antworten in vivo zu untersuchen. Wichtig ist , unterscheidet sich unser Protokoll der letzten Zeit beschriebenen Verfahren zur Konstruktion von humanisierten von BLT Mäuse 13-15, dass das HSZ in gallertartig Proteinmischung wird 16 anstelle von fötalen Leberstämme verwendet. Dieses Protokoll beschreibt: 1) Aufbau von humanized BLT Mäuse mit CD4ζCAR entwickelt; und 2) Charakterisierung der Differenzierung der genetisch modifizierten Zellen; und 3) Charakterisierung der Funktionalität der genetisch modifizierten Zellen.

<table><tbody><tr><td>CD34 microbead kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>For sorting human CD34+ progenitor cells</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>For measuring viral load in the serum</td></tr><tr><td>MACSQuant Flow Cytometer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>For flow analysis</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&amp;trade;</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>For flow analysis</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&amp;nbsp;</td><td>For tissue digestion</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS002006&amp;nbsp;</td><td>for tissue digestion</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life technology</td><td>17104-019&amp;nbsp;</td><td>for tissue digestion</td></tr><tr><td>CFX Real time PCR detection system</td><td>Biorad</td><td></td><td>For measuring viral load and gene expression</td></tr><tr><td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>For constructing the humanized mice</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>For culturing cells</td></tr><tr><td>Piperacillin/tazobactam</td><td>Pfizer</td><td>Zosyn</td><td>Anti-fungal</td></tr><tr><td>Amphotericin B (Fungizone antimycotic)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290-018</td><td>Anti-fungal</td></tr><tr><td>Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631&amp;nbsp;</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>DYNJP2707&amp;nbsp;</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Sutures, 4-0, vicryl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>23000J304H&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Alcohol prep pads&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>3583006818</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Gloves, surgical, 6 1/2</td><td>Owens and Minor</td><td>4075711102</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo;s Serum-Free T-Cell Medium</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-102</td><td>For CD34+ cell transduction</td></tr><tr><td>Human Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>For CD34+ cell transduction</td></tr></tbody></table>

stem-cell based engineered immunity against hiv infection in the humanized mouse model

Mit der schnellen Entwicklung von Stammzell-basierten Gentherapie gegen HIV, ist es Anforderung Pressen für ein Tiermodell die hämatopoetische Differenzierung und Immunfunktion der genetisch veränderten Zellen zu untersuchen. Der humanisierte Knochenmark / Leber / Thymus (BLT) Maus-Modell ermöglicht die vollständige Rekonstitution eines menschlichen Immunsystems in der Peripherie, die T-Zellen, B-Zellen umfasst, NK-Zellen und Monozyten. Der menschliche Thymus-Implantat ermöglicht auch die Thymus-Auswahl von T-Zellen in autologem Thymusgewebes. Neben der Untersuchung der HIV-Infektion, steht das Modell als leistungsfähiges Werkzeug Differenzierung, Entwicklung und Funktion von Zellen, die aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) abgeleitet zu studieren. Hier beschreiben wir den Aufbau von humanisierten nicht obese diabetic (NOD) -severe kombiniert immunodeficient (SCID) -common gamma - Kette Knockout (c γ - / -) -Bone Mark / Leber / Thymus (NSG-BLT) Mäuse mit HSZ transduziert mit CD4 chimären Antigenrezeptoren (CD4CAR)Lentivirusvektor. Wir zeigen, dass die CD4CAR HSCs erfolgreich in mehrere Linien differenzieren können, und Anti-HIV-Aktivität aufweisen. Das Ziel der Studie ist es, die Verwendung von NSG-BLT - Mausmodell als ein in vivo - Modell für engineered Immunität gegen HIV zu demonstrieren. Es ist erwähnenswert, dass, weil Lentiviren und menschlichem Gewebe verwendet wird, Experimente und Operationen sollten in der Klasse II Biosicherheitswerkbank in einem Biosafety Level 2 (BSL2) mit besonderen Vorsichtsmaßnahmen (BSL2 +) Einrichtung durchgeführt werden.

Figur 1 zeigt eine Skizze der Konstruktion von humanisierten BLT Mäuse mit modifizierten Stammzelle. 10 Wochen nach der Implantation wurden die Mäuse geopfert, um die Differenzierung und Entwicklung von Gen-modifizierten Zellen zu bewerten. Wie in 2 gezeigt, mehrere Lymphgewebe (Blut, Milz, Thymus und Knochenmark) wurden aus einer Maus geerntet , die mit CD4ζCAR geändert wurde. Die CD4ζCAR in diesem Protokoll verwendet wird, enthält CD4 chimären Antigenrezeptor und GFP , das von anti-CD4 - Antikörper und die Expression von GFP 8 detektiert werden kann. Die Zellen wurden mit Antikörper gegen humanes CD45 sowie anti-CD4-Antikörper und analysiert mittels Durchflusszytometrie isoliert und gefärbt. GFP und CD4 doppelt positive Zellen nachgewiesen, die das Vorhandensein von CD4CAR + Zellen in mehreren lymphoiden Geweben. Um die Differenzierung der Gen-modifizierten Zellen zu untersuchen,<html> Splenozyten wurden mit Antikörpern gegen menschliches CD45 (Lymphozyten), CD3 (T-Zellen), CD19 (B-Zellen), CD14 (Monozyten und Makrophagen) und CD337 (NK-Zellen) gefärbt. Wie in 3 zu differenzieren in mehrere Linien hämatopoetischen Stammzellen CD4ζCAR gezeigt. Um zu untersuchen, ob CD4CAR modifizierten Zellen funktionell sind, koinkubiert wir Splenozyten mit Zielzellen, die CD4CAR Zellen erkennen würde (HIV infizierten T1-Zellen oder nicht-infizierten T1-Zellen als Kontrolle). Zellen wurden zusammen über Nacht inkubiert und der Proteintransport Inhibitor wurde für weitere 6 Stunden zugegeben. Danach wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert für die intrazelluläre Expression von Zytokinen wie IFN &amp; ggr; und TNF &amp; agr; zu färben. Wie in der CAR 4 gezeigt exprimierenden Zellen produziert höhere Menge an IFNy und TNFa mit infizierten T1 - Zellen. Last / 54048 / 54048fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Übersicht über die Konstruktion von humanisierten BLT Mäuse mit modifizierten Stammzellen FT:. Fetal Thymus. FL:. Fötalen Leber <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54048/54048fig2.jpg" /> Fig . 2: CD4 chimären Antigen - Rezeptor modifizierten Zellen können in mehreren lymphatischen Geweben nachgewiesen werden Maus mit CD4CAR modifizierten HSCs wurden 10 Wochen nach der Operation und mehrere Lymphgewebe geopfert wurden geerntet und die Zellen wurden mit anti-human - CD45 und anti-human - CD4 - Antikörpern gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 3:.. CD4 chimären Antigenrezeptoren modifizierten Zellen in mehrere Linien unterscheiden können Splenozyten von CD4CAR veränderten Mäusen wurden geerntet und gefärbt mit Antikörpern gegen das humane CD45, CD3, CD19, CD14 und CD337 und analysiert mittels Durchflusszytometrie <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um ein</a> , <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig3large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern Version dieser Figur.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54048/54048fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Ex vivo Zytokin - Assay von CD4 CAR + T - Zellen , Splenozyten von HIV - infizierten CD4CAR Mäuse mit stimuliert wurden entweder HIV - infizierten oder nicht infizierten T1 - Zellen und deren intrazelluläre Produktion von Zytokin gezeigt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig4large.jpg" target="_blank">um</a> die <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54048/54048fig4large.jpg" target="_blank">vie</a>wa größere Version dieser Figur.

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Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

stem-cell-based-engineered-immunity-against-hiv-infection-humanized

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection. 

Serie: Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine cancer models are extremely limited in their diversity and suffer from poor translation to the clinic. To serve as a more physiological preclinical model for immunotherapy studies, this protocol has been developed to evaluate the treatment of human tumors in a mouse reconstituted with a human immune system. This unique protocol demonstrates the development of human immune system (HIS, &#34;humanized&#34;) mice, followed by implantation of a human tumor, either a cell-line derived xenograft (CDX) or a patient derived xenograft (PDX). HIS mice are generated by injecting CD34+ human hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood into neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2R&#947;C-/- NODSIRP&#945;) highly immunodeficient mice that are also capable of accepting a xenogeneic tumor. The importance of the kinetics and characteristics of the human immune system development and tumor implantation is emphasized. Finally, an in-depth evaluation of the tumor microenvironment using flow cytometry is described. In numerous studies using this protocol, it was found that the tumor microenvironment of individual tumors is recapitulated in HIS-PDX mice; &#34;hot&#34; tumors exhibit large immune infiltration while &#34;cold&#34; tumors do not. This model serves as a testing ground for combination immunotherapies for a wide range of human tumors and represents an important tool in the quest for personalized medicine.

This protocol outlines the generation of human immune system (HIS) mice for immuno-oncology studies. Instructions and considerations in the use of this model for testing human immunotherapeutics on human tumors implanted in this model are presented with an emphasis on characterizing the response of the human immune system to the tumor.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

Krebsforschung

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in high demand. With a close genetic and behavioral resemblance to humans, small animals such as the mouse are good candidates for human disease models, through which human-like symptoms and responses can be recapitulated. Further, the mouse genetic background can be altered to accommodate diverse demands. The NOD/SCID/IL2r&#947;null (NSG) mouse is one of the most widely used immunocompromised mouse strains; it allows engraftment with human hematopoietic stem cells and/or human tissues and the subsequent development of a functional human immune system. This is a critical milestone in understanding the prognosis and pathophysiology of human-specific diseases such as HIV/AIDS and aiding the search for a cure. Herein, we report a detailed protocol for generating a humanized NSG mouse model (hu-NSG) by hematopoietic stem cell transplantation into a radiation-conditioned neonatal NSG mouse. The hu-NSG mouse model shows multi-lineage development of transplanted human stem cells and susceptibility to HIV-1 viral infection. It also recapitulates key biological characteristics in response to combinatorial antiretroviral therapy (cART).

This protocol provides a method to establish humanized mice (hu-NSG) via intrahepatic injection of human hematopoietic stem cells into radiation-conditioned neonatal NSG mice. The hu-NSG mouse is susceptible to HIV infection and combinatorial antiretroviral therapy (cART) and serves as a suitable pathophysiological model for HIV replication and latency investigations.

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of their morbidity. The liver immunopathology caused by HIV-1 remains elusive. Small xenograft animal models with human hepatocytes and human immune system can recapitulate the human biology of the disease&#39;s pathogenesis. Herein, a protocol is described to establish a dual humanized mouse model through human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) transplantation, to study liver immunopathology as observed in HIV-infected patients. To achieve dual reconstitution, male TK-NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) mice are intraperitoneally injected with ganciclovir (GCV) doses to eliminate mouse transgenic liver cells, and with treosulfan for nonmyeloablative conditioning, both of which facilitate human hepatocyte (HEP) engraftment and human immune system (HIS) development. Human albumin (ALB) levels are evaluated for liver engraftment, and the presence of human immune cells in blood detected by flow cytometry confirms the establishment of human immune system. The model developed using the protocol described here resembles multiple components of liver damage from HIV-1 infection. Its establishment could prove to be essential for studies of hepatitis virus co-infection and for the evaluation of antiviral and antiretroviral drugs.

This protocol provides a reliable method to establish humanized mice with both human immune system and liver cells. Dual reconstituted immunodeficient mice achieved via intrasplenic injection of human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem cells are susceptible to human immunodeficiency virus-1 infection and recapitulate liver damage as observed in HIV-infected patients.

Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für HIV-assoziierte Leberpathogenese

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical research on infectious diseases. Described here are three models of humanized immunodeficient mice for studying the dynamics of HIV infection. The first is based on the intrahepatic injection of CD34+ hematopoietic stem cells in newborn mice, which allows for the reconstitution of several blood and lymphoid tissue-confined cells, followed by infection with a reference HIV strain. This model allows monitoring for up to 36 weeks post-infection and is hence called the chronic model. The second and third models are referred to as the acute and reactivation models, in which peripheral blood mononuclear cells are intraperitoneally injected in adult mice. In the acute model, cells from a healthy donor are engrafted through the intraperitoneal route, followed by infection with a reference HIV strain. Finally, in the reactivation model, cells from an HIV-infected donor under antiretroviral therapy are engrafted via the intraperitoneal route. In this case, a drug-free environment in the mouse allows for virus reactivation and an increase in viral load. The protocols provided here describe the conventional experimental approach for humanized, immunodeficient mouse models of HIV infection.

Described here are three experimental approaches for studying the dynamics of HIV infection in humanized mice. The first permits the study of chronic infection events, whereas the two latter allows for the study of acute events after primary infection or viral reactivation.

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes the establishment of a human immune system in adult NOG mice. Here, we explain all the practical steps from isolation of umbilical cord blood derived human CD34+ cells and their subsequent intravenous transplantation into the mice, to the manipulation of the model through HIV infection, combination antiretroviral therapy (cART), and blood sampling. Approximately 75,000 hCD34+ cells are injected intravenously into the mice and the level of human chimerism, also known as humanization, in the peripheral blood is estimated longitudinally for months by flow cytometry. A total of 75,000 hCD34+ cells yields 20%&#8211;50% human CD45+ cells in the peripheral blood. The mice are susceptible to intravaginal infection with HIV and blood can be sampled once weekly for analysis, and twice monthly for extended periods. This protocol describes an assay for quantification of plasma viral load using droplet digital PCR (ddPCR). We show how the mice can be effectively treated with a standard-of-care cART regimen in the diet. The delivery of cART in the form of regular mouse chow is a significant refinement of the experimental model. This model can be used for preclinical analysis of both systemic and topical pre-exposure prophylaxis compounds as well as for testing of novel treatments and HIV cure strategies.

We have developed a protocol for the generation and evaluation of a humanized and human immunodeficiency virus-infected NOG mouse model based on stem cell transplant, intravaginal human immunodeficiency virus exposure, and droplet digital PCR RNA quantification.

Humanisierte NOG-Mäuse für intravaginale HIV-Exposition und Behandlung von HIV-Infektionen

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

Production of Humanized Mouse via Thymic Renal Capsule Grafting, CD34+ Cells Injection, and Cytokine Delivery

Animal models provide a vital translation between in vitro and in vivo biomedical research. Humanized mouse models provide a bridge in the representation of human systems, thereby allowing for a more accurate study of pathogenesis, biomarkers, and many other scientific queries. In this method described, immune-deficient NOD-scid IL2R&#947;null (NSG) mice are implanted with autologous thymus, injected with liver-derived CD34+ cells followed by a series of injected cytokine deliveries. In contrast to other models of a similar nature, the model described here promotes an improved reconstitution of immune cells by delivering cytokines and growth factors via transgenes encoded in AAV8 or pMV101 DNA-based vectors. Moreover, it offers long-term stability with reconstituted mice having an average lifespan of 30 weeks after CD34+ injections. Through this model, we hope to provide a stable and impactful method of studying immunotherapy and human disease in a murine model, thus demonstrating the need for predictive preclinical models.

Production of Humanized Mouse via Thymic Renal Capsule Grafting, CD34+ Cells Injection, and Cytokine Delivery

Humanized mouse models provide a more accurate representation of the human immune microenvironment. This manuscript describes the process in which these models are created through a renal graft of human thymus, injection of human CD34+ cells, and the targeted delivery of human cytokine transgenes to promote CD34+ cell proliferation and differentiation.

Animal models provide a vital translation between in vitro and in vivo biomedical research. Humanized mouse models provide a bridge in the representation ...

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. Although combinational antiretroviral therapy (cART) has been successful in suppressing viral replication, it cannot completely eradicate the reservoir from HIV-infected individuals. A safe and effective cure strategy for HIV infection will require multipronged methods, and therefore the advancements of animal models for HIV-1 infection are pivotal for the development of HIV cure research. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection. The humanized mouse model can be infected by HIV-1 and viral replication can be controlled with cART regimens. Moreover, cART interruption results in a prompt viral rebound in humanized mice. However, administration of cART to the animal can be ineffective, difficult, or toxic, and many clinically relevant cART regimens are unable to be optimally utilized. Along with being potentially unsafe for researchers, administration of cART by a commonly used intensive daily injection procedure induces stress by physical restraint of the animal. The novel oral cART method to treat HIV-1 infected humanized mice described in this article resulted in suppression of viremia below the detection level, increased rate of CD4+ restoration, and improved overall health in HIV-1 infected humanized mice.

This protocol describes a novel method to deliver oral combinational antiretroviral drugs that successfully suppress HIV-1 RNA replication in humanized mice.

Orale kombinierte antiretrovirale Behandlung bei HIV-1-infizierten humanisierten Mäusen

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

Source: Lanis, J. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. All procedures involving animal ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunotherapy

Model Development and Disease Study

Developing a Humanized Mouse Model with Human Liver Cells and Immune Cells

Source: Dagur, R. S. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58645">Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
This video demonstrates a method for generating a dual humanized mouse model with a human immune system and liver cells. It involves transplanting human liver cells and hematopoietic stem and progenitor cells into a transgenic immunodeficient mouse via intrasplenic injection, leading to engraftment of liver cells and development of human immune cells.

Entwicklung eines humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leberzellen und Immunzellen

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

Zusammenfassung

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