עבודה זו נתמכה על בנדיבות על ידי המכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NIH / NINDS) מענק 1R01NS086981 וקרן הילטון קונרד נ. אנו מודים לד&quot;ר לורן בן-טולילה וד&quot;ר מתיו Schibler על עזרתם שלא יסולא בפז עם מיקרוסקופיה confocal. אנו מודים לאלה שתרמו בפורום CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). אנחנו במיוחד להודות לד&quot;ר קרל דייזרות עבור פתיחת המעבדה שלו ללמד טכניקה המרתק הזה. המחברים מודים על התמיכה הנדיבה של מינהל המחקר הרפואי למיפוי המוח, קרן תמיכה למיפוי המוח, פירסון-לאבלייס קרן, קרן Ahmanson, קרן הצדקה של חברות קפיטל גרופ, וויליאם מ ולינדה ר Dietel פילנתרופית קרן, קרן Northstar . מחקר מדווח בפרסום זה גם מומן בחלקו על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר על ידי משרד המנהל של האומההמכונים אל הבריאות תחת מספרי הפרס C06RR012169, C06RR015431, ו S10OD011939. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.

כל הניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הנחיות. Thy1-YFP, PLP-EGFP ו- PV-tdTomato עכברים ששימשו בניסויים אלה, אבל כל בעכברים המבטאים חלבוני ניאון ניתן לפנות בהצלחה צילמו. 1. רקמות הכנה זהירות: Paraformaldehyde (PFA) ו acrylamide רעילים מגרים. בצע ניסויים ניצול ריאגנטים אלה במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החיה בתא המתת חסד עם ~ 1 מ&quot;ל של isoflurane עד הנשימה נפסקת (~ 2 - 3 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משאבת peristaltic מוגדר ~ 5 מ&quot;ל / דקה כדי intracardially perfuse את העכבר עם פתרון זלוף (טבלה 1) ב 4 ° C עד דם מנוקה מן הרקמות (5 - 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את perfusate לפתרון מקבע (טבלה 1)ב 4 מעלות צלזיוס עד צוואר וזנב החמירו משמעותית (5 - 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיום זלוף לערוף את החיה. בזהירות לנתח את המוח מהגולגולת על ידי הסרה הראשונה רקמת החיבור המקיפה את הגולגולת ואז הסרת עצם מפני שטח הגחון של הגולגולת מרים את המוח (איור 1 א), כמתואר 20. הערה: תן טיפול מיוחד להסרת עצם שמסביב אונות flocculonodular של המוח הקטן ואת נורות חוש הריח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את חוט השדרה של עמוד השדרה על ידי הכנסת הקצה בעדינות של מספריים בסדר, חדו בין חוט השדרה ואת עמוד השדרה וחיתוך מגזרי עמוד השדרה הבודד משם, כמתואר 21. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect המוח על ידי הצבתו במטריצה ​​במוח העכבר פלסטיק חיתוך לאורך קו האמצע עם להב מטריקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כל חצי הכדור וחוט השדרה להפריד צנטריפוגה 50 מ&quot;ל גיגיתes עם ~ 40 מ&quot;ל של תמיסת הידרוג&#39;ל (טבלה 1). מכריכה קדימה בשלב זה את הצינורות עם רדיד אלומיניום על מנת להגן על fluorophores במהלך כל הצעדים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצינור המכיל את הדוגמא הידרוג&#39;ל ב 4 ° C עם רעד עדין (~ 30 סל&quot;ד) למשך 7 ימים. </li></ol> 2. פילמור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל ~ 25 מ&quot;ל של הידרוג&#39;ל, שמירה על מדגם ו ~ 25 מ&quot;ל של הידרוג&#39;ל בצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deoxygenate המדגם על ידי הסרת מכסה והצבת צינור צנטריפוגות בצנצנת ייבוש וחיבור צנצנת ואקום. החלת את הוואקום במשך 10 דקות לפחות להתיר גזים מומסים לצאת בועות פתרון וצורה. נער בעדינות כדי לסלק את הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הוואקום בצנצנת הייבוש בגז חנקן 100% לעומת 2 - 3 דקות. לאחר לחץ המשווה (פעם בראש צנצנת הייבוש ניתן לפתוח), במהירות מכסה את הצינור כדי למנוע החידוש של חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פּוֹלִימֵרize הידרוג על ידי הנחת צינור עם מדגם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות עד פילמור הושלמה. הידרוג&#39;ל polymerized ייקח על (איור 1b) דמוי ג&#39;ל עקבי. הערה: כמות קטנה של הידרוג&#39;ל unpolymerized בראש מקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במרית להסיר את מדגם polymerized מצינור צנטריפוגות, ואז לחתוך את הידרוג&#39;ל העודף מן המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הידרוג&#39;ל הנותרים על ידי הצבת המדגם על מוך חינם לנגב ומשפשף בעדינות לגלגל את הרקמה על זה, והותיר אחריו רק שכבה דקה של הידרוג&#39;ל polymerized על המדגם. </li></ol> 3. הסרת שומנים הערה: רקמת פינה ליפידים הוא שברירי, להישמר מהם. השתמש מסננת תא כאשר רוקנה את הצינור כדי למנוע אובדן של מדגם. כמו כן, המדגם יתנפח לאורך כל תהליך הסליקה, לעומת זאת, נפיחות יכולה להיות הפוך במהלך תהליך ההתאמה מקדם השביר. זהירות: Sodiאממ סולפט dodecyl (SDS) וחומצה בורה הם מגרים. בצע ניסויים ניצול אותם במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות ומשקפי מגן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מדגם מפולמר צינור צנטריפוגות נקי 50 מ&quot;ל ולהוסיף 45 מ&quot;ל של סליקה חיץ (טבלה 1). לדגור על 45 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ 30 סל&quot;ד). שינוי למאגר יומי 7 ימים ראשונים על ידי ניגר למאגר הסליקה בשימוש לתוך פסולת כימית והוספה ~ 45 מיליליטר של חיץ סליקה טרי. שמור את צינורות צנטריפוגה המכילים הדגימות המכוסות בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים הראשוניים, דגירת המדגם ב 40 מעלות צלזיוס ו חיץ חליפי סליקה כל 2 - 3 ימים. המשך סליקה עד שכל השומנים הם solubilized ורקמות מגיעות השקיפות (איור 1 ג &#39;). זה יהיה 4 - 6 שבועות למשך חצי כדור במוח עכבר 2 - 4 שבועות עבור חוט שדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רקמות מנוקות, להעבירהמדגם לצינור צנטריפוגות חדשות 50 מ&quot;ל ולשטוף 4 פעמים ב PBST (טבלה 1) ב 40 ° C עם רעד עדין (~ 30 סל&quot;ד) מעל 24 שעות כדי להסיר SDS שיורית. </li></ol> 4. מולקולרי מכתים זהירות: 4 &#39;, 6-Diamidino-2-Phenylindole dihydrochloride (DAPI) הוא חומר מגרה וכל ניסויים ניצול זה צריך להתבצע במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל נקי ומלא עם 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI ב 1x PBST, pH 7.5. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות. שמור את צינורות צנטריפוגה המכילים הדגימות המכוסות בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב PBST ב RT במשך 6 שעות / לשטוף לפחות. </li></ol> 5. התאמת מקדם השבירה זהירות: 2,2&#39;-Thiodiethanol (TDE) הוא חומר מגרה וכל ניסויים ניצול זה shולד להתבצע במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל נקי ומלא עם 30% (v / v) TDE ב PBS 1x, pH 7.5. לדגור על 40 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ סל&quot;ד 30) למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת 30% TDE עם 63% (v / v) TDE ב 1x PBS, pH 7.5. לדגור על 40 מעלות צלזיוס עם רעד עדין למשך 24 שעות. הערה: המדגם יתכווץ חזרה לגודל כ מקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על משטח שטוח ונקי לגלגל חתיכת דבק לשימוש חוזר לגליל בקוטר אחיד רק מעט גדול יותר בעובי של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הגליל הדבק לשימוש החוזר במעגל פתוח (~ 25 מ&quot;מ קוטר פנימי עם פתח קטן בחלק העליון) על צלחת תחתית זכוכית 40 מ&quot;מ. אם תיקונים צריכים להיעשות, להסיר את הגליל מהכוס לחתוך עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טיפ p1000 פיפטה ליצור חותם בין דבק לשימוש חוזר וזכוכית ידימגלגל אותו סביב השפה החיצונית של הגליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום ~ 100 μl 63% TDE על צלחת הזכוכית להפיץ מסביב כדי לכסות את משטח הזכוכית בתוך המעגל של דבק לשימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, מניח את המדגם בזהירות באמצע המעגל, נזהר שלא ליצור בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עוד 100 μl של TDE 63% ישירות על גבי המדגם, ומייד למקם כוס כיסוי עגולה 40 מ&quot;מ מעל הדבק לשימוש החוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות האינדקס, אמצע קמיצה של שתי הידיים, לחצו בזהירות מסביב למעגל עד הזכוכית המכסה יצר קשר עם המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מביאים את התבשיל בתחתית הכוס בתנוחה זקופה נחה על פני השטח, ולאחר מכן להוסיף 63% TDE עם טפטפת עד שהתמיסה תגיע פתח קטן בראש. השתמש חינם מוך לנגב להתנגב קצה פיפטה כך שהפתרון לא לטפטף על זכוכית. כדי למנוע בועות בתא, לא לרוקן את פיפטה כל הדרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפתח הקטן, להוסיף אלסטומר סיליקון לצרף המעגל ליצור תא סגור. מתן 5 דקות עבור לו להתייבש לפני ההדמיה. </li></ol> מיקרוסקופי 6. זהירות: הלייזרים המשמשים confocal, תאורת מטוס בודדת במיקרוסקופ גיליון האור הם מאוד חזקה ויכולה לגרום לעיוורון. כל ניסויי ניצול לייזרים צריכים להתבצע לאחר אימונים רבים בזהירות רבה ומשקפי מגן מתאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא הדמיה עם המדגם בתוך על הבמה של מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלה של חומרים). כדי להפעיל את הלייזר עירור ארגון, לחץ על הכרטיסייה תצורת בחלק העליון של התוכנית ולאחר מכן בסמל לייזר. סמן את התיבה לצד ארגון כוח לייזר ולעבור סולם שקופית 30%. שים את המצביע להתחמם לאט למצב שנבחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לכרטיסייה לרכוש בחלק העליון. בתיבת הדו הגדולה &quot;הגדרות נתיב קרן &amp;# 34; ללכת העומס / לשמור הגדרת תיבה ובחר את תפריט הנפתח כדי לבחור ערוץ גל מתאים לתמונת YFP (527 ננומטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר יעדים מתאימים הדמיה ידי איתור הקישור האדום שכותרתו &quot;מטרה: אובייקט נוכחי&quot; תחת תיבת גדרות ערוץ. לחיצה על הכרטיסייה פותחת את כל המטרות הזמינות ומבחר באופן אוטומטי לסובב את הצריח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מטרות (למשל., 10X) עם מרחק עבודה גדולה (יותר מעובי של הרקמות להיות צלמו, למשל, 11 מ&quot;מ) וכן מספרי צמצם גדול (למשל., 0.3) על מנת למקסם רזולוציית תמונת המטוס ולמזער עובי סעיף אופטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על העמוד השמאלי של תפריטים נפתחים, לפתוח את &quot;XY: רזולוציה&quot; החלון להגדיר מטריצת רכישה, בשם &quot;תבנית&quot;, 1,024 x 1,024 או ערך מתאים עבור מגבלת רזולוציה לרוחב של המטרה. הגדר את גורם זום נמוך ככל האפשר (למשל., 1.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו החלון, להגדיר ממוצע 8 קו 1 פרמטרים ממוצעים מסגרת ידי הטלה למטה בתפריטים שכותרתו בנפרד בהתאם. השתמש בערכים גדולים עבור יחס אות לרעש גבוה וערכים קטנים לרכישה מהירה. הערה: 8 ממוצעי קו ממוצע מסגרת 1 ירכשו תמונות באיכות גבוהה של אונה במוח עכבר בתוך כ -4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את המדגם באמצעות הפקדים הבמה. לאחר שדה נציג גלוי, להגדיר את הרווח לקזז. הערה: הרווח לקזז ישתנה מבוסס במידה מהותית על סוג הרקמה, fluorophores, ו / או להיות הדמית תכונה אנטומית. עבור YFP, להגדיר ערכים מ 760 ל 780 טוב רווח ומתוך -1.0 ל -1.5 עבור לקזז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;סריקת אריח&quot; ובחר את גבולות האזור של עניין. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של Z- מחסנית להירכש. הגדר את העובי של הסעיף האופטי המבוסס על מגבלת רזולוצית סעיף האופטית של המטרה. הערה: המטרה שלמגבלת רזולוצית סעיף אופטית מוגדרת בראש ובראשונה על ידי הצמצם המספרי שלה. רוב תוכנות מיקרוסקופ שליטה תחשבנה מתאים ערך באופן אוטומטי עבור המטרה בשימוש. עבור מטרת 10X עם צמצם מספרי של 0.3 זה יהיה כ 11 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הרכישה. הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות בהגדלה גבוהה יותר מאזורים ספציפיים של עניין. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+histology+in+the+pursuit+of+connectomes.">Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.</a> J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).</li><li>MacKenzie-Graham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimodal,+multidimensional+atlas+of+the+C57BL/6J+mouse+brain.">A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain.</a> J Anat. 204, 93-102 (2004).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy.">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Theer, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+fundamental+imaging-depth+limit+in+two-photon+microscopy.">On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy.">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> Neuroimage. 101, 625-632 (2014).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Sci Rep. 5, 9808 (2015).</li><li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li><li>Parra, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+brain+expressing+YFP.">Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP.</a> J Vis Exp. (67), e3848 (2012).</li><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> J Viz Exp. (96), e52580 (2015).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

סליקה פסיבית של רקמות מוטבעות הידרוג&#39;ל (CLARITY הפסיבי) היא שיטה פשוטה וזולה לניקוי חתיכות גדולות של רקמה. גישה זו אינה דורשת ציוד ייעודי וניתן לבצעו בקלות שייקר בקרת טמפרטורה. במשך תקופה של כמה שבועות, אפילו גדולים, רקמות myelinated ביותר, כגון המוח כולו או בחוט השדרה, יהפוך שקוף ומתאים מיקרוסקופיה. למרות דוח זה התמקד סליקת רקמות CNS, ניתן ליישם CLARITY הפסיבית לכל רקמה. את נקודות החוזק והחולשה היחסיות של טכניקות סליקה אופטיות נדונו בעבר בספרות 13,17,22,, אבל הם הכי ערוכים בצורה ברורה 23. CLARITY פסיבי הוא גם מתאים בניסויים שבהם מספר גדול של דגימות מנוקים בו זמנית שחזור היא בעלת חשיבות רבה. השימוש הידרוג לספק תמיכה נוספת לרקמה מקלה מרובי חיטוט של הרקמה. בדו&quot;ח זה, לצבוע משקל מולקולרי קטן, DAPI, הודגם, אך סבבים רבים של נוגדן חיטוט גם הם אפשריים עם גישה זו. הגישה המתוארת לעיל חורג מן הפרוטוקול שפורסם בעבר שלנו 15 בעוד כמה דרכים משמעותיות. ראשית, הגישה הנוכחית, הדגימות לא היו perfused intracardially עם הידרוג&#39;ל. זה היה בשל העובדה כי הידרוג&#39;ל יכול בטרם עת לפלמר בצינור ומחטים של מנגנון זלוף, שמוביל perfusions שלם וסליקה עקבי. דוגר רקמות קבועות paraformaldehyde ב הידרוג&#39;ל למשך 7 ימים עולה בקנה אחד עם פרוטוקול CLARITY המקורי 14, אם כי דגירת יום 1 משמשת 1 - 3 מ&quot;מ סעיפי רקמה עבים טכניקת CLARITY הפסיבית (PACT) 17. שנית, גישה זו מבצעת הסרת שומנים בטמפרטורה גבוהה במקצת כי שדווח בעבר 15-17. טמפרטורה גבוההדואר מאיצה הסרת שומנים, אבל חייבת להיות מאוזנת מול האפשרות של הפסד קטסטרופלי של שלמות רקמות (התכה). על ידי הגדלת טמפרטורת הדגירה ב -8 מעלות צלזיוס (45 מעלות צלזיוס) במשך 7 ימים ולאחר מכן על ידי 3 ° C (40 ° C) לשארית את תהליך הסרת השומנים, סליקת רקמות מואצת, אך ללא הסיכון בו הזמני של אובדן שלמות רקמות. זו עליית הטמפרטורה עולה בקנה אחד עם טמפרטורות דיווחו במהלך סליקת רקמות Electrophoretic (ETC) בפרוטוקול CLARITY המקורי (50 ° C) 14. יתר על כן, אין ירידה בעוצמת fluorophores הביע transgenically ולא ירידה מכתים DAPI נצפתה. הרחקת חמצן הוא צעד חשוב ביצירה של הידרוג&#39;ל. הידרוג יכול לפלמר בנוכחות חמצן מומס הפתרון הידרוג&#39;ל, אך בידינו שיעור ושלמות פילמור היה הרבה יותר משתנה ללא הרחקת חמצן. אם hydrogel לא לפלמר, הסיבה הנפוצה ביותר היא בנוכחות חמצן הידרוג&#39;ל. תהליך הסליקה האופטי להפליא קל ליישם, אולם, מיקרוסקופיה העוקבת עלולה להיות מסובכת למדי. בעלת חשיבות מכרעת הם המטרות נהגו תמונת הרקמה. מרחק העבודה של אובייקטיבי מגדיר את העומק שזה יכול תמונה לתוך דגימת רקמה. אובייקטיבי עם מרחק עבודה של 2 מ&quot;מ יכול רק תמונה 2 מ&quot;מ לתוך מדגם, ולכן את מרחק העבודה של מטרה צריכה להיות גדולה יותר בעובי של המדגם כדי תצלם אותה לחלוטין. באופן דומה, הצמצם המספרי של אובייקטיבי מציב גבול לגודל של תכונות שהוא יכול לפתור הן-מטוס ואת העובי של חלקים אופטיים שזה יכול לרכוש באופן משמעותי. מטוס סלקטיבי מיקרוסקופי תאורה (SPIM) ואת גיליון האור המיקרוסקופי (LSM) יכולים להתגבר על המגבלה על עובי סעיף אופטי ידי הטבע של ההארה, אך מייקרו אלהמתמודדת אינה זמינה באופן נרחב. צמצם מספרי גבוה, מטרות מרחק עבודה גדולות הם נדירים ויקרים, אבל נחוצים הדמיה באיכות גבוהה ממקטעי פינה אופטית גדולים. לאחר התמונות נרכשו, הם לעתים קרובות מאוד גדולים, החלו מכמה מאה MB עבור ברזולוציה נמוכה (הוא בתוך מטוס ואת z-הכיוון) תמונה כמה TB עבור תמונה ברזולוציה גבוהה שנאספה על LSM. המחשבים המשמשים לניתוח תמונה דורשים לא רק מידה רבה של אחסון, אבל בכמויות גדולות של זיכרון גישה אקראית (RAM) עבור עיבוד תמונה. חבילות תוכנה מתאימות של ניתוח כרכי תמונה נרחבים שנוקו אופטית כוללות עמירה, Imaris, ו ImageJ 14-16. בין המגבלות של גישה זו, CLARITY הפסיבי דורש יותר זמן כדי לנקות רקמות מאשר גישות סליקה אופטית אחרות. הקטנת הנפח של הרקמה כדי להיות מסומן על ידי זמירה זה או חתך אותו לחתיכות קטנות יותר יכולות אקסלשומני הסרת erate. כמו כן, הפחתת הריכוז של paraformaldehyde הידרוג יהיה ב crosslinking ירידה בתור ולהגדיל את הגודל הנקבובי הידרוג&#39;ל, שמובילות סליקה מהירה יותר 17, אם כי זה עלול להוביל להרחבת רקמות יותר, הנסיינים פרט עשויים לגלות כי זה שווה את ירידת סליקה זְמַן. יתר על כן, בשילוב עם TDE כסולקת, כמות להרחבת רקמות הכוללת עשויה להיות מוגבלת. למרות דוח זה מתאר את השימוש בצבעים משקל מולקולרי קטן, נוגדן חיטוט הוא השלב הבא מאוד טבעי. הנוכחות של הידרוג&#39;ל לא מספקת תמיכה פיזית רק לרקמות הפינה, אלא גם משמשת מכשול עבור חדירת הנוגדנים עמוקה לתוך הרקמה. הקטנת ריכוז acrylamide או ריכוז paraformaldehyde יגדיל את הגודל הנקבובי ב הידרוג&#39;ל, להקל (ובכך מאיץ) נוגדן חדיר 17, אך יש לכך השפעה מזיקה על Tissהרחבת UE. אף על פי כן, נוגדן חיטוט של גושי רקמה ניתן להשיג ב עניין של ימים המוח כולו בעוד כמה שבועות באמצעות ריכוזים acrylamide ו paraformaldehyde המתוארים בדו&quot;ח המקורי 14. טכניקות סליקה אופטיות לאפשר אחד להסתכל עמוק לתוך המוח, לקדם את ההבנה של מבנה המוח ועל תפקודו. כלים החדשים אלה ייאפשרו לחוקרים לחזות המוח ברזולוציות תאיות ומולקולריות, הגדלת הבנתנו המורכבת ביותר על אברים.

The ability to image complete neuroanatomical structures is immensely valuable for understanding the brain in health and disease. Traditionally, 3D imaging has required tissue sectioning to provide the axial resolution and to visualize deep anatomical structures. This approach can produce high-resolution data sets, but requires sophisticated image reconstruction techniques and is very labor intensive. As a result, it has been limited to the imaging of small volumes of tissue1-3. Optical sectioning, on the other hand, is well suited for the creation of high-resolution 3D images of fluorescently labeled tissues. Since optical sectioning is inherently three dimensional, it does not require extensive computation to produce a 3D image volume. However, light scattering and tissue opacity limit the depth at which tissues can be optically sectioned. The depth of imaging is limited to about 150 &#181;m in laser scanning confocal microscopy and to less than 800 &#181;m using two-photon excitation microscopy4-8.
In order to overcome these limitations, several optical clearing techniques have been recently developed and then further refined to permit the deep microscopic imaging of intact tissues. The use of benzyl alcohol and benzyl benzoate (BABB) to render fixed tissues transparent was among one of the earliest approaches9. However, this approach was limited by the quenching of fluorescence in the samples and incomplete clearing of highly myelinated structures10. Refinements of this technique, such as 3D Imaging of Solvent Cleared Organs (3DISCO), have led to very rapid and complete tissue clearing, but still suffer from rapid loss of fluorescent signals, especially yellow fluorescent protein (YFP)10. Water-based clearing solutions, such as Sca/e11 and SeeDB12, preserve fluorescent signals, but do not completely clear highly myelinated tissues. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) is a promising new optical clearing technology that appears to overcome the limitations of previously developed water-based clearing solutions13. In contrast with other optical clearing techniques, Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)14 embeds the brain in a porous matrix that provides structural integrity to proteins, nucleic acids and small molecules, while leaving lipids unbound. The lipids are then removed electrophoretically, culminating in an optically cleared brain that can be easily visualized and equally easily probed using commonly available techniques.
Electrophoretic tissue clearing (ETC) is used to remove lipids from hydrogel embedded tissues in CLARITY, however, ETC can be difficult to implement consistently and tissues subject to electrophoresis can exhibit tissue distortion, browning, loss of fluorescence and antibody reactivity. Passive lipid clearing avoids these limitations, but requires increased clearing times15-17. Passive clearing also permits the clearing of large numbers of samples in parallel, since it is not limited by the number of ETC apparatuses available. Decreasing the concentration of paraformaldehyde and excluding bis-acrylamide from the hydrogel have led to great increases in the speed of clearing at the expense of greater tissue expansion16. Less expensive alternatives to the refractive index matching solution used in the original CLARITY technique have been developed17-19. 2,2'-thiodiethanol (TDE) is an inexpensive and rapid brain clearing agent that reverses some of the tissue expansion that occurs during lipid removal18. This report incorporates passive clearing of hydrogel embedded tissue and the use of TDE as a refractive index matching solution to the original CLARITY technique to produce a highly reproducible and inexpensive protocol for the optical clearing of the mouse central nervous system.

<table><tbody><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>buffers</td></tr><tr><td>32% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-5</td><td>perfusion and hydrogel</td></tr><tr><td>2,2&#039;-thiodiethanol (TDE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782-500G</td><td>refractive index matching solution</td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>2% bis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>VA-044 initiator</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>clearing buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>clearing buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>55255-1</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52002-100G</td><td>preservative</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500G</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>perfusion</td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Fisher</td><td>BP360-500</td><td>perfusion</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>nuclear stain</td></tr><tr><td>99.9% isoflurane</td><td>Phoenix</td><td>57319-559-06</td><td>anesthetic</td></tr><tr><td>Hydrocholoric acid</td><td>Fisher</td><td>A1445-500</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>Willco dishes</td></tr><tr><td>Reusable adhesive</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>Silicon elastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>Lint-free wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>Mouse brain matrix</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>sectioning tissue</td></tr><tr><td>Matrix blades</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>sectioning tissue</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>pefusion</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>microscopy</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Leica</td><td>LAS AF</td><td>microscopy</td></tr></tbody></table>

optical clearing of the mouse central nervous system using passive clarity

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

לדמיין את המבנה הארגוני של המוח הוא קריטי להבנת איך מורפולוגיה וקישוריות להשפיע על תפקוד המוח בריאות ומחלות. טכניקות סליקה אופטיות מאפשרות אוכלוסיות תאי תמונת 3D ברקמות ללא פגע, מה שמאפשר לנו ללמוד מורפולוגיה וקישוריות cohesively. עכברים המבטאים חלבוני ניאון מונע על ידי יזמים ספציפיים עבור תת-אוכלוסיות של תאים להתיר אחת ניסו להפריד דפוס המורכב של קישוריות עצבית במוח. עכברים מהונדסים Thy1-YFP נעשה שימוש נרחב בספרות הסליקה האופטית כי עכברים אלה מבטאים YFP משנה של נוירונים הקרנה הנמצאים בקליפת המוח ואת ההיפוקמפוס, כמו גם מבנים אחרים במוח (איור 2 א &amp; B). יתר על כן, YFP + נוירונים V שכבת קליפת המוח להקרין דרך מערכת corticospinal בשנות הכבל Pinal (איור 2 ג &amp; D), מה שהופך אותם מאוד שימושי בהערכת ההשפעה של עלבון axonal ו / או פגיעה בחוט השדרה על נוירונים בקליפת המוח 15. באמצעות השימוש במיקרוסקופ confocal חתך אופטי של רקמות פינה אופטית אחד יכול להעריך הבדלים בקלות בצפיפות עצבית ברחבי מבנים אנטומיים גדולים. בנוסף עכברים מהונדסים Thy1-YFP, כל מספר של עכברים מהונדסים ניתן הדמיה. עכברים מהונדסים PLP-EGFP מפורשות משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ב oligodendrocytes הבוגרת לבטא חלבון proteolipid (PLP) בכל רחבי המוח וחוט שדרה (איור 3 א). עכברים מהונדס PV-tdTomato להביע tdTomato משנה של parvalbumin (PV) להביע interneurons במוח הקטן, הסטריאטום ובהיפוקמפוס (איור 3 ב). גם בעכברים כי אינו מבטא transgenes פלורסנט, צבעי ניאון משקל מולקולרי קטנים, כגון DAPI, יכול לנטרל בקלות לתוך רקמות מוטבעות הידרוג&#39;ל ולהתיר בהערכה לגרעיני תא המוח (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig1.jpg" /> איור 1:. בשלבים שונים של מוח סליקת תצלום של Thy1-YFP + עכבר מוח שהוסר מהגולגולת (א). תצלום של האונה במוח הידרוג&#39;ל-מוטבע Thy1-YFP + עכבר (ב). תצלום של אונה במוח Thy1-YFP + עכבר לאחר הסרת שומנים (ג). ברי סולם הם 5 מ&quot;מ בפנל. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig2.jpg" /> איור 2: Thy1-YFP ביטוי המוחnd בחוט השדרה. Thy1-YFP + נוירונים בקליפת המוח ואת ההיפוקמפוס צילמו בהגדלה 5X ושיחזר ב 3D (א). היטל העוצמה המקסימלית של ערימה תמונה 10X של קליפת המוח הוכחת arborization הדנדריטים של נוירונים פירמידליים V שכבת קליפת המוח (ב). Thy1-YFP ביטוי בתוך חוט השדרה הצווארי החזי שלמים צילמו בהגדלה 5X ושיחזר ב -3 D (ג). היטל עצמה המקסימלית של ערימת תמונת 10X של חוט השדרה הוכחת אקסונים פרט (ד). ברי סולם הם 1 מ&quot;מ (א), 100 מיקרומטר (ב), 2 מ&quot;מ (ג), ו- 100 מיקרומטר (ד). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig3.jpg" /> איור 3: PLP-EGFP ואת הביטוי PV-tdTomato במוח. </strong&gt; ביטוי PLP-EGFP בחלק המוח העטרה בעובי 2 מ&quot;מ צילמו בהגדלה 5X (א). תמונה זו היא כ 1 מ&quot;מ מפני השטח של קטע הרקמה. ביטוי PV-tdTomato במוח הקטן של חצי כדור ארץ מוחות שלם צלם בהגדלה 10X (ב). תמונה זו כ 0.5 מ&quot;מ מהמטוס midsagittal. ברי סולם הם 1 מ&quot;מ (א) ו- 250 מיקרומטר (ב). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig4.jpg" /> איור 4: DAPI מכתים בביטוי DAPI המוח במוח הקטן של חצי כדור ארץ מוחות שלם צלם בהגדלת 5X.. הדימוי הוא כ 1 מ&quot;מ ממטוס midsagittal. הבלעה מראה את רמת הפירוט גלוי בעומק הדמיה זו בהגדלה 10X. סולם סורגיםמחדש 250 מיקרומטר הלוח הראשי ו -50 מיקרומטר הבלעה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54025/54025fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בַּלָם </td><td> כִּימִי </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> פתרון זלוף </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> מלוח 10x שנאגר פוספט </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> נתרן חנקתי </td><td> 0.5% w / v </td></tr><tr><td></td><td> הפרין </td><td> 10 U / ml </td></tr><tr><td> פתרון מקבע </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> מלוח 10x שנאגר פוספט </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Paraformaldehyדה </td><td> נ 4% / v </td></tr><tr><td> פתרון הידרוג&#39;ל </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> מלוח 10x שנאגר פוספט </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> paraformaldehyde </td><td> נ 4% / v </td></tr><tr><td></td><td> acrylamide </td><td> נ 4% / v </td></tr><tr><td></td><td> Bis-acrylamide </td><td> 0.05% v / v </td></tr><tr><td></td><td> יוזם VA-044 </td><td> 0.25% w / v </td></tr><tr><td> חיץ סליקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> חומצה בורית </td><td> 200 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> סולפט dodecyl נתרן </td><td> 4% w / v </td></tr><tr><td> PBST </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> מלוח 10x שנאגר פוספט </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> טריטון X-100 </td><td> 0.1% v / v </td></tr><tr><td></td><td> אזיד הנתרן </td><td> 0.1% w / v </td></tr></tbody></table> טבלה 1: רשימת חוצצים ופתרונות.

Watch this Scientific Journal Video about Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY at JoVE.com

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

optical-clearing-mouse-central-nervous-system-using-passive

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Views.  University of California, Los Angeles. Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Video: Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Immunology and Infection

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Biology

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...