This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

1. Herstellung von Bakterien- und Peptidoglycan Substrate Hinweis: Ganzzellbakterien Substrate und gereinigte Peptidoglykanen verwendet werden als Enzymsubstrate sowohl in der Mikrodia Diffusionstest und dem Farbstoff-Freisetzungstest. Diese Substrate erfordern Vorbereitung vor der Enzymreaktionen durchzuführen. Das folgende Protokoll beschreibt ihre Herstellung. <ol><li> Whole bakterielle Zell Substrat <ol><li> Produzieren Bakterienzellsubstrat durch Animpfen mit 500 ml Nährlösung mit einer 2 ml Übernachtkultur von Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection, ATCC 23857). bei 30 ° C inkubieren unter Schütteln (125 rpm), bis die Kultur eine exponentielle Wachstumsphase erreicht, als eine schnelle Wachstumsphase definiert, in der Verdoppelung der Bakterienkultur resultiert. Für die Kultivierung von Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), verwenden Nährbrühe als Wachstumsmedium bei 37 ° C unter Schütteln (125 rpm). </li&gt; <li> Hitze töten jede Kultur durch 10 min Autoklavieren bei 121 ° C unter 3 atm Druck. </li><li> Ernten Sie die Hitze abgetötete Bakterien-Substrat durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g. Waschen Sie das Pellet dreimal mit Typ 1 Wasser und Resuspendieren in einer minimalen Menge Wasser. In dieser Studie unterbrechen die Substrate in 1200 ul. </li><li> Aliquot 300 ul der Bakterienzellsubstrate zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und lagern bei 20 ° C. </li></ol></li><li> Gereinigtes Peptidoglycan Substrat <ol><li> Reinige Peptidoglycan aus dem Zielsubstrat Bakterium 7-10 oder zu erwerben , von einem Anbieter (siehe Materialien und Geräte Tabelle). Reinige rohe peptidoglycan Präparate aus Zubehörzellwandpolymere. </li></ol></li></ol> 2. Qualitative Mikrodia Diffusionstest [Geändert von Lachica, et al. 11] Hinweis: Der Mikroobjektdiffusionsassay istein qualitatives Verfahren zur in einer Probe die Anwesenheit von antimikrobiellen Enzym zu detektieren. Da das Enzym durch eine Agarose-Matrix enthält Substrat diffundiert, entwickelt sich eine Zone von Clearing als das Enzym das Substrat hydrolisiert. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Leistung des Mikroobjektdiffusionsassay für qualitativ die Anwesenheit von Protein antimikrobiellen Mitteln zu detektieren. <ol><li> Bestimmung der Konzentration des antimikrobiellen Enzym zu evaluierenden eine Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay Kit nach Herstellerprotokoll. </li><li> Verwenden phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Enzympuffer; jedoch empirisch den Puffer angemessen für das jeweilige Enzym bestimmen. </li><li> Durchführen einer seriellen Verdünnung der antimikrobiellen Enzym Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) als Reaktionspuffer. Die serielle Verdünnung in diesen Mikrodia Diffusions Assays verwendet produziert endgültigen Testproteinmassen von 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 &amp; mgr; g und 10 ug pro Reaktionsvolumen. </li><li> Dispense Proteinmassen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Proteinmengen bis 20 &amp; mgr; l unter Verwendung von PBS in Vorbereitung für das Hinzufügen Reaktionsvertiefungen zu Mikrodia. </li><li> Machen Sie eine 0,5% Agarose-Lösung durch Auflösen von 0,25 g Agarose in 50 ml PBS. Die Lösung wird zum Sieden, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Bestimmen Sie Wasser während des Schmelzprozesses durch Gewicht verloren und zu der Lösung zurück. </li><li> Werden 50 ul 10% Natriumazid in Wasser zu der Agarose-Lösung und Einstellen der Temperatur der Lösung auf 50 ° C in einem Wasserbad. Das Natriumazid zugegeben während der Inkubation des Mikroobjektdiffusionsassay bakterielles Wachstum kontaminierender zu hemmen. Wenn lebende Zellen als Substrat verwendet werden, lassen Sie das Natriumazid aus der Agarose-Lösung. </li><li> Auftauen durch Hitze abgetötete Bakterien Substrat auf Eis. </li><li> Re-suspendieren des bakteriellen Substrat in 12 ml der Agarose-Lösung auf etwa die Trübung einer 2,0 McF übereinarland Äquivalenz - Standard (siehe Materialien Tabelle). Vergleichen Sie die Trübungen der Lösungen durch eine schwarze Linie auf weißem Hintergrund durch die Lösungen zu visualisieren, das Hinzufügen bakterielle Substrat zu dem Agarose, bis die ungefähre Trübung erreicht wird. </li><li> Pipettieren sofort 3 ml der Agarose-Substratlösung zu jedem Mikroobjekt (25 x 75 x 1 mm 3). </li><li> Nachdem die Objektträger zu verfestigen, Punsch drei Brunnen in der Agarose-Substratschicht jedes Mikrodia eines Korkbohrers (4,8 mm Durchmesser) verwenden. In 20 ul jeder eingestellten Protein serielle Verdünnung auf ihre jeweiligen Vertiefungen. </li><li> Verwenden PBS (20 ul) oder Rinderserumalbumin (5 ug in 20 ul PBS) in einer negativen Kontrollvertiefung. Verwenden bekannt bakteriolytischen Enzyme geeignet für das Substrat, beispielsweise Lysozym, als eine positive Kontrolle. </li><li> Inkubieren der Objektträger in einer feuchten Kammer bei 37 ° C oder die optimale Aktivierungstemperatur des Enzyms. Die Länge der Inkubation ist abhängig von der Konzentration undspezifische Aktivität des antimikrobiellen Enzyms. Eine typische Reaktionszeit ist über Nacht (ca. 16 h). </li><li> Nach der Inkubation beobachten die Folien unter indirektem Licht und die Aufnahmen des Entwicklungs Assay eine digitale Spiegelreflexkamera mit einem 60-mm-Objektiv mit einer Brennweite von ca. 30 cm verwendet wird. Anmerkung: Die enzymatische Aktivität des Proteins antimikrobielle für das gegebene Substrat wird mit der Entwicklung einer klaren Zone der Hydrolyse korreliert, die um das Bohrloch bildet, wie das Enzym in die Agarose diffundiert. </li><li> Um die enzymatische Aktivität zu qualifizieren, beachten Sie die Größen der Zonen, die gut um jeden bilden. Hohe enzymatische Aktivität bezieht sich qualitativ auf eine größere Zone, während niedrige enzymatische Aktivität qualitativ zu einem kleineren Bereich bezieht. </li></ol> 3. Substrat Beschriften - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Geändert von Zhou 12] Anmerkung: In dem Farbstoff-Freisetzungsassay ist das Substrat kovalent linked REMAZOL Brillantblau R-Farbstoff. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von gefärbten Enzymsubstrate. <ol><li> Machen Sie eine 250 mM Natriumhydroxid (NaOH) Lösung durch Auflösen von 1 g NaOH in 99 ml Typ I Wasser werden zur Herstellung einer 200 mM Remazol Farbstoff Brillantblau R (RBB) Lösung eingesetzt. </li><li> Machen Sie eine 200 mM RBB-Lösung durch Auflösen von 1,25 g RBB in 98,75 ml ± 1 ml einer frischen 250 mM NaOH-Lösung (Schritt 3.1). </li><li> Hitze abgetöteten Bakterienzellen bei einer Konzentration von 0,5 g Naßgewicht in 30 ml RBB Lösung Re-suspendieren. Für gereinigte Peptidoglycan, resuspendieren die Peptidoglycan in einer Konzentration von 0,3 g Naßgewicht in 30 ml RBB-Lösung. </li><li> Inkubieren des Reaktionsgemisches in einem Erlenmeyerkolben auf einer rotierenden Plattform für 6 h bei 37 ° C unter vorsichtigem Mischen. </li><li> Übertragen das Reaktionsgemisch auf eine 4 &amp; deg; C-Inkubator, und Inkubation für weitere 12 h unter vorsichtigem Mischen. </li><li> Nach der Inkubation ernten das gefärbte Substrat durch Zentrifugation bei 3000 · gfür 30 min. Man dekantiert die Farbstofflösung aus dem Substrat Pellets. </li><li> Entfernen nicht-kovalent gebundene lösliche Farbstoff aus der Substrate durch Waschen der farbstoffmarkierten Zellen oder Peptidoglycan wiederholt (etwa 3-5 Waschungen) mit Typ I Wasser, gefolgt von Zentrifugation. Mit jeder Wasserzugabe wieder aussetzen gründlich das Pellet. Hinweis: Wenn Sie nicht gebundenen, löslichen Farbstoff in der Wasserwäsche nach dem Zentrifugieren nicht mehr sichtbar ist. Das Substrat sollte eine zusätzliche Wäsche gegeben werden. Beachten Sie, dass das Substrat blau bleiben wird, während der Überstand der letzten Wäsche klar sein wird. </li><li> Speichern der gefärbten Substrate in einer minimalen Menge Wasser bei -20 ° C suspendiert für die spätere Verwendung. </li></ol> 4. Quantitative Dye-Release-Assay Anmerkung: Während der Farbstoff-Freisetzungsassays, die Hydrolyse von RBB-gefärbtes Substrat in der enzymatischen Reaktion Meldungen Produkte in die Reaktionsüberstand gefärbt. Kolorimetrische Messung der Menge an Farbstoff freigesetzt zeigt die amount der enzymatischen Aktivität, die innerhalb der Probe für ein bestimmtes Enzym. Die quantitative Methode erlaubt den Vergleich verschiedener Enzyme auf Substrate und ermöglicht eine Variation der Umgebungsbedingungen um die enzymatische Reaktion zu beeinflussen (zB Temperatur, Salzgehalt und pH - Wert). Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Leistung des Farbstoff-Freisetzungsassay zur quantitativen Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Protein antimikrobiellen Mitteln zu detektieren. <ol><li> Testvorbereitung Farbstoff-Freisetzung <ol><li> Erlauben es dem gefrorenen gefärbten Substrates auf Raumtemperatur zurückkehren und zweimal mit Assaypuffer (PBS) waschen, die empirisch für die gegebene Enzym bestimmt wird. </li><li> Berechnen des Volumens der Substratsuspension, die durch Multiplizieren der 200 &amp; mgr; l Reaktionsvolumen durch die Anzahl der Farbstofffreisetzungsassays benötigt wird, durchgeführt werden. </li><li> Vorbereiten der Substratsuspension durch gefärbten Substrates zum Volumen des Assaypuffer Zugabe, bestimmt in 4.1.2, bis eine optische Dichte (OD) von 2,0 bei 595 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers erreicht. Bleiben innerhalb der funktionellen Grenzen des Spektrophotometers, messen die 2,0 OD 595 als 1,0 für eine 1: 1 - Verdünnung der konzentrierten Lösung. Verwenden Sie Testpuffer als leer. Hinweis: Das Substrat Trübung für die Reaktion kann über 2,0 angehoben werden, um die Aktivitätsniveaus von hoch effizienten Enzymen passen. </li><li> Suspendiere das Protein antimikrobielle werden in Assaypuffer bei einer geschätzten Konzentration von 1 mg / ml bewertet. </li><li> Verwendung des Mikroplatten-Assay eines BCA Protein Assay Kit nach Herstellerprotokoll entsprechend bestimmen die tatsächliche Konzentration der Proteinprobe untersucht werden. Stellen Sie die Konzentration der Stoffsuspension zu 1 mg / ml Testpuffer verwendet. </li></ol></li><li> Unter Verwendung des Dye-Release-Assay, um die optimale Inkubationsbedingungen Bestimmen Sie für ein Protein Antimicrobial <ol><li> Von der Stamm Protein antimikrobielle Suspension auf 100 ng / ul. Diese Konzentration gibt afMasse inal Reaktion von 1 ug Protein pro Volumen (10 ul) hinzugefügt, um die Testreaktion. </li><li> Ermitteln des thermischen Bereich für das bakteriolytisch Protein zu bewerten. Der thermische Bereich in diesen Assays eingeschlossen 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C und 65 ° C. </li><li> Führen Sie die Reaktionstests in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für jeden thermischen Zustand, mit 10 &amp; mgr; l des Aktien Protein zu 200 ul der vorbereiteten Substratsuspension. </li><li> Inkubiere in einem Thermozykler für 8 h unter Mischen durch Inversion einmal pro Stunde. </li><li> Nach der Inkubation verhaften die Reaktionen durch Zugabe von 25 &amp; mgr; l Ethanol. </li><li> Entfernen unverdauten, unlösliches Substrat durch Zentrifugation bei 3000 × g für 2 min und übertragen 150 &amp; mgr; l des Reaktionsüberstand für jede Reaktionsmischung auf eine 96-Well-Flachboden-Mikroplatte, dabei nicht des Pellets von unverdauten Substrat zu stören. </li><li> Messung der enzymatischen Aktivität des Proteins Antimicrobial für das gegebene Substrat durch die Menge an löslichem Farbstoff RBB Bestimmung dissoziiert von dem Substrat nach der enzymatischen Hydrolyse. Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, messen die Absorption des Überstands bei 595 nm im Mikrotiterplatten-Spektrophotometer verwendet wird. Erhöhte Absorption durch den Farbstoff löslich in den Überstand von dem markierten Substrat freigesetzt ist eine quantitative Messung der enzymatischen Aktivität. Hinweis: Die Änderung der Absorption von Aktivitätseinheiten (AU) dargestellt wird, wobei 1 AU Ergebnisse in einer 0,01 Zunahme der optischen Dichte der Farbstofffreisetzungsreaktion Überstand bei 595 nm. Eine Blindreaktion, wobei alle Reaktionskomponenten außer Enzym inkubiert wird verwendet, um alle Farbstoff zu subtrahieren, die durch die Inkubation aus der RBB-markiertes Substrat freigibt. Die optimale enzymatische Temperatur liefert die Spitzenaktivität Einheit Messung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.7 verschiedene Inkubationspuffer verwendet, um die optimalen Pufferbedingungen für die antimikrobielle Enzyms zu bestimmen. in tiese Assays verwenden PBS. </li></ol></li><li> Unter Verwendung des Dye-Release-Test zur Bestimmung der minimalen Wirkstoffkonzentration bei der optimalen Inkubationstemperatur für ein Protein Antimicrobial <ol><li> Führen Sie eine serielle Verdünnung der Stamm antimikrobiellen Proteinsuspension unter Verwendung von Assay-Puffer. Die Verdünnungsreihe Bereich wird mit der Aktivität des antimikrobiellen Enzym variieren. Die serielle Verdünnung in diesen Assays verwendet hergestellten endgültigen Testproteinmengen von 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug und 10 ug. </li><li> Führen Sie jede Reaktionstest in einer 48-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte. Für jeden Test erhalten, fügen Sie 10 ul der jeweiligen Proteinsuspension zu 200 ul der vorbereiteten Substratsuspension. Einstellen Variation des Volumens der Proteinlösung zu dem Reaktions bis 10 &amp; mgr; l Reaktionspuffer verwendet. </li><li> Verschließen Sie die Mikrotiterplatte mit Plattensiegelfolie Volumenänderung durch Verdunstung zu vermeiden. Inkubieren in einem Schüttelinkubator bei der ermittelten optimalen incubation Temperatur für die gegebene Protein antimikrobielle für 16 Stunden unter Schütteln. </li><li> Nach der Inkubation verhaften, die Reaktion durch 25 &amp; mgr; l Ethanol Zugabe zu jeder Vertiefung und entfernen unverdaute Substrat durch Zentrifugation bei 3000 × g für 2 min. </li><li> Übertragung von 150 &amp; mgr; l des Reaktionsüberstand für jede Reaktionsmischung auf eine 96-Well-Flachboden-Mikroplatte, dabei nicht des Pellets des unverdaute Substrat zu stören. </li><li> Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, messen die Absorption des Überstands bei 595 nm im Mikrotiterplatten-Spektrophotometer verwendet wird. Eine Blindreaktion, wobei alle Reaktionskomponenten außer Enzym inkubiert wird verwendet, um alle Farbstoff zu subtrahieren, die durch die Inkubation aus der RBB-markiertes Substrat freigibt. Erhöhte Absorption durch den Farbstoff löslich in den Überstand von dem markierten Substrat freigesetzt liefert ein quantitatives Maß der enzymatischen Aktivität. Hinweis: Die Änderung der Absorption von Aktivitätseinheiten (AU) dargestellt wird, wobei 1 AU Ergebnisse ina 0,01 Erhöhung der optischen Dichte der Farbstofffreisetzungsreaktion Überstand bei 595 nm. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben. Die MITRE Corporation ist eine not-for-Profit-Unternehmen, das mehrere staatlich finanzierten Forschungs- und Entwicklungszentren (FFRDCs) tätig ist.

Der Mikrodia Diffusionstest und der Farbstoff-Freisetzungstest bieten Vorteile für den Nachweis und die zuvor nicht identifizierte Protein antimikrobielle Substanzen zu charakterisieren. Diese schnelle und empfindliche Methoden ermöglichen Hochdurchsatzscreening von Organismus-Source-Bibliotheken für die Identifizierung von Enzymen von Interesse vor der größeren Forschungsressourcen zu investieren. Als Hochprofil Zielenzyme identifiziert sind, können Variationen der Nachweistests verwendet werden, um schnell das Enzym nachzuweisen oder biochemischen Eigenschaften des Enzyms zu bestimmen. Zum Beispiel kann der Mikroobjektdiffusionsassay erkennen während eines vielstufigen Proteinreinigungsschema, schnell Fraktionen, die das Enzym von Interesse enthält. Zusätzlich Reaktions optima für das Enzym kann durch Änderung der Reaktionspuffer und Inkubationstemperaturen in dem Farbstoff-Freisetzungstest bestimmt werden. Der Bereich der Enzymmasse erforderlich für die Detektion in dem Mikroobjektdiffusionsassay ist eine Funktion der Enzym CHARAKTERIstics. Detektions Einschränkungen des Assays erfordern im allgemeinen die Verwendung von höheren Mengen an Enzym als die Farbstoff-Freisetzungsassay. In dieser Studie wurde ein Vergleich der Nachweisgrenzen des Mikroobjektdiffusionstest (Figur 1) zu dem Farbstoff-Freisetzungs - Assay (Figur 4) veranschaulicht , dass der Mikroobjektdiffusionstest eine weniger empfindliche Technik ist als der Farbstoff-Freisetzungsassay ist. Wenn Enzymkonzentration kein Problem ist, kann der Mikrodia Test für schnelle anfängliche Screening von Bibliotheken für die Herstellung von Protein antimikrobielle Wirkstoffe gegen Zielsubstrate mit geringer Arbeit und Ausrüstung verlangt. Obwohl mehr Aufwand und Ausrüstung erfordern, wird das Farbstoff-Freisetzungs-Assay empfindlicher und reproduzierbarer und ergab quantitative Ergebnisse, die einen Vergleich zwischen Farbstofffreisetzungstests der gleichen oder verschiedene Enzyme für ein gegebenes Substrat zu ermöglichen. Die beiden Methoden sind leicht für hoch spezialisierte Instrumentierung, ohne dass in den meisten mikrobiologischen Laboratorien durchgeführt. In der Vertretive Assays, die Steuer Enzym α-Chymotrypsin, wurde bei Mengen so niedrig wie 100 ng (Abbildung 5) unter Verwendung der Farbstofffreisetzungsassay detektiert wird , während die minimale Menge in dem Mikroobjektdiffusionsassay detektiert 1 &amp; mgr; g (Daten nicht gezeigt). Bereitstellen Brauchbarkeit als qualitative Nachweistest für antimikrobielle Enzyme, wurden eine Reihe von Variationen des Diffusionstest wurden 11,13 gemeldet. Bei der Überprüfung dieser Assays wurde die Mikroobjektdiffusionsassay für seine relativ hohe Empfindlichkeit als Anfangsbild und für seine einfache Reaktions Einhaltung entwickelt. Modifizierte aus der Arbeit von Lachica et al. 11, bei der Agarose - Overlays wurden verwendet , um die Produktion von Nukleasen durch Stämme von Staphylococcus aureus zu erfassen, arbeitet der Mikroobjektdiffusionstest ähnlich zu der radialen Immundiffusionsverfahren 14 , wie das Protein aus dem Bohrloch in das diffundiert Agarose, enthaltend das Substrat. Die radiale immunodiffusion Verfahren hält die Ausdehnung der Zone der Immunpräzipitation, wenn das System eine komplexe Bildung Gleichgewicht zwischen dem diffundierenden Antigen und Antikörper in der Agarose erreicht. Im Gegensatz dazu ist das Substrat des Mikroobjektdiffusionsassay anfänglich durch die diffundierende Protein antimikrobielles in einer ständig wachsenden Zone der Lyse umgebenden gut verdaut. Der zunehmende Durchmesser der Zone fortgesetzt, bis die Enzymaktivität oder das Substrat verliert erschöpft ist. Die Rate der Erzeugung der Zone der Lyse wird als die Reinheit beschleunigt und damit die spezifische Aktivität des Enzyms oder der Konzentration des Enzyms zu den gut zunimmt zugegeben. Für die enzymatische Aktivität von Protein antimikrobielle Mittel gegen Hitze abgetöteten B. quantitativ beurteilen subtilis, wobei das Farbstoff-Freisetzungsassay wurde ausgewählt. Kolorimetrische Assays Remazol Farbstoff Brillantblau R (RBB) mit -markierten Substraten vielseitig und sensibel Bewertung von Protein antimikrobiellen activi erlaubenty. Enzymatische Hydrolyse von RBB-markiertes Substrat führt zur Freisetzung von löslichen blauen Produkte, die leicht durch ein Spektrophotometer bei 595 nm gemessen werden kann. Mehrere Variationen des RBB Farbstoff-Freisetzungstest, andere Protein antimikrobielle Enzyme zur Charakterisierung entwickelt, zeigen die Flexibilität dieses Tests für die Anwendung mit anderen Substraten. Zum Beispiel, um die Auswirkungen von Lysostaphin bakteriolytisch Aktivität bei der Bestimmung, Zhou et al., Berichtet ein Farbstoff-Freisetzungstest RBB-gefärbten Staphylokokken - Zellen und Staphylokokken peptidoglycan als Substrate 12 verwendet wird . In einer Abwandlung der Anwendung dieses RBB Farbstoff-Freisetzungstest, Micrococcus-RBB markierte luteus Substrat wurde für die Verwendung als schnelle und empfindliche Mittel vorgeschlagen zu diagnostizieren und Bildschirm für Krankheiten wie bakterielle Infektion und das Vorhandensein eines bösartigen Karzinom, dem die menschliche Lysozym - Expressionsniveaus im Blutserum 15 korreliert werden. Darüber hinaus RBB-markierte Bakterienzellsubstrate haben eineLSO wurde in einem Zymogramm Verfahren zum Nachweis von Lysozym 16 verwendet. Wir zeigen die Nachweisgrenze gesenkt, Bequemlichkeit und Reproduzierbarkeit des Farbstoff-Freisetzungstest, so dass für eine schnelle Bibliothek-Screening für die Enzymproduktion. Modifikationen des Assays ermöglichen nachgeschalteten quantitative biochemische Charakterisierung Assays, einschließlich der Auswirkungen von Temperatur, pH und Salzgehalt , sowie die Auswirkungen anderer proteolytischer Enzyme auf die Aktivität von antimikrobiellen Proteinen 6. Darüber hinaus kann die quantitative Farbstofffreisetzungsassay verwendet werden, die Aktivitäten mehrerer Enzyme, die für ein gegebenes Substrat zu vergleichen. Der RBB Farbstoff-Freisetzungstest wurde auf die Charakterisierung und Nachweis von Protein antimikrobielle Mittel zusätzlich Dienstprogramm für Enzyme mit Aktivität gegen Polysaccharide berichtet. Pettersson und Eriksson berichtet einen Test zum Nachweis von Endoglycanase Aktivität unter Verwendung von amorphen, RBB-gefärbten Polysaccharidkügelchen aus Cellulose, Xylan, Mannan und Chitin 17. In einer Erweiterung dieser Feststellungen, ein empfindliches Verfahren zum Nachweis von Chitinase von Bacillus thuringiensis Bt-107 produzierten Enzyme wurde 18 unter Verwendung von kolloidalem Chitin , markiert mit RBB entwickelt. Aus diesen und anderen Studien, im Handel erhältliche Quellen von RBB-gefärbten Substrate wurden für die Verwendung beim Nachweis von glykolytischen Aktivität, einschließlich solcher gegen Keratin, Amylopektin, Amylose, Glycogen, Laminarin, D-Xylan, Azo-barley Glucan und Stärke entstanden. In dieser Studie zeigen wir die Nützlichkeit des Farbstoff-Freisetzungs-Assay in einem Mikroplattenformat, das Volumen des RBB-markiertem Substrat und Enzym erforderlich ist, reduziert die kolorimetrische Ergebnis zu erzeugen. Wie in 4 veranschaulicht und Figur 5 stellt die Mikrotiterplatte Farbstofffreisetzungsassay eine untere Nachweisgrenze als die Mikroobjektdiffusionsassay für die enzymatische Aktivitätserkennung. Im Hinblick auf den schnellen Einsatz, die Erhaltung der Arbeit und der Leichtigkeit der Interpretation, die microslide Diffusionsassay liefert Dienstprogramm in anfänglichen Hochdurchsatz-Screens für die Anwesenheit antimikrobieller Aktivität sowie die Angabe des antimikrobiellen Proteins in Anwesenheit nachgeschalteten Protein Isolierungs- und Reinigungsschritte. Die Kombination dieser beiden Assays ergänzen sich in der ersten Screening und ultimative Charakterisierung neuartiger Protein antimikrobielle Wirkstoffe

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and &#945;-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

<table><tbody><tr><td>48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>3078</td><td></td></tr><tr><td>96-well flat-bottom microplate (Costar 3595)</td><td>Corning, Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP162-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-chymotrypsin</td><td>MP Biomedicals</td><td>215227205</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 168</td><td>American Type Culture Collection</td><td>23857</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cork borer</td><td>Humboldt</td><td>H-9661</td><td></td></tr><tr><td>lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>McFarland equivalence standard (2.0)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R20412</td><td></td></tr><tr><td>microslides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-38-103</td><td></td></tr><tr><td>nutrient broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25959B</td><td></td></tr><tr><td>peptidoglycan of &lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt; 168</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69554-10MG-F</td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline (1x)</td><td>Teknova</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT microplate spectrophotometer</td><td>BioTek Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Remazol brilliant blue R dye (RBB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8001</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica subsp. enterica</td><td>American Type Culture Collection</td><td>10708</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film</td><td>Diversified Biotechnology</td><td>T-TOPS-50</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure distilled water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose solution&lt;br/&gt; 50 ml PBS&lt;br/&gt; 0.25 g agarose</td><td></td><td></td><td>Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution</td></tr><tr><td>nutrient broth medium&lt;br/&gt; 4 g nutrient broth&lt;br/&gt; 500 ml Type I water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM sodium hydroxide (NaOH) solution&lt;br/&gt; 1 g NaOH&lt;br/&gt; 99 ml Type I water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)&lt;br/&gt; 1.25 g RBB&lt;br/&gt; 98.75 ml 250 mM NaOH solution</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Der Mikrodia Diffusionstest und die quantitative Farbstoff-Freisetzungstest sind wirksame Methoden für das Screening und erste Untersuchungen neuer Protein antimikrobielle Substanzen zu messen. Jeder Test hat Vorteile und Grenzen; aber wenn sie in Verbindung durchgeführt werden, ermöglichen sie schnelle anfängliche Screening und die grundlegende Charakterisierung eines antimikrobiellen. Der Mikrodia Diffusionstest ermöglicht es effizient für das schnelle Screening von mikrobiellen Bibliotheken, Protein antimikrobielle Substanzen produzieren. Wenn die Enzymkonzentration bedenklichen Werte sind, die Empfindlichkeit der Detektionsbeschränkungen kann der Test zu begrenzen, eine größere Menge an Enzym erforderlich, um die Reaktion hinzugefügt werden und als der Farbstoff-Freisetzungsassay. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist , erlauben die qualitativen Eigenschaften des Assays der Beobachter relativ Enzymmengen und innerhalb jeder Gegenwart zu vergleichen. 1A (25 &amp; mgr; g Enzym), zeigt die Vorderkante der Zone trübe oder unvollständige Lyse des Substrats, während die Zone zur nächsten gut zeigt ein vollständigeres Substrat Lyse. Dieses Phänomen, das ein Produkt der abnehmenden Konzentration des streuenden Enzyms an der Vorderkante, erschwert die genaue Messung der Zonendurchmesser. Da die Vertiefungen B (15 &amp; mgr; g), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 ug) und F (0,1 &amp; mgr; g) in 1 beobachtet werden, verflüchtigt sich der Durchmesser der Zone der vollständigen Lyse Extinktion die reduzierte Menge des Enzyms korreliert. Für Zustand F (0,1 &amp; mgr; g) ist die Enzymkonzentration in der Agarose unter der Grenze, die die Diffusions Enzym erlauben wird, sichtbar gemacht werden, wie es durch die Agarose sich bewegt, um das Substrat zu hydrolysieren. Der Mikrodia Diffusionstest wurde durchgeführt , auch gereinigte Bacillus subtilis Pepti mitdoglycan als Substrat (Abbildung 2). Während die Zone als die mit ganzen Zelle Salmonella enterica , um die Reluktanz des Peptidoglycan aufgrund beobachtet weniger definiert ist , gleichmäßig in der Agarose suspendieren, ist die Hydrolyse des Peptidoglycan durch die unbekannte antimikrobielles Enzym offensichtlich. Der Farbstoff-Freisetzungs-Assay ist ein empfindlicher und vielseitiger Test als der Mikrodia Diffusionstest, eine niedrigere Nachweisgrenze und Variation von Umweltfaktoren ermöglicht die Enzymreaktion zu beeinflussen. In den repräsentativen Assays wurde, die Temperatur , die optimale Temperatur für die antimikrobiellen Enzyms zu bestimmen variiert, bestimmt 35 ° C in PBS werden (Abbildung 3). Dieses Optimum wird als erhöhte Mengen an blauen Farbe (3B) sowie dargestellt in Aktivitätseinheiten , abgeleitet von Absorptionsmessungen bei 595 nm (3A) deutlich in den Reaktionsüberstand gesehen. DasVielseitigkeit des Farbstoff-Freisetzungsassay erlaubt es dem Forscher nicht nur die Temperaturen variieren, aber die Reaktionspuffer und Pufferkomponenten auch eine optimale Inkubationsbedingungen für ein gegebenes Enzym schnell zu bestimmen. Das Aktivitätsniveau des unbekannten antimikrobiell Enzym (Abbildung 4) und der α-Chymotrypsin Steuer Enzym (Figur 5) wurden in der bestimmten optimalen Inkubationstemperatur von 35 ° C in PBS gegen RBB-markiertem Bacillus subtilis hitzegetöteten Substrat gemessen. Vergleich der Ergebnisse von 4 und 5 zeigt an, daß das unbekannte antimikrobielles Enzym hat fast die doppelte Affinität für die B. subtilis Substrat. Darüber hinaus hat die α-Chymotrypsin Kontrolle nicht vollständig verdauen die durch Hitze abgetöteten B. subtilis Substrat innerhalb der Vertiefung (Daten nicht gezeigt). Die Aktivität der α-Chymotrypsin Steuerung beginnt zu plattierenau rund 0,3 ug im Vergleich zu der fortgesetzten Anstieg der Aktivitätseinheiten in allen Enzymmengen für das unbekannte antimikrobielle Enzym (Abbildung 4 und Abbildung 5). Dies kann darauf hindeuten , dass das unbekannte Enzym eine größere anhaltende Aktivität aufweist oder , dass es eine größere Anzahl von Spaltstellen zur Verfügung zu dem Enzym innerhalb der B. subtilis Substrat. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> Abb . 1: Enzymaktivität gegen Salmonella enterica Ganze Zellsubstrat Der Mikrodia Diffusionstest wurde verwendet , um die Aktivität eines unbekannten Proteins antimikrobielle gegen Hitze abgetötete Salmonella enterica subsp qualitativ bewerten ente (ATCC 10708).. Die Proteinmassen des unbekannten antimikrobiell suspendiert in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die zu den jeweiligen Vertiefungen zugegeben wurdendie Folien enthalten 25 ug (gut A), 15 &amp; mgr; g (gut B), 10 &amp; mgr; g (gut C), 5 ug (gut D), 1 &amp; mgr; g (gut E) und 0,1 ug (gut F). PBS allein wurde für die negativen Kontrollen der Assays verwendet. Zonen der Lyse nach einer 6 - stündigen Inkubation abgebildet wurden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> Fig . 2: Enzym - Aktivität gegen Bacillus subtilis Zellwand - Peptidoglycan Der Mikroobjektdiffusionsassay wurde verwendet , um qualitativ die Aktivität eines unbekannten Proteins antimikrobiell gegen Peptidoglycan von Bacillus subtilis 168 auszuwerten. Suspendiert in 20 &amp; mgr; l PBS, 10 &amp; mgr; g des unbekannten antimikrobiell wurde gut A der Mikroobjekt zugegeben. PBS allein wurde als negative verwendetKontrolle für den Test (gut B). Die Zone der Lyse nach einer 6-stündigen Inkubation bei 37 ° C abgebildet wurde. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> Fig . 3: Optimale Reaktionstemperatur für ein Protein Antimicrobial Die Vielseitigkeit des Farbstoff-Freisetzungsassay erlaubt die Veränderung der physikalischen und chemischen Parameter, wie Inkubationstemperaturen und Puffer, um deren Einflüsse auf die Aktivität des Enzyms von Interesse 6 bestimmen. Wie in dieser Figur dargestellt ist , die Aktivität des unbekannten Proteins antimikrobielle (1 ug) wurde in PBS gegen RBB-markiertem Hitze abgetöteten Bacillus subtilis unter verschiedenen Inkubationstemperaturen ausgewertet. Angezeigt als Aktivitätseinheiten (AU) in (A), die Absorption von RBB-bound Produkte in den Überstand freigesetzt nach Hydrolyse bei 595 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Spektrophotometer gemessen wurde. Bei jedem Temperaturzustand, Reaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes zu subtrahieren, die von der Inkubation bei verschiedenen Temperaturen geführt. Die Reaktionsüberstand auf jeder Inkubationstemperatur entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessung (B) abgebildet. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Aktivitätsbereich für ein Protein Antimicrobial Der Aktivitätsbereich für das unbekannte Protein antimikrobielle wurde als Aktivitätseinheiten nach über Nacht Inkubationen gemessen für 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 und 1000 ng , wie von der BCA prot gemessenein Test (A). Für diese Reaktionen, die RBB-markiertes B. subtilis Substratniveau erhöht wurde eine optische Dichte von 5,0 bei 595 nm zu geben , um sicherzustellen , daß die Reaktion mit der höchsten Menge an Enzym (1000 ng) nicht vollständig den gesamten verfügbaren Substrat innerhalb der Reaktions Inkubationsperiode hydrolysieren. Kontrollreaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes durch die Inkubation allein verursacht zu subtrahieren. Die Reaktionsstände zu jedem Enzymmenge entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessungen (B) abgebildet. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Aktivitätsbereich für α-Chymotrypsin der Aktivitätsbereich für α-Chymotrypsin wurde als activ gemessenkeit Einheiten nach über Nacht Inkubationen für 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 und 1000 ng Enzym (A). Für diese Reaktionen, die RBB-markiertes B. subtilis Substratniveau erhöht wurde eine optische Dichte von 5,0 bei 595 nm zu geben , um sicherzustellen , daß die Reaktion mit der höchsten Menge an Enzym (1000 ng) nicht vollständig den gesamten verfügbaren Substrat innerhalb der Reaktions Inkubationsperiode hydrolysieren. Kontrollreaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes durch die Inkubation allein verursacht zu subtrahieren. Die Reaktionsstände zu jedem Enzymmenge entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessungen (B) abgebildet. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K Aufrufe.  The MITRE Corporation. Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Serie: Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Forschung

Chemie

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in solution, has shown considerable potential in biochemical sensing applications with unprecedented sensitivity and specificity1-5. The drug-target interactions generate surface stress, causing the cantilever to bend, and the signal can be analyzed optically when it is illuminated by a laser. The change in surface stress measured with nano-scale precision allows disruptions of the biomechanics of model bacterial cell wall targets to be tracked in real time. Despite offering considerable advantages, multiple cantilever sensor arrays have never been applied in quantifying drug-target binding interactions.
Here, we report on the use of silicon multiple cantilever arrays coated with alkanethiol self-assembled monolayers mimicking bacterial cell wall matrix to quantitatively study antibiotic binding interactions. To understand the impact of vancomycin on the mechanics of bacterial cell wall structures1,6,7.&#160;We developed a new model1 which proposes that cantilever bending can be described by two independent factors; i) namely a chemical factor, which is given by a classical Langmuir adsorption isotherm, from which we calculate the thermodynamic equilibrium dissociation constant (Kd) and ii) a geometrical factor, essentially a measure of how bacterial peptide receptors are distributed on the cantilever surface. The surface distribution of peptide receptors (p) is used to investigate the dependence of geometry and ligand loading. It is shown that a threshold value of p ~10% is critical to sensing applications. Below which there is no detectable bending signal while above this value, the bending signal increases almost linearly,&#160;revealing that stress is a product of a local chemical binding factor and a geometrical factor combined by the mechanical connectivity of reacted regions and provides a new paradigm for design of powerful agents to combat superbug infections.

Acquired resistance to antibiotics is a major public healthcare problem and is presently ranked by the WHO as one of the greatest threats to human life. Here we describe the use of cantilever technology to quantify antibacterial resistance, critical to the discovery of novel and powerful agents against multidrug resistant bacteria.

Nanomechanics von Drug-Target-Interaktionen und Antibakterielle Widerstand Erkennung

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

Immunologie und Infektion

Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the present study, freshwater samples were collected and analyzed with respect to the total bacterial diversity and AR genes (ARGs) using both conventional culture-based techniques and a high-throughput culture-independent metagenomic approach. This paper presents a systematic protocol for the enumeration of the total and antibiotic-resistant culturable bacteria from freshwater samples and the determination of phenotypic and genotypic resistance in the culturable isolates. Further, we report the use of whole metagenomic analysis of the total metagenomic DNA extracted from the freshwater sample for the identification of the overall bacterial diversity, including non-culturable bacteria, and the identification of the total pool of different ARGs (resistome) in the water body. Following these detailed protocols, we observed a high antibiotic-resistant bacteria load in the range of 9.6 &#215; 105-1.2 &#215; 109 CFU/mL. Most isolates were resistant to the multiple tested antibiotics, including cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, and ciprofloxacin, with multiple antibiotic resistance (MAR) indexes of &#8805;0.2, indicating high levels of resistance in the isolates. The 16S rRNA sequencing identified potential human pathogens, such as Klebsiella pneumoniae,&#160;and opportunistic bacteria, such as Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., and Aeromonas spp. The molecular characterization of the isolates showed the presence of various ARGs, such as blaTEM, blaCTX-M (&#946;-lactams), aadA, aac (6&#39;)-Ib (aminoglycosides), and dfr1 (trimethoprims), which was also confirmed by the whole metagenomic DNA analysis. A high prevalence of other ARGs encoding for antibiotic efflux pumps-mtrA, macB, mdtA, acrD, &#946;-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, the&#160;chloramphenicol acetyltransferase gene catB10, and&#160;the rifampicin resistance gene rphB-was also detected in the metagenomic DNA. With the help of the protocols discussed in this study, we confirmed the presence of waterborne MAR bacteria with diverse AR phenotypic and genotypic traits. Thus, whole metagenomic DNA analysis can be used as a complementary technique to conventional culture-based techniques to determine the overall AR status of a water body.

Here, we present a detailed protocol for the isolation and identification of antibiotic-resistant bacteria from water and the molecular characterization of their antibiotic resistance genes (ARGs). The use of culture-based and non-culture-based (metagenomic analysis) techniques provides complete information about the total bacterial diversity and the total pool of different ARGs present in freshwaters from Mumbai, India.

Isolierung und Identifizierung wässriger antibiotikaresistenter Bakterien und molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the ...

Umwelt

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hochdurchsatz-Screening-Assay für Mycobacterium abscessus mit Dual-Reportern

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Skalierbares Wirkstoff-Screening-Protokoll für die effiziente Entdeckung von M. abscessus-Behandlungen

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Zusammenfassung

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Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

Nanomechanics von Drug-Target-Interaktionen und Antibakterielle Widerstand Erkennung

Isolierung und Identifizierung wässriger antibiotikaresistenter Bakterien und molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien