Name: zebrafish as a model to assess the teratogenic potential of nitrite
Uploaded: 2016-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite at JoVE.com

VK was funded by grants from the IUP Department of Biology and School of Graduate Studies and Research (Graduate Student Professional Development). CQD and TWS were supported by the IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). We also thank members of the Diep laboratory for maintaining the zebrafish facility.

Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Indiana University of Pennsylvania genehmigt. 1. Ernte Embryonen <ol><li> Pflegen Zebrafisch bei 28,5 ° C, pH 7, Leitfähigkeit zwischen 500-1.500 uS, und ein Hell / Dunkel-Zyklus von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit 24. Verwenden Wildtyp-Stämme, wie Di, AB oder TU / AB-Hybrid. Verschiedene Stämme können unterschiedlich auf chemische Behandlung 25 reagieren. </li><li> Stellen Sie den Fisch bis zum Zusammenpassen der Nacht vor der Ernte Eier von Fischen System Wasser in einen passenden Behälter legen. Fügen Sie eine männliche und weibliche Fische in den Tank und trennen die beiden Fische mit einem Teiler. Jeder Fisch Paar wird eine Reihe von 50-300 Eier produzieren. Um sicherzustellen, dass genug Eier werden 30 Paare von Fischen hergestellt, eingerichtet. Typischerweise werden etwa 50% der Fische paarweise an der Blüte Paarungszeit (6-9 Monate alt) Eier produzieren, was bis zu 200 Eier pro Paar und ein Maximum von bis zu 3000 Eier für dieses Experiment. </li><li> Am nächsten Morgen, nachdem das Licht eingeschaltet wird, entfernen Sie die Trennlinie Paarung einzuleiten. Schauen Sie sich die passenden Behälter für Eier alle 15 min. </li><li> Sobald die Fischeier legen, ernten alle Embryonen ein Teesieb verwendet und sie in einen großen Behälter mit E3 Puffer kombinieren (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4). Bei 1,5 HPF, entfernen und entsorgen unbefruchteten Eier mit einem Plastiktransferpipette unter einem Binokular. Unbefruchteten Eiern sind undurchsichtig, während befruchtete Eier sind transparent 34. </li><li> Dann werden 50 Embryonen in einer 100 x 15 mm Glaspetrischale mit 50 ml E3-Puffer für jede Behandlung erhalten. Insgesamt 33 Gerichte werden für 11 Behandlungsbedingungen und 3 Wiederholungen benötigt. </li></ol> 2. Die Behandlung von Embryonen <ol><li> Führen Sie Behandlungen bei 2 Stunden nach der Befruchtung (HPF) 35. Inkubieren Embryonen / Larven bei 28,5 ° C und die Larven bei 120 HPF untersuchen. Führen Sie bei least drei Wiederholungen jeder Behandlungsbedingung für die statistische Analyse. </li><li> Für 3 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml 300 mM Ethanol in der E3-Puffer hinzuzufügen. Decken Sie die Petrischalen mit Parafilm der Verdampfung von Ethanol zu minimieren. <ol><li> Weiter die Embryonen Aussetzen für 22 Stunden zu Ethanol. Dann entfernen Sie das Ethanol mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und schwenken Sie die Schale mehrmals um das Ethanol zu waschen. Entfernen Sie diesen E3-Puffer mit einer Transferpipette und wiederholen Sie den Waschschritt 2 weitere Male. </li></ol></li><li> Für 3 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml neue Puffer E3 hinzuzufügen. </li><li> Für 9 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml von 1.000 mg / l Natriumnitrit in der E3-Puffer gelöst. Bestätigen Sie die Konzentration der Stammnitritlösung vorher ein mitModifikation der Diazotierung (US-EPA-Methode 354.1) spektrophotometrische Methode 28. <ol><li> Weiter dahinter 3 Gerichte für 46 Stunden, 3 Gerichte für 70 Stunden und 3 Gänge für 94 Stunden. Ersetzen Sie den Nitritlösung mit frisch zubereiteten Nitritlösung täglich. </li><li> Nach jeder Belichtungszeit, entfernen Sie das Nitrit mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und schwenken Sie die Schale mehrmals das Nitrit auszuwaschen. Entfernen Sie diesen E3-Puffer mit einer Transferpipette und wiederholen Sie den Waschschritt 2 weitere Male. </li></ol></li><li> Für 3 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml 200 mg / l Natriumnitrit hinzu. Wiederholen Sie dies mit 400, 600, 800 und 1000 mg / l Natriumnitrit. <ol><li> Weiter die Embryonen zu Nitrit für 70 Stunden ausgesetzt. Ersetzen Sie den Nitritlösung mit frisch zubereiteten Nitritlösung täglich. </li><li> Nach der Einwirkzeit, entfernen Sie das Nitrit mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und wirbeln die Schale mehrmal die Nitrit auszuwaschen. Entfernen Sie diesen E3-Puffer mit einer Transferpipette und wiederholen Sie den Waschschritt 2 weitere Male. </li></ol></li><li> Für 3 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml von 1.000 mg / l Natriumnitrat in der E3-Puffer gelöst. Bestätigen Sie die Konzentration der Stammnitratlösung eine Modifikation der Cadmium Reduktion (US-EPA-Methode 353.3) spektrophotometrische Methode 28 vorher mit. <ol><li> Weiter die Embryonen zu Nitrat für 70 Stunden ausgesetzt. Ersetzen Sie den Nitratlösung mit frisch zubereiteten Nitratlösung täglich. </li><li> Nach der Einwirkzeit, entfernen Sie das Nitrat mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und schwenken Sie die Schale mehrmals den Nitrat auszuwaschen. Entfernen Sie diesen E3-Puffer mit einer Transferpipette und wiederholen Sie den Waschschritt 2 weitere Male. </li></ol></li><li> Während jeden Tag der Exposition, zählen die Anzahl der toten Embryo / Larven ein Stereomikroskop. Zeichen des Todesgehören der Mangel an Herzschlag und Blutkreislauf, oder Mangel an Beweglichkeit nach 1 min der Beobachtung. Entfernen abgestorbene Embryonen / Larven mit einer Transferpipette Verunreinigung des E3-Puffer zu reduzieren. </li><li> Bei Experimenten bei 120 HPF zu beenden, einschläfern die Larven. <ol><li> Entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette. Anschließend werden 50 ml von 0,2% MS-222 (gepuffert auf pH 7) und für 10 Minuten warten. </li><li> Entfernen Sie die MS-222 mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und Wirbel um die MS-222 auswaschen. </li><li> Entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 20 ml von 4% Paraformaldehyd (PFA), um die Larven zu beheben. Swirl das Gericht mehrmals. Verwenden Sie eine Transferpipette die Larven in einen Glaskolben übertragen zusammen mit genug PFA das Fläschchen zu füllen. Bewahren Sie die Fläschchen im Kühlschrank über Nacht (O / N). </li></ol></li><li> Machen Sie Fotos von Fest Larven ein Stereoskop mit einer Digitalkamera. Verwenden Sie 30-facher Vergrößerung, ISO 200 und 200 ms Belichtungszeit. Richten Sie die Larven, so dass der vordere zum left und die Rücken ist an die Spitze des Feldes. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Nützlichkeit von Zebrafisch in das teratogene Potential von Nitrit und Nitrat zu beurteilen. Im Vergleich zu anderen Wirbeltieren, Zebrafisch Vorteile haben, die hohe Fruchtbarkeit sind, externe Düngung, optische Transparenz und schnelle Entwicklung. Erhältlich Mutanten, die helfen Pigmentierung (wie die Casper Zebrafisch-36) auch fehlen, um die Sichtbarkeit der inneren Organe zu verbessern. Es ist auch einfach transgene Zebrafisch mit Reportergenen zu erzeugen Analyse in lebenden Fischen 37 zu erleichtern. Da der Zebrafisch-Genom mit dem Menschen konserviert ist, Informationen aus ihren Studien gewonnenen Erkenntnisse können 9 beim Menschen Translations Ergebnissen führen. Das Verfahren kann auf die Genexpressionsanalyse verwendet werden, wie in situ Hybridisierung, zusätzliche Informationen über die Fehlregulation von Genen durch Teratogene verursacht zu gewinnen. Ethanol Exposition hatte keinen signifikanten Einfluss Überleben, aber es hat ma verursachenrked Mängel ähnlich früheren Berichten 5,23,26. Dies zeigt, dass unsere Methode in sich wiederholenden veröffentlichten Ergebnisse zuverlässig ist. Nitrat hatte keinen Einfluss auf das Überleben, während Nitrit eine signifikante Abhängigkeit von Konzentration und Einwirkzeit beeinflussen musste. Längere Belichtungs und höhere Nitrit hatten einen negativen Effekt auf das Überleben, im Einklang mit früheren Ergebnissen 5. Es wurde vor kurzem gezeigt, dass eine übermäßige Nitrit Belichtung defekten Herzklappe Entwicklung im Zebrafisch 27, verursacht die Verwendung von Zebrafisch-Validierung der Mechanismus der Teratogenen zu studieren. Es ist entscheidend, um die Konzentrationen von Arbeitslösungen zu bestätigen, nachdem sie gemacht werden. Die Konzentrationen von Nitrat und Nitrit kann mit Modifikationen der Cadmium Reduktion (USEPA Method 353,3) und Diazotierung (USEPA Method 354.1) spektrophotometrischen Verfahren gemessen werden, jeweils 28. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Petrischale mit Parafilm abdecken Verdunstung zu minimierenRation Ethanol wenn dies als positive Kontrolle verwendet. Wenn Larven unerwartete Todesfälle haben (zu hoch oder zu niedrig), überprüfen Sie die Berechnungen und die Konzentrationen der Lösungen. Kürzlich wurde ein ähnliches Verfahren die teratogene Wirkungen von Ethanol 29 zu bestimmen. Obwohl diese Methode hier auf unsere Methode ähnlich ist, macht es nur Embryonen für bis zu 24 h in Ethanol, vermutlich aufgrund der Toxizität Embryonen des Aussetzens für eine lange Zeitdauer zu Ethanol. Im Gegensatz dazu macht unsere Methode Embryonen zu Nitrat und Nitrit für mehrere Tage mit Austausch der Testlösungen täglich. Dies ist vorteilhaft für die Prüfung weniger toxische Chemikalien. Wir stellen uns vor, dass unsere Methode anderen Medikamenten oder bestimmten Umweltbedingungen zu testen, angewendet werden kann. Jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf nur wasserlösliche Moleküle zu testen. Die Lichtempfindlichkeit von bestimmten Chemikalien ist ein weiterer Faktor zu berücksichtigen. Wenn Testchemikalien sind leicht sensitive, Wrap Folie die Petrischalen aus Aluminium vor Licht zu schützen. Auch ist das Verfahren gut, nicht für die Prüfung von Wasser aus einer bestimmten Umgebung genommen, weil Laborzebrafisch bestimmten Bedingungen (wie pH-Wert und Leitfähigkeit) erfordern für eine optimale Entwicklung. Trotzdem dient der Zebrafisch als ein günstiges Modell zu schnell Entwicklungsstörungen durch Potential Teratogenen verursacht bestimmen.

Teratogenese ist ein Prozess, der die normale Entwicklung des Embryos oder Fötus 1 durch was zu dauerhaften strukturellen und funktionellen Störungen, Wachstumsverzögerung oder Fehlgeburt in schweren Fällen stört. Es kann durch bestimmte natürliche Substanzen (teratogen) hervorgerufen werden, die zwei in mehrfacher Hinsicht mit der embryonalen Entwicklung stören. Während menschliche fetale Entwicklung, gemeinsame Teratogenen wie Strahlung, Infektionserreger, toxische Metalle und organische Chemikalien berichtet Mängel in Epikanthus (die Hautfalte im oberen Augenlid) und Klinodaktylie (gekrümmte Finger oder Zehen) durch morphogenetische Fehler zu verursachen 1. den molekularen Mechanismus der teratogenesis zu verstehen, ist der erste Schritt zur Behandlung und Prävention zu entwickeln. Mehrere Wirbeltiermodellen wie dem afrikanischen Krallenfrosch (Xenopus laevis) und Zebrafisch (Danio rerio) verwendet worden, um die molekularen Signalwege betroffen zu bestimmen, indem teratOgens. Frühere Studien haben für Epidemiologie, Toxikologie und teratogenesis 7.3 Zebrafisch als Modell verwendet. Scholz et al. betrachtet Zebrafisch als &quot;Goldstandard&quot; für Umwelttoxizität Beurteilung. Dies ist darauf zurückzuführen, zum Teil auf die Transparenz des Zebrafischembryo, die Forscher können die Entwicklungsdefekt sichtbar zu machen, wie es 8 auftritt. Etwa 70% der menschlichen Gene haben Orthologe im Zebrafisch, Zebrafisch macht eine wünschenswerte Wirbeltiermodell für die Untersuchung menschlicher Mängel 9. Einige epidemiologische Studien haben vorgeschlagen, dass Nitrat und Nitrit, üblicherweise in landwirtschaftlichen Lebensmitteln und Wasser, sind im Zusammenhang mit Geburtsschäden oder Fehlgeburten 10,11, während andere Studien nicht unterstützen diese Verbindung 12. Nitrat (NO 3 -) und Nitrit (NO 2 -) sind von Natur aus in Boden und Wasser. Sie sind eine Stickstoffquelle für Pflanzen und sind ein Teil der nitrogen Zyklus 13. Lebensmittel wie grüne Bohnen, Karotten, Kürbis, Spinat und Rüben aus Betrieben, die Düngemittel reich an Nitrat verwenden haben Gehalte für Nitrat und Nitrit 7 deutlich erweitert. Milch von Kühen mit hohen Nitrat Lebensmitteln und Fisch in hohen Nitrat Wasser (vor allem aus dem Boden Abfluss 30) zugeführt wird auf den Menschen führen große Mengen an Nitrat und Nitrit raub 14. Nitrat und Nitrit sind auch häufig in der Lebensmittelkonservierung verwendet, die drastisch die Menge von Menschen eingenommen 12 erhöht. Die optimale Einsatzmenge von Nitrat und Nitrit spielen fundamentale Rolle bei physiologischen Prozessen wie vaskuläre Homöostase und Funktion, Neurotransmission und immunologische Abwehrmechanismen des Wirts 13-15. Allerdings Exposition gegenüber hohen Nitrat und Nitrit kann zu Nebenwirkungen führen, vor allem bei Säuglingen und Kindern 16. Ingested Nitrat ist weiter umgewandelt zu Nitrit in der Mundhöhle von der Mikroflora und in the Gastrointestinaltrakt durch Darmflora 17. Nitrat setzt Kleinkinder auf einem hohen Risiko für blaues Baby-Syndrom durch Oxidation von Hämoglobin zu Methämoglobin, Hämoglobin von seinem Sauerstoff beeinträchtigt Tragfähigkeit 18. Daraus ergibt sich die blaue Farbe der Haut, die in schweren Fällen zu peripheren Geweben erstreckt. Gehemmt Sauerstoffversorgung der Gewebe führt zu anderen Symptomen, was am schwersten zu Koma und Tod 19,20. Ähnliche Symptome sind bei Säuglingen und Erwachsenen bei höheren Konzentrationen an Nitrat 21 beobachtet. Erhöhte Konzentrationen von Methämoglobin bei Erwachsenen aufgrund Nitritvergiftung führt zu Zyanose, Kopfschmerzen, Atemstörungen 31 und Tod, wenn nicht aufgrund von Komplikationen behandelt im Zusammenhang mit lebenswichtigen Gewebshypoxie 32,33. Nitrat auf höheren Ebenen eingenommen kann auch zu verschiedenen gesundheitlichen Komplikationen. Diabetes bei Kindern, wiederkehrender Durchfall, und wiederkehrenden Infektionen der Atemwegebei Kindern wurden mit hohen Nitrataufnahme 11,17,22 verbunden. Die chronische Exposition zu einem hohen Niveau von Nitrat wird beim Wasserlassen und Milz Blutungen verbunden. Akute Hochdosis-Exposition gegenüber Nitrat kann im Stuhl und Urin, Ohnmacht und Tod 11 auf ein breites Spektrum von Erkrankungen wie Bauchschmerzen, Muskelschwäche, Blut führen. Pränatalen Exposition gegenüber Nitrat auf hohem Niveau hat mit Neuralrohr und Muskel-Skelett-Defekt 11 in Verbindung gebracht. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte, dass Zebrafischembryonen mit Nitrit Behandlung führte sac Ödeme, Gesichtsschädel und axiale Fehlbildungen zu Eigelb und Schwimmblase noninflation 5. In dieser Studie zeigen wir ein Verfahren zur Behandlung Zebrafischembryonen mit Nitrat und Nitrit ihre teratogene Potential zu bestimmen. Die Embryonen wurden bei verschiedenen Konzentrationen und unterschiedlich lange ausgesetzt zu Nitrit. Ethanol wurde als positive Kontrolle verwendet, da es eine etablierte teratogen 23 ist. Our Verfahren zeigten, dass sowohl hohe Konzentrationen und langen Belichtungszeiten zu Nitrit zu Überleben und führte zu verschiedenen Phänotypen, die von mild (Ödem) zu schweren (brutto Entwicklungsdefekten) schädlich waren. Daher ist der Zebrafisch ein nützliches Modell für direkt die möglichen teratogene Wirkungen von Nitrat und Nitrit an Embryonen zu erkunden epidemiologischen Studien zu ergänzen.

<table><tbody><tr><td>DREL/2010 instrument</td><td>Hach</td><td>26700-03</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>KIMAX glass Petri Dish</td><td>VWR</td><td>89001-244</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>NitraVer 5 Nitrate Reagent</td><td>Hach</td><td>14034-46</td><td></td></tr><tr><td>NitriVer 3 Nitrite Reagent</td><td>Hach</td><td>14065-99</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>3-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>S6E stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>10446294</td><td></td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S343</td><td></td></tr><tr><td>Sodium nitrite</td><td>Fisher Scientific</td><td>S347</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>L320072</td><td></td></tr><tr><td>Glass vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish as a model to assess the teratogenic potential of nitrite

Hohe Nitratwerte in der Umgebung können in angeborenen Defekten oder Fehlgeburten bei Menschen führen. Vermutlich ist dies auf die Umwandlung von Nitrat zu Nitrit von Darm und Speichelbakterien. Aber auch in anderen Säugetier-Studien, hohe Nitritwerte nicht Geburtsfehler verursachen, obwohl sie zu einer schlechten reproduktiven Ergebnissen führen kann. Somit ist das teratogene Potential von Nitrit nicht klar. Es wäre sinnvoll, ein Wirbeltier-Modellsystem zu haben, um leicht fruchtschädigende Wirkung von Nitrit oder ähnliche chemische meisten interessieren. Hier zeigen wir die Nützlichkeit von Zebrafisch (Danio rerio) Verbindungen zur Toxizität und embryonalen Mängel zu untersuchen. Zebrafisch-Embryonen werden extern befruchtet und haben die rasante Entwicklung, ihnen ein gutes Modell für teratogene Studien zu machen. Wir zeigen, dass die Zeit der Belichtung zu erhöhen negativ Überleben beeinflusst zu Nitrit. die Konzentration von Nitrit Erhöhung wirkt sich auch negativ auf das Überleben, während Nitrat nicht. Für Embryonen that überleben Nitrit Belichtung können verschiedene Defekte auftreten, einschließlich Herzbeutel und Dottersack Ödeme, Schwimmblase noninflation sowie Schädel- und Gesichtsfehlbildung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Zebrafisch ein bequemes System ist das teratogene Potential von Nitrit zu studieren. Dieser Ansatz kann leicht für ihre Auswirkungen auf die frühe Entwicklung von Wirbeltieren zu testen, andere Chemikalien angepasst werden.

Die Exposition gegenüber 300 mM Ethanol für 22 h hatte keinen Effekt auf das Überleben (Daten nicht gezeigt) mit früheren Berichten konsistent 5,23,26. Dies wird erwartet, da Ethanol eine bekannte teratogen ist und diente als Positivkontrolle. Die beobachteten Phänotypen enthalten pericardial Ödeme, Schwimmblase noninflation (Abbildung 1), Schädeldefekten und Entwicklungsverzögerung (Daten nicht gezeigt). Die Behandlung mit Nitrit führte zu leichten bis schweren Auswirkungen auf das Überleben in Abhängigkeit von der Zeit der Belichtung. Beispielsweise Belichtung bis 1000 mg / L nach 94 Stunden stark betroffen Überleben im Vergleich zu kürzeren Belichtungszeiten (Abbildung 2). Wir untersuchten auch die Wirkung verschiedener Nitritkonzentrationen auf das Überleben. Die Embryonen wurden für 70 h auf 200 ausgesetzt, 400, 600, 800 und 1000 mg / L. Die Überlebensraten waren niedriger als zu hoch ausgesetztKonzentrationen von Nitrit, Nitrat, während keine Wirkung auf das Überleben (Abbildung 3) hatte. Phänotypen auf Nitrit-behandelten Larven glich Ethanol behandelten Embryonen (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53615/53615fig1.jpg" /> Abb. 1: Auswirkungen auf die Entwicklung von Ethanolbehandlung Embryonen behandelt mit Ethanol zeigte pericardial Ödem (Pfeil), Schwimmblase noninflation (gestrichelte Linie), Dottersack Ödem (Pfeilspitze) und Gesichtsschädeldefekte (Daten nicht gezeigt). Die Bilder wurden bei 96 HPF genommen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53615/53615fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53615/53615fig2.jpg" /> Abbildung 2: Überlebens von 1.000 mg / l Nitrit Behandlung nach unterschiedlichen Zeiten von Messenure. Die Embryonen wurden bei 2 hpf bis 1.000 mg / l Nitrit ausgesetzt. Nitrit wurde nach 46, 70 und 94 h Exposition ausgewaschen, und die Überlebensrate berechnet. Erhöhte Belichtungszeit führte zu einer verringerten Überlebensrate. Die Standardabweichungen: Unbehandelt = 24; 46 h = 6; 70 h = 6; 94 h = 0,9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53615/53615fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/53615/53615fig3.jpg" /> Abb. 3: Überleben nach Exposition gegenüber verschiedenen Nitritkonzentrationen Embryonen wurden für 70 Stunden ausgesetzt Konzentrationen von Nitrit zu erhöhen. Höhere Konzentrationen von Nitrit führte zu einem geringeren Überlebensraten. Nitrat hatte keine Wirkung, selbst bei der höchsten Konzentration von 1000 mg / L nach der Belichtung für 70 Std. Die Standardabweichungen für Nitrit: Unbehandelt = 19; 200 mg / L = 16; 400 mg / L = 21; 600 mg / L = 20; 800mg / L = 14; 1000 mg / L = 12. Die Standardabweichung für Nitrat gleich 4. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53615/53615fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53615/53615fig4.jpg" /> Abb. 4: Auswirkungen auf die Entwicklung von Nitrat und Nitrit Embryos behandelt mit 1000 mg / l Nitrat (Mitte) hatte keinen Effekt im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (oben). Nitrit Behandlung bei 1.000 mg / l ergab Bruttoentwicklungsdefekte in Ergänzung zu ähnlichen Phänotypen in der Ethanol-Behandlung (unten) beobachtet. Bilder bei 120 HPF genommen wurden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53615/53615fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Die Exposition gegenüber Teratogenen kann Geburtsfehler verursachen. Zebrafische sind nützlich für das teratogene Potential von Chemikalien zu bestimmen. Wir zeigen die Nützlichkeit von Zebrafisch-Embryonen durch zu verschiedenen Ebenen von Nitrit und auch zu verschiedenen Zeiten der Belichtung ausgesetzt wird. Wir zeigen, dass Nitrit giftig sein können und schwere Entwicklungsstörungen verursachen.

Zebrafisch als Modell zur Bewertung der teratogene Potenzial von Nitrit

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

zebrafish-as-a-model-to-assess-the-teratogenic-potential-of-nitrite

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

Adverse Drug Effects and Chemical Toxicity

SCIENTISTS IN ACTION

9.4K Aufrufe.  Indiana University of Pennsylvania.  Die Exposition gegenüber Teratogenen kann Geburtsfehler verursachen. Zebrafische sind nützlich für das teratogene Potential von Chemikalien zu bestimmen. Wir zeigen die Nützlichkeit von Zebrafisch-Embryonen durch zu verschiedenen Ebenen von Nitrit und auch zu verschiedenen Zeiten der Belichtung ausgesetzt wird. Wir zeigen, dass Nitrit giftig sein können und schwere Entwicklungsstörungen verursachen. 

Serie: Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Forschung

Medizin

Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae are a preeminent model for the neurobehavioral study of environmental pollutants. Here, a detailed experimental protocol is provided for the evaluation of the neurotoxicity of environmental pollutants using zebrafish larvae, including the collection of the embryos, the exposure process, neurobehavioral indicators, the test process, and data analysis. Also, the culture environment, exposure process, and experimental conditions are discussed to ensure the success of the assay. The protocol has been used in the development of psychopathic drugs, research on environmental neurotoxic pollutants, and can be optimized to make corresponding studies or be helpful for mechanistic studies. The protocol demonstrates a clear operation process for studying neurobehavioral effects on zebrafish larvae and can reveal the effects of various neurotoxic substances or pollutants.

A detailed experimental protocol is presented in this paper for the evaluation of neurobehavioral toxicity of environmental pollutants using a zebrafish larvae model, including the exposure process and tests for neurobehavioral indicators.

Untersuchung neurobehavioraler Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Zebrafischlarven

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae ...

Umwelt

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features of a unique and convenient model system. As highly proliferative cells are more susceptible to radiation-induced DNA damage, zebrafish embryos are a front-line in vivo model in radiation research. In addition, this model projects the effect of radiation and different drugs within a short time, along with major biological events and associated responses. Several cancer studies have used zebrafish, and this protocol is based on the use of radiation modifiers in the context of radiotherapy and cancer. This method can be readily used to validate the effects of different drugs on irradiated and control (non-irradiated) embryos, thus identifying drugs as radio sensitizing or protective drugs. Although this methodology is used in most drug screening experiments, the details of the experiment and the toxicity assessment with the background of X-ray radiation exposure are limited or only briefly addressed, making it difficult to perform. This protocol addresses this issue and discusses the procedure and toxicity evaluation with a detailed illustration. The procedure describes a simple approach for using zebrafish embryos for radiation studies and radiation-based drug screening with much reliability and reproducibility.

The zebrafish has recently been exploited as a model to validate potential radiation modifiers. The present protocol describes the detailed steps to use zebrafish embryos for radiation-based screening experiments and some observational approaches to evaluate the effect of different treatments and radiation.

Zebrafischlarven als Modell zur Bewertung potenzieller Radiosensibilisatoren oder Protektoren

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Krebsforschung

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Biologie

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Akute Nierenverletzung Modell induziert durch Cisplatin bei erwachsenen Zebrafischen

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Verhaltenstestbatterie zur Bewertung neurotoxischer Wirkungen bei adulten Zebrafischen

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autor im Rampenlicht: Bewertung umwelt- und arzneimittelinduzierter Verhaltensänderungen bei adulten Zebrafischen 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

Zebrafisch als Modell zur Bewertung der teratogene Potenzial von Nitrit

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Untersuchung neurobehavioraler Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Zebrafischlarven

Zebrafischlarven als Modell zur Bewertung potenzieller Radiosensibilisatoren oder Protektoren

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Akute Nierenverletzung Modell induziert durch Cisplatin bei erwachsenen Zebrafischen

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank