Name: fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids
Uploaded: 2016-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.

Ethik-Anweisung: Verfahren beteiligt Feld Probenahme und Tier Themen wurden von der Schule für Tier, ländliche und Umweltwissenschaften (ARES) an der Nottingham Trent University genehmigt. 1. Sammlung von Kotproben HINWEIS: sollten Handschuhe getragen werden, wenn Stuhlproben und Umgang mit Methanol. Wenn es einen starken Verdacht, dass ein Tier aus einem Zoonose, Schutzkleidung wie Laborkittel leiden könnten, sollten auch getragen werden. <ol><li> Sammeln Sie die Kotproben so schnell wie möglich (innerhalb von Minuten bis zu einigen Stunden) nach einer Darmentleerung und legen Sie sie in einen Probenbeutel. Dauern drei bis fünf Unterstichproben von jeder defecated Probe mit einem Gesamtgewicht von ca. 10 g. Beschriften Sie die Tasche mit dem Datum und Uhrzeit der Sammlung, individuelle ID und gefrieren die Probe bei -20 ° C bis zur Analyse. </li><li> Zur Minimierung der Fehler, einfrieren alle Proben bei -20 ° C, bis die Studie abgeschlossen ist, die Proben zusammen für die Analyse als eine einzelne Charge dann sammeln. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Fecal Hormon Extraktion <ol><li> Lassen Sie die Kotproben bei RT auftauen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Proben durch manuelles Mischen jede Probe in einem eigenen Probenbeutel homogenisiert werden. </li><li> Für jede Probe in einem Boot dann wiegen auf einer Mikrowaage 0,50 (± 0,003 g) von Fäkalien wiegen übertragen die Fäkalien auf ein 8 ml Glasfläschchen. Verwenden Sie eine neue wiegen Boot für jede Probe und reinigen Sie die Pinzette mit 30% Methanol zwischen jeder Probe. </li><li> Kombinieren Sie die 0,5 g Fäkalien mit 5 ml 90% Methanol: Wasser, und schütteln O / N auf einem Orbitalschüttler bei RT. </li><li> Am nächsten Morgen, Strudel der Probe und dann für 20 Minuten bei 600 g zentrifugiert werden. </li><li> Man dekantiert die Methanolfraktion in eine 16 x 125 mm Glasrohr 2 und in einem Gestell in einem Wasserbad auf eine Temperatur von 37 ° C eingestellt. Dampfe in einem Abzug mit Luft bis zur Trockenheit. Spülen Sie die Extraktion Fläschchen und legen Sie die restlichen fäkalen Pellets in einer klinischen Abfallbeutel zur Entsorgung bringen. </li><li> Re-suspend die Stuhlextrakten in 100%, 1 ml Methanol und Transfer in ein 12 x 75 mm 2 Polypropylenröhrchen. Sofort verschließen und bei -20 ° C bis zur Analyse. </li></ol> 3. Hormonanalyse <ol><li> Führen Sie die Analyse mit einem Enzym Linked-Immunoassay (EIA) polyklonalen Corticosteron CJM006 Antiserum. . HINWEIS: Eine zweite EIA (Cortisol R4866 Antiserum getestet wurde, aber dies konnte die biochemische Validierungsschritt (siehe Abschnitt 4.1) Die polyklonalen Corticosteron CJM006 Antiserum und Cortisol R4866 Antiserum und die jeweilige HRP des von CJ Munro, University of California geliefert werden, zu erreichen, Davis, CA. </li><li> Verdünnen Sie das Antiserum bei 1: 15.000 in Beschichtungspuffer (0,05 M NaHCO3, pH 9,6) eine sich wiederholende Pipette und eine 50 ul Pipettenspitze, legen Sie eine 96-Well Mikrotiterplatte mit 50 &amp; mgr; l / Vertiefung. Die Platte mit Abklebefolie und bebrüten O / N bei 4 ° C. Verlassen zwei Vertiefungen, die nicht-spezifischen Bindungs ​​Vertiefungen darzustellen ungestrichen (NSB). </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch waschen Sie die Mikrotiterplatten fünfmal eine automatisierte Mikrotiterplatte Wascher (Waschlösung, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20). </li><li> Legen Sie die Platten mit 50 &amp; mgr; l pro Vertiefung für die NSB und &quot;Null&quot; Brunnen [EIA - Puffer (0,1 M NaPO 4, 0,149 M NaCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH 7,0) nur], Normen (Corticosteron, 3,9 - 1000 pg / gut) oder Fäkalextrakt Proben (in geeigneter Weise um 1:20 EIA-Puffer verdünnt, siehe Abschnitt 4.1). Standards und Nullen sollten in dreifacher Ausfertigung und vierfacher Ausfertigung, jeweils ausgeführt werden. Verwässertes Fäkalextrakt Proben und NSB sollte doppelt durchgeführt werden. </li><li> Folgen Sie diese sofort mit der Zugabe von 50 &amp; mgr; l / Vertiefung des Etiketts Meerrettichperoxidasekonjugat ᵻ in EIA - Puffer verdünnt auf 1: 70.000. </li><li> Inkubieren der Mikrotiterplatten im Dunkeln für 2 h bei RT. </li><li> Waschen Sie die Mikrotiterplatten mit Waschlösung 5 mal und Inkubation der Platten bei RT im Dunkeln mit 100 ul / well der RT - Substrat [0,4 mM 2,2&#39;-Azino-di- (3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) diammoniumsalz, 1,6 mM H 2 O 2, 0,05 M Citrat, pH 4,0]. Vorbereiten des Substrats unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Verwenden Sie ein Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 405 nm der Mikrotiterplatten zu lesen. Inkubation der Platten wird als vollständig betrachtet, wenn die optische Dichte der Null Vertiefungen 0,8 bis 1,0 erreicht. </li><li> Um sicherzustellen , Wiederholbarkeit, verwenden Kontrollen [EIA - Standards oder einer biologischen Probe , verdünnt in EIA - Puffer bei etwa 30% (EIA - Standard) zu binden, 50% (eine biologische Probe zB Pool von Hauspferd Fäkalextrakt) und 70% (EIA - Standard) ] intra- und inter-Assay-Variationskoeffizienten von &lt;10% und &lt;15% bzw. zu demonstrieren. </li></ol> 4. Enzyme Linked-Immunoassay: Validierung für die Studie Spezies und Sex <ol><li> Biochemische Validation (Parallelism) <ol><li> Mit EIA Puffer, führen Sie eine serielle Verdünnung auf gepoolten fäkale Extract, im Idealfall genommen von Verdacht auf hohe und niedrige Hormonkonzentration Proben von mehreren Personen (Bereich: ordentlich, 1: 2 bis 1: 8192) und auf der EIA laufen, wie in Kapitel 3 beschrieben. ANMERKUNG: Eine Parallelität erreicht betrachtet, wenn die Reihenverdünnungen von Stuhlextrakten eine Verschiebungskurve parallel zu der Standardkurve und der linearen Regressionsergebnisse ergeben zeigen R2&gt; 0,90, eine Steigung&gt; 0,50 und p &lt;0,05. Die serielle verdünnte Fäkalextrakt , die rund 50% auf die Standardkurve bindet sollte die ideale Verdünnung betrachtet werden alle Stuhlextrakten zu laufen (zB 1:20). Es gibt keine Störungen auf den Assay betrachtet, wenn die lineare Regressionsergebnisse zeigen, R2&gt; 0,90 und p &lt;0,05. </li></ol></li><li> Biochemische Validation (Interferenz) <ol><li> Spike 200 &amp; mgr; l seriell verdünnte Standards (Null, 3,9 bis 1000 ng / well Corticosteron) mit 200 ul der entsprechend verdünnten gepoolt Fäkalextrakt [bei 50% verdünnt paralleli bestimmten Bindungsm (1:20)] und laufen auf der EIA wie in Abschnitt 3 EIA Analyseplot Nach der beobachtete Konzentration minus der Hintergrund (Konzentration der Nullprobe) im Vergleich zu der erwarteten Konzentration. HINWEIS: Wenn die Zugabe von verdünnter gepoolt Fäkalextrakt Standards nicht wesentlich ändern , um die Menge zu erwarten und die lineare Regression Ergebnisse liefert R 2&gt; 0,90, eine Steigung nahe bei 1,0 und p &lt;0,05. Keine Interferenz mit der EIA wurde erreicht. </li></ol></li><li> Biologische Validierung: Hinweis: Eine Demonstration , dass die gewählte EIA die Fähigkeit zur Messung der biologisch relevanten Änderungen des Hormons von Interesse hat [zB der Anstieg der Glukokortikoid - Konzentrationen nach einer pharmakologischen (ACTH ist oft ein lizenzierter Verfahren) oder biologische Herausforderung (zB psychologische und / oder Umwelt, eher eine opportunistische unregulierten Ereignis)] zu sein. <ol><li> Wählen Sie, zu extrahieren und zu analysieren Kotproben für Glucocorticoid MetabolitkonzentrationenVerwendung des Verfahrens in Abschnitten ausführlich 1-3 vor und nach einem schwierigen Fall. HINWEIS: Eine anspruchsvolle Veranstaltung artspezifisch sein wird. Ein beispielhaftes Verfahren wird im Folgenden für das Hauspferd zur Verfügung gestellt. Ausführliche Beispiele für anspruchsvolle Veranstaltungen für Pferde wurden zuvor einschließlich der Verwendung von Management - 9 und Haltungsverfahren 16 veröffentlicht. Ein signifikanter Anstieg der Glucocorticoid-Metabolitenkonzentrationen nach dem herausfordernden Ereignis muss anhand einer statistischen Analyse beobachtet und bestätigt werden. Diese müssen über die gegebenenfalls die Wirkung der wiederholten Messungen, Proben Datum und individuell. Biologische Validierung wird angenommen, dann erreicht. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Fecal Corticosteron Analyse stellt ein Mittel zur bei Pferden langfristig Muster der Nebentätigkeit zu beurteilen. Die nicht-invasive Art des Verfahrens überwindet die verwirrende Wirkung anderer Stichprobenverfahren verwendet , um adrenale Aktivität einschließlich Speichel und Plasmaanalyse 9 beurteilen. Darüber hinaus hat die Technik eine klare, nicht-invasive Vorteil, wenn freilaufenden Pferde zu studieren. Es gibt mehrere wichtige Punkte in Bezug auf diese Methode und ihre angemessene Nutzung zu diskutieren. Ein entscheidender Schritt in dem Protokoll ist die Validierung des Tests für die betreffende Art und entsprechende Antikörper Wahl. Wenn der verwendete Antikörper kreuzreagiert mit Metaboliten von strukturell ähnlichen , aber funktionell verschiedene Glucocorticoide könnte diese Ergebnisse durcheinander bringen 17. Deshalb, um Assays Hormonmetaboliten messen eine sorgfältige physiologischen oder biologischen Validierung erforderlich ist , deren Einzelheiten in der Literatur existieren 18,19 und innerhalb des Protokolls Beschribed. Der Zustand der Stuhlprobe muss einschließlich Frische zu betrachten der Probe und der Umweltexposition , die gezeigt wurden , sowohl auf hormonelle Metabolitenspiegel 20 beeinflussen. Übermäßige regen oder Sonnenschein Exposition sind dafür bekannt , steigt zu verursachen oder verringert im Metabolitenkonzentrationen aufgrund von bakteriellen Verstoffwechselung 21. Forscher, die wünschen Proben von unterschiedlichem Grad der Frische zu sammeln, muss die Wirkung der Zeit auf Probenintegrität, zusätzlich zu den Auswirkungen auf die Umwelt zu untersuchen. Dies kann vor der Studie durch die Einrichtung eines kleinen Experiment durchgeführt werden und in regelmäßigen Abständen Kot von männlichen und weiblichen Individuen Abtasten, mit unterschiedlichem Grad der Frische und der Belastung durch Klimavariablen variiert wird. In den meisten Forschungsszenarien Proben von bekannten Personen werden 10 hilfreich oder notwendig sein. In Hauspferde kann dies durch die Überwachung einer Gruppe für den Darm zu entleeren oder mit der aufgenommenen Nahrung Marker-ID erreicht werdenentify Kot von Individuen in größeren Gruppen 12. Im freien Bereich Spezies nachweisen kann dies zeitaufwendig, da individuelle Tracking erforderlich sein wird. Wenn die Methode der Glucocorticoid-Analyse der Auswahl muss berücksichtigt werden, dass die Ergebnisse der fäkalen Corticosteron-Test eine gepoolte Probe über die Zeit eher als ein Zeitpunkt Maßnahme darstellen; Daher wird es weniger Schwankungen in den Daten sein. Wenn die Forscher in langfristigen Auswirkungen einer Situation interessiert ist, Haltung Technik oder Management-Praxis dann fäkale Analyse bietet eine geeignete Technik. Wenn Einschätzung der kurzfristigen Muster in der Hormonkonzentration, die erforderlich ist, dann würde Plasma oder Speichel-Analyse die bevorzugte Methode sein.

Das beschriebene Verfahren Ziele Corticosteron-Konzentrationen in equine Kot, um eine nicht-invasive Beurteilung von adrenalen Aktivität bereitzustellen zu analysieren. Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) Aktivität zu messen, ist ein akzeptierter Ansatz, um die Reaktion auf potenziell aversiven Situationen sowohl in Gefangenschaft und Haustierarten zu untersuchen. Die Referenztechnik und die am weitesten verbreitete Methode ist die Verwendung von Blutplasma 1 jedoch alternative Methoden wie Stuhlanalyse wurden entwickelt, um sich durch Blutentnahme induziert , den Stress zu überwinden und ermöglichen die Fähigkeit , frei lebenden Arten zu überwachen. Während einer aversiven Situation wird physiologische Homöostase gestört. Der Hypothalamus im Gehirn Freisetzungen Releasing Hormon (CRH), Corticotropin, die auf der vorderen Hypophyse wirkt und stimuliert Freisetzung von adrenocorticotropen Hormons (ACTH). ACTH gelangt in den Blutkreislauf und regt die NNR specie absonderns spezifische Glucocorticoide (GC). Glucocorticoide sind eng mit belastenden Ereignissen verknüpft und nicht in allen Energie erhöhte Staaten konsequent produziert deshalb werden sie häufig bevorzugt , gemessen über andere Stress verbunden Hormone 2. Glucocorticoide sind mehrere adaptive Effekte bei Pferden verantwortlich. Energie schnell von Speicherstellen im Körper in Form von Fettsäuren und Glukose mobilisiert wird, wird die Sauerstoffaufnahme erhöht, sensorische Funktion 3 erhöht und der Blutfluss zu den Bereichen verringert nicht erforderlich , für die Bewegung 4. Neben dem Einsatz als Bewältigungsmechanismus wirkt, kann der Stress induzierten Anstieg der Glukokortikoide auch das Tier für die nächste Stressor helfen 5 vorzubereiten. Beurteilung der Hormonspiegel im Plasma und Speichel beinhaltet jedoch die tatsächliche zirkulierenden Hormons Messung der Stoffwechselprodukte in den Faeces Maßnahmen die metabolische Endprodukt des Hormons gemessen wird. Zirkulieren Steroide sind in der l katabolisiertIver vor Ausscheidung in die Galle , wo sie weitere Veränderungen durch die enzymatischen Aktivitäten der Bakterienflora im Darm Spur 6 erleichtert unterziehen. Daher auf Blut Glucocorticoide gerichtet Immunoassays kann nicht für die Analyse von Stuhl Glukokortikoidmetaboliten 7 geeignet sein. Als fäkale Sammlung kann das Pferd ohne Störung durchgeführt werden, die Analyse der Faeces für Corticosteron, umfassend zu überwachen, HPA-Aktivität in einer Reihe von Umständen verwendet wurde. Erhöhte Corticosteron im Kot von Pferden hat als Reaktion auf potenziell aversiven Situationen berichtet worden 9 während der postoperativen Behandlung Veterinär 8 und in restriktiver Gehäuse einschließlich. Fecal Probenahme spiegelt eine gepoolte Glucocorticoid - Ebene im Laufe der Zeit , statt den Zeitpunkt Probenahme von Plasma und Speichel bot es angemessen für die Überwachung der langfristigen machen, chronische oder saisonale Muster 10. Aufgrund der nicht-invasiveNatur des Verfahrens Proben 11 ohne die Notwendigkeit für die Aufnahme oder Rückhalte wiederholt für einen einzelnen gesammelt werden. Allerdings müssen bestimmte Darmtransitzeit Arten berücksichtigt werden, wenn ein Probenahmeprotokoll zu planen. Bei Pferden ist gut Laufzeit ca. 18 Std 12 daher, Neben Reaktion und anschließender Corticosteron - Metaboliten in den Kot einen Tag nach der ersten Aktivierung der HPA - Achse erfasst werden. Wenn nicht-invasive Techniken Immunoassay verwendet eine sorgfältige Validierung für die Spezies untersucht 13 von wesentlicher Bedeutung. Darüber hinaus Geschlechtsunterschiede in der Hormon Ausscheidung der Metaboliten wurden in Stoffwechselrate und die Art des Corticosteron - Metaboliten ausgeschieden in verschiedenen Arten , darunter Mäuse 14 und Hühner 15 aufgrund von Unterschieden berichtet wahrscheinlich ist. Es war daher wichtig, als Teil dieses Verfahrens, daß der Assay für die Verwendung sowohl in männlichen und weiblichen Hauspferde validiert wurde wie detailliert in the Protokoll. Dieser Unterschied in der Hormonmetabolismus zwischen den Geschlechtern hat Konsequenzen für die Datenqualität noch ist es selten als Teil der Assayvalidierung angesprochen und einbezogen. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht langfristige Beurteilung der Nebentätigkeit bei domestizierten Pferden. Die Protokolldetails sowohl die Validierung des Assays und der Assay-Technik selbst.

<table><tbody><tr><td>Corticosterone antibody &amp;amp; HRP kit</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td></tr><tr><td>Cortisol antibody &amp;amp; HRP kit</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td></tr><tr><td>Corticosterone synthetic standard hormone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50-23-7</td><td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Cortisol synthetic standard hormone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15087-01-1</td><td>Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-56-1</td><td>Irritant. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>497-19-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10049-21-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-92-9</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>ABTS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30931-67-0</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 4</td><td>VWR</td><td>332732B</td><td></td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 7</td><td>VWR</td><td>332742D</td><td></td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 10</td><td>VWR</td><td>332762H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td>Irritant. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>BFS-525-010A</td><td></td></tr><tr><td>Air compressor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer +printer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fridge-freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drying apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>+tubing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flammable liquid storagecabinet</td><td>VWR</td><td>649-002</td><td></td></tr><tr><td>Fume cupboard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot-plate stirrer</td><td>VWR</td><td>640-282</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate washer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&amp;reg; pipettes - multipack option 2</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 1,000 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 200 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 20 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette filler</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Progen Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Hilsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water purification system</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Hauspferde (n = 16, 8 Stuten, 8 Wallache) mit einem mittleren Alter von 15 Jahren (± 3) wurden nach Geschlecht gruppiert und zu vier Gehäusebauformen mit zunehmenden sozialen Isolation unterworfen (n = 4 Pferd / Behandlung). Das Gehäuse 1 beteiligt Pferde in einer Herde Umgebung leben, eng ihrem natürlichen Lebensraum zu simulieren. Das Gehäuse 2 beteiligt Pferde paarweise in einer Indoor-Scheune leben. Das Gehäuse 3 beteiligten Pferde allein in Ställen untergebracht, aber mit Sichtkontakt zu anderen Pferden und Gehäuse 4 beteiligt totale Isolation der Pferde. Exposition gegenüber jeder Behandlung wurde in einer randomisierten Blockdesign für einen Zeitraum von fünf Tagen. Im Anschluss an diese die Pferde wurden in Gras Paddocks in ihren experimentellen Gruppen für zwei Tage vor der Exposition gegenüber der Behandlung nächsten Gehäuse herausstellte. Kotproben wurden an den Tagen einmal pro Tag gesammelt 1, 2 und 3 in jedem Gehäuse Behandlung von n = 8 Pferde ausgegeben (n = 2 Pferde innerhalb jeder Behandlung). Kotproben wurden so schnell wie möglich und innerhalb von 1 h nach der Defäkation gesammelt. Alle Proben wurden nach 1200 Stunden auf dem ersten vollen Tag der Stallung Bedeutung gesammelt, dass die erste Probe am ersten Tag mindestens 20 Stunden gesammelt wurde, nachdem das Pferd mit dem Gehäuse Behandlung eingeführt wurde. Die Proben von Tag eins, zwei und drei (insgesamt 24 Proben pro Gehäusedesign) wurden für die fäkale Corticosteron Ebenen reflektiert die letzten 18 Stunden beurteilt aufgrund Durchtrittsgeschwindigkeit von Digesta 12. Die gleichen einzelnen Pferde wurden für fäkale Analysen während der gesamten Studie verwendet. Für vollständige Details dieser biologischen Herausforderung, einschließlich zusätzlicher Messgrößen finden Sie in den veröffentlichten Arbeiten 9 Alternative Beispiele für anspruchsvolle Veranstaltungen für Hauspferde können auch in der Literatur 16 zu finden. Dieser Abschnitt enthält Beispiel Ergebnisse einer biochemischen Validierung (Parallelität) für beide corticosterone und Cortisol bei männlichen und weiblichen Hauspferd Kot. Dieser Abschnitt enthält auch repräsentative Daten aus fäkalen Extraktion und EIA-Analyse erhalten. Die Ergebnisse wurden im Rahmen einer größeren Studie erhalten, die die Auswirkungen der sozialen Isolation , die durch Gehäusedesign untersucht, bei der Pferde-Verhalten und Physiologie 9. Die Ergebnisse der biochemischen Validierung ergab , dass die Corticosteron EIA adrenale Aktivität zu messen [1A männlichen Probe% Bindung = 25,349 + 0,729 (Standard% Bindung), R2 = 0,9545, F (1, 7) = 146,710, p weniger geeignet war als 0,001); 1B weibliche Probe% Bindung = 29,989 + 0,7198 (Standard% Bindung), R2 = 0,95594, F (1, 7) = 151,865, p weniger als 0,001] , aber nicht das Cortisol EIA [1C männlichen Probe% Bindung = 79,089 + 0,0629 (Standard% Bindung), R2 = 0,175, F (1, 7) = 1,485, p = 0,262); 1D weibliche Probe% Bindung = 81,652 + 0,0772 (Standard% Bindung), R2 = 0,257, F (1, 7) = 2,422, p = 0,164]. Da die Corticosteron EIA Parallelität im Gegensatz zu den Cortisol EIA und Störprüfung auf der Corticosteron demonstriert ergab EIA keine Hinweise auf eine Matrix Interferenz als Zugabe von verdünnter fäkal-Extrakt zu Corticosteron-Standards hat den Betrag nicht ändern erwartet (männlich: Beobachtete = 1,302 + 1,017 (Erwartete) R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, p &lt;0,001; weiblich: Beobachtete = 0,3169 + 1,0931 (voraussichtlich), R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, p &lt;0,001;). Die Ergebnisse der EIA ergab , dass es keinen signifikanten Unterschied in Corticosteron Ebenen zwischen männlichen Pferden (M = 37,7, SD = 14.1) und weibliche Pferde (M = 33,8, SD = 12,7; t (70) = 1,23, p = 0,22) . Die Höhe der fäkalen Corticosteron erhöht als die Höhe der Isolation erhöht. Isolierte Pferde (Gehäusedesign 4) hatten eine signifikant hoheer Niveaus des fäkalen Corticosteron im Vergleich zu allen anderen Gehäusebauformen (Wilks Lambda = 0,58, F (3, 18) = 4,29, p = 0,01, multivariate Teil eta Quadrat = 0,42; p ≤0.02). Die Höhe der fäkalen Corticosteron höher war für alle Pferde, die auf allen drei Testtage während der am stärksten isolierten Gehäuse, wenn zu den anderen Gehäuse Behandlungen verglichen. Die Konzentrationen der mittlere fäkale Corticosteron für jede Gehäusedesign für jeden Tag sind in Tabelle 1 dargestellt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53479/53479fig1.jpg" /> Abbildung 1. Biochemische Validation (Parallelism) eines Corticosteron und Cortisol Enzyme Linked-Immunoassay für männliche und weibliche Pferde. Diese Zahl beschreibt die Prozent der seriellen verdünnten Pools von männlichen Bindung und weibliche Hauspferd Stuhlextrakten gegen steigende Corticosteron und Cortisol Standardkurve Konzentrationen auf eine UVP. Die Ergebnisse zeigen, dass dieCorticosteron (A, männlich, B, weiblich) und nicht die Cortisol EIA (C, männlich, D, weiblich). ergab eine erfolgreiche Verlagerungskurve parallel mit der EIA Standardkurve Corticosteron <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53479/53479fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53479/53479fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table><tbody><tr><td rowspan="3"></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> MEAN (± SD) FÄKALE Corticosteron (ng / g) in jedem Gehäuse BEHANDLUNG </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> WOHNUNGS BEHANDLUNG </td><td> Tag 1 </td><td> Tag 2 </td><td> Tag 3 </td><td> INSGESAMT </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 31,73 ± 10,2 </td><td> 32.18 ± 8.0 </td><td> 29.22 ± 5.9 </td><td> 31.05 ± 7.8 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32,75 ± 10,0 </td><td> 33,66 ± 12,9 </td><td> 34.67 ± 9.3 </td><td> 33,69 ± 10,3 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 35.06 ± 14,6 </td><td> 35,14 ± 15,9 </td><td> 33,13 ± 12,5 </td><td> 34,44 ± 13,6 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td><td> * </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 38,16 ± 17,8 </td><td> 42.00 ± 16,7 </td><td> 41,52 ± 17,6 </td><td> 40,56 ± 16,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 : Mittlere (± SD) Fecal Corticosteron (ng / g) für jedes Gehäuse Behandlung für Days Eins, Zwei und Drei und mittlere Fecal Corticosteron (ng / g) für alle drei Tage (Overall) in jedem Gehäuse Behandlung. Diese Tabelle zeigt die Mittelwerte für fäkale Corticosteron (ng / g) ± Standardabweichung für jede der Gehäusebehandlungen während des Tages ein, zwei und drei. Die Proben wurden mindestens 20 Stunden gesammelt, nachdem Pferde das Gehäuse eingetragen. Es zeigt auch, mittlere fäkale Corticosteron (ng / g) ± Standardabweichung für alle drei Tage (insgesamt) in jedem Gehäuse Behandlung. Die fäkale Corticosteron KonzentratIon war signifikant höher (*) während der isolierten Gehäuse-Design. Die niedrigste Konzentration von fäkalen Corticosteron für alle Tage in der Gruppe untergebracht Behandlung (Behandlung 1). Angepasst von Yarnell et al. (2015), mit freundlicher Genehmigung der Zeitschrift für Physiologie und Verhalten.

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Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Aufrufe.  Nottingham Trent University. Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Serie: Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Systematic Assessment of Well-Being in Mice for Procedures Using General Anesthesia

In keeping with the 3R Principle (Replacement, Reduction, Refinement) developed by Russel and Burch, scientific research should use alternatives to animal experimentation whenever possible. When there is no alternative to animal experimentation, the total number of laboratory animals used should be the minimum needed to obtain valuable data. Moreover, appropriate refinement measures should be applied to minimize pain, suffering, and distress accompanying the experimental procedure. The categories used to classify the degree of pain, suffering, and distress are non-recovery, mild, moderate, or severe (EU Directive 2010/63). To determine which categories apply in individual cases, it is crucial to use scientifically sound tools.
The well-being-assessment protocol presented here is designed for procedures during which general anesthesia is used. The protocol focuses on home cage activity, the Mouse Grimace Scale, and luxury behaviors such as burrowing and nest building behavior as indicators of well-being. It also uses the free exploratory paradigm for trait anxiety-related behavior. Fecal corticosterone metabolites as indicators of acute stress are measured over the 24-h post-anesthetic period.
The protocol provides scientifically solid information on the well-being of mice following general anesthesia. Due to its simplicity, the protocol can easily be adapted and integrated in a planned study. Although it does not provide a scale to classify distress in categories according to the EU Directive 2010/63, it can help researchers estimate the degree of severity of a procedure using scientifically sound data. It provides a way to improve the assessment of well-being in a scientific, animal-centered manner.

We developed a protocol to assess well-being in mice during procedures using general anesthesia. A series of behavioral parameters indicating levels of well-being as well as glucocorticoid metabolites were analyzed. The protocol can serve as a general aid to estimate the degree of severity in a scientific, animal-centered manner.

Systematische Bewertung des Wohlbefindens bei Mäusen für Verfahren mit Vollnarkose

In keeping with the 3R Principle (Replacement, Reduction, Refinement) developed by Russel and Burch, scientific research should use alternatives to animal ...

Forschung

Verhalten

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial species, the koala (Phascolarctos cinereus), faces prolonged exposure to anthropogenic-induced stressors and assessment of chronic stress in wild populations is urgently warranted. One of the most effective ways to measure chronic stress is through analyzing the glucocorticoid hormone cortisol in hair or fur, as it supports physiological and behavioral responses. This laboratory validation study aims to test current techniques to validate an optimal hormone extraction method to be used as a non-invasive measure of cortisol in koala fur. It is recognized that using non-invasive techniques to measure stress hormones is preferred over traditional, invasive techniques due to their ideal practical and ethical standpoints. Additionally, it is comparatively easier to acquire fur from koalas than it is to acquire samples of their blood. This study used samples of koala fur acquired from the Adelaide Koala and Wildlife Hospital to run a number of hormone extraction techniques in an attempt to validate an optimal cortisol extraction method. Results showed that 100% methanol provided the most optimal solvent extraction compared to 100% ethanol or 100% isopropanol based on parallelism results. In conclusion, this method of cortisol extraction from koala fur provided a reliable non-invasive assay that could be used to study chronic stress in koalas.

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

We present a protocol to determine the optimal extraction solvent to measure cortisol from koala fur. The solvents used in this protocol are methanol, ethanol and isopropanol. Determining an optimal extraction solvent will aid in reliably measuring fur to determine the impact of chronic stress on koalas.

Cortisol Messung in Koala (Phascolarctos cinereus) Pelz

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Biochemie

A Cross-Disciplinary and Multi-Modal Experimental Design for Studying Near-Real-Time Authentic Examination Experiences

Over the past ten years, research into students&#39; emotions in educational environments has increased. Although researchers have called for more studies that rely on objective measures of emotional experience, limitations on utilizing multi-modal data sources exist. Studies of emotion and emotional regulation in classrooms traditionally rely on survey instruments, experience-sampling, artifacts, interviews, or observational procedures. These methods, while valuable, are mainly&#160;dependent on participant or observer subjectivity and is limited in its authentic measurement of students&#39; real-time performance to a classroom activity or task. The latter, in particular, poses a stumbling block to many scholars seeking to objectively measure emotions and other related measures in the classroom, in real-time.
The purpose of this work is to present a protocol to experimentally study students&#39; real-time responses to exam experiences during an authentic assessment situation. For this, a team of educational psychologists, engineers, and engineering education researchers designed an experimental protocol that retained the limits required for accurate physiological sensor measurement, best-practices of salivary collection, and an authentic testing environment. In particular, existing studies that rely on physiological sensors are conducted in experimental environments that are disconnected from educational settings (e.g., Trier Stress Test), detached in time (e.g., before or after a task), or introduce analysis error (e.g., use of sensors in environments where students are likely to move). This limits our understanding of students&#39; real-time responses to classroom activities and tasks. Furthermore, recent research has called for more considerations to be covered around issues of recruitment, replicability, validity, setups, data cleaning, preliminary analysis, and particular&#160;circumstances (e.g., adding a variable in the experimental design) in academic emotions research that relies on multi-modal approaches.

An experimental design was developed to investigate the real-time influences of an examination experience to assess the emotional realities students experience in higher education settings and tasks. This design is the result of a cross-disciplinary (e.g., educational psychology, biology, physiology, engineering) and multi-modal (e.g., salivary markers, surveys, electrodermal sensor) approach.

Ein fachübergreifendes und multimodales Experimentelles Design zum Studium authentischer Prüfungserfahrungen in naher Echtzeitzeit

Over the past ten years, research into students&#39; emotions in educational environments has increased. Although researchers have called for more studies ...

Providing Meaningful Environmental Enrichment and Measuring Saliva Cortisol in Pigs Housed on Slatted Flooring

As pork is the most consumed meat worldwide, the welfare of animals in the swine industry has increasingly become a major public concern, which imposes a substantial pressure coming from customers, legislators and other stakeholders, to make management changes to improve the well-being of these animals. Several studies have demonstrated that providing environmental enrichment to pigs allows them to express their natural behavior, such as rooting and exploring, as well as nesting prior to farrowing, and is associated with reduced stress and improved production and welfare. However, many considerations should be taken into account when providing environmental enrichment, such as the type of floor, drainage and sewage systems, the pigs&#39; stage in life, the material, as well as its hanging method, height and location within the pen. The objectives of this paper are (1) to give methodologic information on how to provide a relatively simple and practical meaningful environmental enrichment for pigs which are housed on slatted floors during the different stages of their life, and (2) to demonstrate how to collect saliva samples for the measurement of cortisol concentrations, as a biomarker for acute stress. Protocols include information regarding the use of jute, cotton ropes, straw in racks, as well as chewable silicone sticks devices as environmental enrichment in pens of farrowing and lactation, weaners and finishers. In addition, the use of cotton rope for a non-invasive saliva samples collection for cortisol concentrations analysis is detailed. The protocols provided are relevant for professionals aiming to improve and monitor animal welfare, in both research and industrial swine farming.

This protocol demonstrates how to provide practical meaningful environmental enrichment for pigs which are housed on slatted flooring during the different stages of their lives, and how to collect saliva samples in a non-invasive manner for the measurement of cortisol concentrations, as a biomarker for acute stress.

Bereitstellung einer sinnvollen Umweltanreicherung und Messung von Speichel-Cortisol in Schweinen, die auf Lattenrost untergebracht sind

As pork is the most consumed meat worldwide, the welfare of animals in the swine industry has increasingly become a major public concern, which imposes a ...

Thermal Imaging to Study Stress Non-invasively in Unrestrained Birds

Stress, a central concept in biology, describes a suite of emergency responses to challenges. Among other responses, stress leads to a change in blood flow that results in a net influx of blood to key organs and an increase in core temperature. This stress-induced hyperthermia is used to assess stress. However, measuring core temperature is invasive. As blood flow is redirected to the core, the periphery of the body can cool. This paper describes a protocol where peripheral body temperature is measured non-invasively in wild blue tits (Cyanistes caeruleus) using infrared thermography. In the field we created a set-up bringing the birds to an ideal position in front of the camera by using a baited box. The camera takes a short thermal video recording of the undisturbed bird before applying a mild stressor (closing the box and therefore capturing the bird), and the bird&#8217;s response to being trapped is recorded. The bare skin of the eye-region is the warmest area in the image. This allows an automated extraction of the maximum eye-region temperature from each image frame, followed by further steps of manual data filtering removing the most common sources of errors (motion blur, blinking). This protocol provides a time series of eye-region temperature with a fine temporal resolution that allows us to study the dynamics of the stress response non-invasively. Further work needs to demonstrate the usefulness of the method to assess stress, for instance to investigate whether eye-region temperature response is proportional to the strength of the stressor. If this can be confirmed, it will provide a valuable alternative method of stress assessment in animals and will be useful to a wide range of researchers from ecologists, conservation biologists, physiologists to animal welfare researchers.

There is a need for a non-invasive assessment of stress. This paper describes a simple protocol using thermal imaging to detect a significant response in eye-region temperature in wild blue tits to a mild acute stressor.

Wärmebild um Stress-nicht-invasiv in Hemmungslose Birds Studieren

Stress, a central concept in biology, describes a suite of emergency responses to challenges. Among other responses, stress leads to a change in blood ...

Neurowissenschaften

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Transkutane Beurteilung der Nierenfunktion in Conscious Nagetiere

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Medizin

A Novel Method: Super-selective Adrenal Venous Sampling

Primary aldosteronism (PA) and subclinical Cushing&#39;s syndrome (SCS) are conditions in which the adrenal glands autonomously produce excessive amounts of aldosterone and cortisol, respectively. The conventional adrenal venous sampling (cAVS) method collects blood samples from both adrenal central veins and is useful for identifying the laterality of excess hormone production in a unilateral lesion(s), as documented in PA cases. In cAVS, plasma cortisol concentrations (PCCs) are used to normalize plasma aldosterone concentrations (PACs). A novel &#34;super-selective&#34; adrenal venous sampling (ssAVS) method was developed using a micro-catheter, which collects blood samples from adrenal tributary veins (TVs). PACs in ssAVS samples do not require PCC normalization because samples contain a limited amount of systemic venous blood, if any. The ssAVS method enabled segmental lesion(s) to be detected in both adrenal glands, which may be treated by bilateral adrenalectomy, thereby sparing lesion-free segment(s). Right and left adrenals typically have three TVs each, i.e., the superior, lateral, and inferior TVs in the right adrenal as well as the superior-median, superior-lateral, and lateral TVs in the left adrenal. In the ssAVS method, specific parent catheters and a technique to handle them are required, and have been described herein. Furthermore, ssAVS results from three cases of PA are presented: bilateral aldosterone-producing adenoma (APA) (Case #1), left APA and right possible cortisol-producing adenoma causing SCS (Case #2), and idiopathic hyperaldosteronism in which bilateral adrenal segments produced excessive amounts of aldosterone (Case #3). The ssAVS method is not difficult for expert angiographers, and, thus, is recommended worldwide to treat PA cases for which cAVS does not represent a viable surgical treatment option.

&#39;Super-selective&#39; adrenal venous sampling (ssAVS, also called segmental adrenal venous sampling: sAVS)&#160;was performed using a micro-catheter to identify adrenal segment(s) that produce excessive amounts of hormones. The ssAVS technique was described, cases in which adrenal segmental lesion(s) were identified by ssAVS were presented, and the usefulness of ssAVS in future adrenal research was discussed.

Eine neuartige Methode: Super-selektiven Nebennieren venösen Sampling

Primary aldosteronism (PA) and subclinical Cushing&#39;s syndrome (SCS) are conditions in which the adrenal glands autonomously produce excessive amounts ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Eine Stoff Screening Verfahren für die Glucocorticoid-Signalisierung mit einem Zebrafisch-Larve Luciferase-Reportersystems

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Biologie

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extraktion und Analyse von Cortisol aus Menschen-und Affen-Haar

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Primärkultur von Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen und Assays Steroidogenic Funktionen

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...