Name: validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
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Die Autoren danken den Mitarbeitern der Morphologie und Imaging-Kern, der Molekulargenetik Kern (Abteilung für Augenheilkunde und Visual Sciences) und der Mausgenetik Kern an der Washington University in St. Louis School of Medicine. Die Autoren werden von der kleinen Zuschuss-Programm von der McDonnell Zentrum für Zelluläre und Molekulare Neurobiologie, der Hoffnung Zentrum für Neurologische Störungen unterstützt das National Eye Institute (# R01EY022632 zu DH), ein National Eye Institute zentralen Kern Grant (# P30EY002687) und eine zweckgebundene Zuwendung der Forschung, um Blindheit zu der Augenklinik und Visual Sciences verhindern.

Ethics Statement: Verfahren, die Tierversuchspersonen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Washington University in St. Louis genehmigt. 1. Mauszucht und Genotypisierung <ol><li> Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäusen, die mit Tg (PCP2-Cre) Mäuse Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 zu erzeugen. Anmerkung: Während der Rest dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung der Tg (PCP2-Cre) Mauslinie zu EGFP-KASH2 Ausdruck Purkinje Zellen innerhalb des Kleinhirns zu beschränken, kann ein ähnliches Verfahren mit einer anderen Tg (Cre) Maus verfolgt werden ( Abbildung 2a). </li><li> Führen Genotypisierung um Welpen beherbergen beide EGFP und Cre-Transgene, wie zuvor beschrieben 19 zu identifizieren. </li></ol> 2. Vorbereitung der Materialien für die Präparation und Gewebeentnahme <ol><li> Bereiten Sie 100 ml 30% Saccharose in PBS (30 g Saccharose / 100 ml 1x PBS) und bei -20 ° C. Der Tag der Gewebe hie Ernte, Tauwetter und Last ~ 30-35 ml Saccharose-Lösung in einen 35-ml-Spritze für transkardialer Infusionen. </li><li> Vorbereitung 40 ml von 4% PFA in PBS (10 ml 16% igem Paraformaldehyd und 30 ml PBS). Last ~ 30-35 ml 4% PFA in eine 35 ml-Spritze zur transkardialer Perfusionen. </li><li> Füllen Sie einen 10 cm-Gewebekulturplatte mit 10 ml PBS für Gewebedissektion. </li><li> Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin-Cocktail, bestehend aus 16 mg / ml Ketamin und 3 mg / ml Xylazin. </li><li> Eine Lösung aus 70% Ethanol für die Präparation. </li></ol> 3. Dissection und Gewebeentnahme <ol><li> Unter Verwendung einer 1 ml Spritze injizieren 500 ul des Ketamin / Xylazin Cocktail pro 25 Gramm Körpergewicht, und warten Sie ca. 15 min. Alternativ verwenden Sie einen anderen institutionell genehmigten Sedierung Methode, die für das biologische System von Interesse geeignet ist. </li><li> Nach Sedierung, sanft Prise die Hinterpfote, den Mangel an Schmerzreaktion zu bestätigen, stecken alle Pfoten auf einem Styropor-Fach mit der Rückenseite desMaus nach unten. </li><li> Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und einen Einschnitt von den Unterbauch an die Spitze des Brustkorbs, um Zugang zum Herzen zu gewinnen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens und legen Sie die Spritze mit der 30% igen Zuckerlösung in den linken Ventrikel des Herzens. </li><li> Perfusion der Lösung bei einer Rate von ~ 2-5 ml pro min. Wenn leer, entfernen Sie die Spritze und wiederholen Sie mit der 4% PFA-Lösung. </li><li> Unpin die Maus vom Styroporbehälter und zu enthaupten, um das Gehirn zu gelangen. </li><li> Entfernen Sie die Haut um den Kopf des Tieres mit einer Pinzette und Schere. Poke ein Loch in den hinteren Teil des Schädels mit einer Nadel und entfernen Sie vorsichtig den Schädel mit Schere und Pinzette. </li><li> Sobald das Gehirn ist eindeutig erreichbar, verwenden Pinzette, um das Kleinhirn zu entfernen und legen Sie sie in PBS. Halbieren das Kleinhirn in der Sagittalebene mit einem Skalpell und übertragen, die 30% Saccharose-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Um prepsind Paraffinschnitten, beheben das Kleinhirn über Nacht bei 4 ° C in 4% PFA vor Gewebeeinbettung und Schnitte. </li></ol> 4. Gewebeverarbeitung und Schnitte <ol><li> Bereiten einer Aufschlämmung aus Trockeneis und 2-Methylbutan. Dass die Temperatur des Bades während 5 min sich ausgleichen lassen. </li><li> Füllen Sie eine cryomold mit OCT-Verbindung und legen Sie eine Hälfte des zweigeteilten Kleinhirn in die Form. </li><li> Mit Hilfe eines Binokular und einer Pinzette Position das Kleinhirn, so dass der zweigeteilten Oberfläche (in der Nähe der Mittellinie des Kleinhirns) nach oben zeigt. </li><li> Übertragen Sie die cryomold auf die Trocken Eisbrei für 5 Minuten, bis der OCT-Verbindung hat eine solide weißen Matrix um die Gewebeprobe gebildet. Anmerkung: Die gefrorene Probe kann nun bei -20 ° C, wenn erforderlich, gespeichert. </li><li> Etikett vorbehandelt Polylysin Folien zum Sammeln von Gewebeschnitten und bereiten den Kryostaten gemß den Anweisungen des Herstellers, um 15 um Abschnitte des cere sammelnbellum. Um die Abschnitte zu sammeln, vorsichtig an den Oktober Abschnitt mit dem Poly-Lysin-beschichtete Seite der Folie. Um die Ausrichtung des Abschnitts zu erhalten, müssen Sie die Folie während dieses Schritts nicht drehen. </li><li> Shop Gewebeschnitte bei -20 ° C, bis mit der Färbung und Imaging fortfahren. </li></ol> 5. Die Färbung und Imaging von Kleinhirn Sections <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor der Gewebefärbung: ~ 50 ml PBS ~ 5-10 ml von 4% PFA in PBS ~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS </li><li> Thaw Kleinhirnschnitten. Wichtig ist, zu minimieren, ihre Exposition gegenüber einer beliebigen Quelle von kontinuierlichen und intensiven Licht, um Verblassen der EGFP verhindern. </li><li> Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift, ein Rechteck um den Gewebeschnitten. </li><li> Post-fix die Abschnitte mit 4% PFA für 5 min. Verwenden Sie ausreichend Flüssigkeit, um den gesamten Bereich von der hydrophobe Barriere (in der Regel ~ 500 ul) abgegrenzt decken. Mit Hilfe eines Vakuum oder Pipette wiederbewegen das Fixiermittel besonders achten, dass die Gewebeschnitte stören. </li><li> Mit einer Pipette vorsichtig anzuwenden PBS auf der Folie, ohne die Gewebeschnitte zu stören. Nach 5 min verwenden das Vakuum oder Pipette vorsichtig die Flüssigkeit. Wiederholen Sie die PBS spülen insgesamt dreimal. </li><li> Verwendung einer Pipette vorsichtig Die geeignete Verdünnung von primären Antikörpern (3 ul Calbindin und / oder Nesprin2 Antikörper pro 900 Mikroliter Lösung) in 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS gelten. Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anmerkung: EGFP-KASH2 wird durch direkte Fluoreszenz-Mikroskopie auf Gefrierschnitten sichtbar und es ist nicht notwendig, um eine Anti-EGFP-Antikörper zu verwenden. Wenn Paraffinschnitte wurden hergestellt, Imaging von EGFP-KASH2 erfordert jedoch Immunodetektion mit einem Anti-EGFP-Antikörper. </li><li> Entfernen Sie die Antikörperlösung und spülen Sie mit PBS dreimal. </li><li> Vorbereitung 1: 1000 Verdünnungen von Alexa-Fluor sekundären Antikörper in 0,5% Triton X-100,10% Eselserum in PBS und lagern in der Dunkelheit. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die endgültige PBS spülen und wenden Sie die Sekundärantikörperverdünnung für eine Stunde im Dunkeln. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung, spülen und waschen Sie den Abschnitt dreimal. Falls erforderlich, tragen Sie eine Kernfärbung, wie DAPI (~ 300 nM), während der ersten PBS-Anwendung. </li><li> Vollständig zu entfernen, die PBS-Lösung, um von der Gewebe und Ort ~ 5-7 &amp; mgr; l Montagetechnik auf dem Gewebeschnitt. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Gewebeschnitts und beiseite stellen für ~ 15-30 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit eingestellt. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtern ausgestattet, um EGFP und alle anderen für die Sekundärantikörper in den Schritten 5.8 / 5.9 verwendet geeigneten Wellenlängen zu visualisieren. In Kleinhirnscheiben, mit einem 20x-Objektiv an EGFP-KASH2 Kern Felgen anzuzeigen. </li></ol>

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J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina.">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180 (2012).</li><li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis.">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der wichtigste Schritt, um erfolgreich zu studieren die Rolle des LINC-Komplexe in vivo unter Verwendung der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Modell ist, um eine geeignete Cre Mauslinie (n) zu identifizieren. In der Tat, wenn Cre ist in anderen Zelltypen in ähnlicher Wegen beteiligt aktiv, es kann die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Daher ist es wichtig, in der Nähe von Zellen zu untersuchen, wie hier in der molekularen und Körnerzellschicht des Cerebellums (2B) dargestellt. Ebenso ist es, um alle physiologisch relevanten Phänotypen maximieren wichtig, eine Cre-Stamm mit der weit verbreiteten Cre Expression über den interessierenden Zelltyp zu identifizieren. Es ist auch wichtig, um eine eingehende Charakterisierung der Expressionsmuster von LINC komplexe Bauteile während der Entwicklung des Systems von Interesse durchzuführen. Tatsächlich ist ein Nachteil der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell, dass es keine Informationen darüber, welche Proteine ​​oder Sun Nesprine Varianten sind in biologischem System under Überlegung. Allerdings kann dieses Problem durch Durchführung einer strengen Charakterisierung sowohl auf Transkript und Protein-Ebene überwunden werden. In der Tat haben solche Untersuchungen bei mehreren Gelegenheiten, die während der Entwicklung des ZNS, um wichtige Erkenntnisse über die Rolle von spezifischen LINC komplexen Bauteilen geführt und Homöostase 21,22 unternommen. Schließlich, während dieses Protokoll beruht auf der Verwendung von festen ZNS-Gewebe fokussiert können Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäuse verwendet werden, zu isolieren und Kultur primären Zellen, um die Wirkung der Störung LINC-Komplexe in vitro zu studieren. Unter Verwendung dieses Schemas ist es möglich, die Isolierung und Reinigung von Primärkulturen von EGFP-KASH2 positive Zellen für Anwendungen wie Zeitraffervideomikroskopie. Dies umgeht geringen Transfektionseffizienzen oder lentiviralen Produktion für Primärkultur-Systeme erforderlich, wie Neuronen. Zusammenfassend eröffnen die Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäusen, neue und spannende Möglichkeiten, um den Spaß zu studierenRésol des LINC-Komplexen in vivo während der embryonalen und postnatalen Säuger Entwicklungsvorgänge in einer Vielzahl von Geweben und Zelltypen zu grundlegenden Zellbiologie Fragen anzugehen.

Die Kernhülle (NE) trennt das Kernplasma aus dem Zytoplasma. Es besteht aus einem inneren und äußeren Kernmembran (INM und ONM, respectively), die an Kernporen verbinden zusammen. Das Lumen von beiden Membranen abgegrenzt wird als perinukleären Raum (PNS). Die ONM ist eine Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der INM haftet an der Lamina, um ein Maschenwerk des Typs V-Atom Intermediärfilamente von A- und B-Typ dargestellt Lamine 1,2. Linker der Nucleoskeleton und Zytoskelett (LINC) -Komplexe sind makromolekularer Komplexe, die die gesamte Kernhülle überspannen kann, um das Innere des Kerns physikalisch verbinden Zytoskelettfilamenten und molekularen Motoren (1A). Sie bestehen aus Wechselwirkungen zwischen evolutionär konservierte Motive, die zwei Familien von integralen Transmembranproteine ​​des NE charakterisieren: Sun (SAD1 / Unc84) Proteine ​​und Nesprine (Nuclear Envelope Spek). Bei Säugetieren Sun1 und Sun2 are Transmembranproteine ​​des INM, deren N-terminale nukleoplasmatischen Region interagiert direkt mit A- und B-Typ Lamine 3-5. Auf der anderen Seite des INM, im PNS, Hafen Sun Proteine ​​einen evolutionären konserviert Strecke von ~ 150 C-terminalen Aminosäuren genannt SUN-Domäne. SUN Domänen interagieren direkt mit dem evolutionären konserviert KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne Homologie) -Domäne, die molekulare Signatur der Nesprine. KASH Domänen bestehen aus einer Strecke von ca. 30 C-terminalen Aminosäuren, die in die PNS, gefolgt von einer Transmembran-Domäne 6 ragt. Mindestens vier verschiedene Nesprin Gene (Nesprin1-4) kodieren KASH haltige Proteine, die an der NE 7 lokalisieren. Die zytoplasmatischen Regionen Nesprine, deren Größen variieren von ~ 50 kDa (Nesprin4) zu einer erstaunlichen 1.000 kDa (Nesprin1 giant) enthalten mehrere Spektrin wiederholt sowie spezifische Motive, damit ihre Wechselwirkung mit Zytoskelett-Komponenten, wie beispielsweise Actin, plectin und molekularen Motoren 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Studium in Wirbeltieren und wirbellosen Tieren haben gezeigt, dass Lamin / Sun / Nesprin / molekulare Motoren stellen eine evolutionär konservierte &quot;Achse&quot; Steuerung Kern Migration und Verankerung. Einige Knock-out (KO) Maus-Modellen der LINC komplexe Bauteile wurden beschrieben und waren maßgeblich an der Schaffung eines Rahmens, um die Rolle von Sun und Nesprin Proteine ​​an der NE während der Entwicklung von Säugetieren 9,14,15 zu verstehen. Allerdings sind diese Modelle weisen mehrere signifikante Nachteile auf, insbesondere: 1) Schwierigkeiten bei der Interpretation Phänotypen aufgrund der nicht autonomen Effekte, 2) Schwierigkeiten bei der Unterscheidung der phänotypischen Beitrag von Zell KASH haltigen vs. KASH losen Nesprin Isoformen 16, 3) die funktionelle Redundanz von Sonne und Nesprin Proteine ​​an der NE in zahlreichen Zelltypen erfordert komplexe Zuchtprogramme, alle SUN-KASH Wechselwirkungen bei Mäusen 17 und 4) die perinatale Sterblichkeit von Mäusen mangelhaft für die KASH-Domäne sowohl inaktivierenNesprins1 und 2 schließt die Analyse der Erwachsenen Phänotypen 18. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Mausmodell entwickelt, um alle SUN-KASH Wechselwirkungen in vivo stören, in einer Zelle autonom und entwicklungsregulierter Weise umgehen somit viele der oben beschriebenen Nachteile. Diese Cre / lox-basierten Mäusemodell beruht auf zwei wichtige Konzepte: 1) die KASH Domäne von irgendeinem bekannten Nesprin Protein ausreicht, um EGFP auf die NE in Zellkultursystemen Ziel und 2) Sonnendomänen interagieren promiscuously mit KASH Bereichen, wodurch eine Überexpression von beliebige KASH Domäne werden alle endogenen SUN Domänen zu sättigen und zu inaktivieren LINC-Komplexe in einer dominant-negative Art und Weise 17 (1B). Dieses Protokoll beschreibt Gewebe Ernte- und Verarbeitungsschritte verwendet werden, um die Störung aller SUN-KASH Wechselwirkungen im Kleinhirn-Purkinje-Zellen bestätigen.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Adhesion Slides</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin Antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Antibody</td><td></td><td></td><td>Previously described in Ref. 21</td></tr><tr><td>Fluorescent Mounting Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Dieses Protokoll zeigt die Nützlichkeit der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell EGFP-KASH2 Ausdruck cerebellar Purkinje-Zellen unter Verwendung Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu beschränken. Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Sekundärteilchen, die LacZ / V5 offenen Leserahmen an P6 durch die Rekombinase Cre, wodurch die Expression von EGFP-KASH2 spezifisch an Purkinje-Zellen (2A) gezielt führenden geschnitten. Wie erwartet, ist EGFP-KASH2 zur Kernhülle richtet, wie durch die um den Kern (2B) beobachtet EGFP-positiven felgenartigen Muster angegeben. Jede physiologische Phänotyp zu maximieren, ist es wichtig, durch Berechnung des Prozentsatzes der EGFP-KASH2 positive Zellen, die mit einem zellspezifischen Antikörper-Marker co-gefärbte dass EGFP-KASH2 in einer Mehrzahl von gezielten Zellen exprimiert. In diesem Beispiel wurde EGFP-Expression KASH2 in mehr als 70% der Calbindin-positive Purkinje-Zellen (2B) detektiert. In diesen bedingungengen, wir konnten keine signifikanten histologischen oder Verhaltens Phänotypen 10 Monate alten Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Mäusen 20 zu beobachten. Es ist wichtig sicherzustellen, dass jeder morphologischen oder Verhaltensphänotyp nicht durch ektopische Expression von EGFP-KASH2 in einem unbeabsichtigten Zellentyp / Gewebe. Zu diesem Zweck wurde EGFP-KASH2 nicht in der Körnerzellschicht oder der Molekularschicht des Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Kleinhirn (2B) beobachtet. Schließlich ist es wichtig, das Ausmaß des LINC komplexe Störung in Zellen EGFP-KASH2 bestätigen. Dies kann unter Verwendung hochwertiger Anti-Nesprin Antikörper gegen ihre Vertreibung aus dem NE von Zellen, die EGFP-KASH2 betonen, erreicht werden. Wie in Abbildung 3 gezeigt, ist die endogene Nesprin2 aus der Kernhülle der Purkinje-Zellen, die EGFP-KASH2 auszudrücken (Abbildung 3 Deckelplatte, gelbe Pfeile) verschoben, während Purkinje-Zellen, die EGFP-KASH2 reta nicht exprimierenin endogenen Nesprin2 an der Kernhülle (Abbildung 3 obere Platte, weißer Pfeil). Wie erwartet, Steuerwurfgeschwistern, die nicht Cre-Rekombinase exprimieren, zeigen Nesprin2 an der Kernhülle des gesamten Purkinje-Zellpopulation (Abbildung 3 unten weiße Pfeile). Mehrere Berichte haben nun bestätigt die Expression von EGFP-KASH2, begleitet von der Verschiebung des endogenen Nesprine in weiteren Geweben und Zelltypen, wie beispielsweise Skelettmuskelfasern und Zapfenrezeptoren 19,21. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> Abbildung 1 LINC Komplexen verbinden den Kern mit dem Zytoskelett und werden durch die Überexpression von EGFP-KASH2 gestört. (A) Darstellung des LINC-Komplexe, die das Innere der Zellkern in das Zytoplasma-Zytoskelett verbinden. Beachten Sie, dass SUN Domänen interagieren wahllos mit KASH Domainsaus allen Nesprine (Nesprine 1-4). (B) Überexpression von EGFP-KASH2 verdrängt endogenen Nesprine aus der Kernhülle in die Notaufnahme, in einer beherrschenden negativen Art und Weise, so dass dem Trennen des Kerns aus dem umgebenden Zytoplasma-Zytoskelett. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Überexpression von EGFP-KASH2 speziell auf Kleinhirn Purkinje-Zellen ausgerichtet. (A) Zucht von Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) bis Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu einer Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Nachkommen in denen die Rekombinase Cre ist speziell in cerebellar Purkinje-Zellen exprimiert. Nach der Expression (P6), transloziert Cre-Rekombinase in den Zellkern, wo es schneidet das LacZ ORF und induziert EGFP-KASH2 Ausdruck. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Mäusen spezifisch exprimieren EGFP-KASH2 in Kleinhirn Purkinje-Zellen identifmit Calbindin ied (rot eingefärbt). Beachten Sie, dass beide Kleinhirnkörnerzellen und Interneuronen der Molekularschicht sind negativ für EGFP-KASH2 Ausdruck. Abkürzungen: Mol: Molekülschicht, PCL: Purkinje Zellschicht und GCL: Körnerzellschicht. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> Abbildung 3. Störung der endogenen LINC-Komplexe in Kleinhirn Purkinje-Zellen. Einzel Konfokalebene zeigt die Expression von EGFP-KASH2 die endogene Nesprin2 (rot gefärbt) von der Kernhülle der Purkinje-Zellen (gelbe Pfeile oben) verdrängt. Beachten Sie, dass Purkinje-Zellen ohne EGFP-KASH2 Ausdruck beizubehalten endogenen Nesprin2 an ihren Kernhülle (weißer Pfeil oben). In Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Steuerwurfgeschwistern, wird keine EGFP-Signal beobachtet und Nesprin2 ist an der Kernhülle aller Purki erkannt Dieses Protokoll stellt die Nützlichkeitdie Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell zu EGFP-KASH2 Ausdruck zerebelläre Purkinje-Zellen unter Verwendung von Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu beschränken. Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Sekundärteilchen, die LacZ / V5 offenen Leserahmen an P6 durch die Rekombinase Cre, wodurch die Expression von EGFP-KASH2 spezifisch an Purkinje-Zellen (2A) gezielt führenden geschnitten. Wie erwartet, ist EGFP-KASH2 zur Kernhülle richtet, wie durch die um den Kern (2B) beobachtet EGFP-positiven felgenartigen Muster angegeben. Jede physiologische Phänotyp zu maximieren, ist es wichtig, durch Berechnung des Prozentsatzes der EGFP-KASH2 positive Zellen, die mit einem zellspezifischen Antikörper-Marker co-gefärbte dass EGFP-KASH2 in einer Mehrzahl von gezielten Zellen exprimiert. In diesem Beispiel wurde EGFP-Expression KASH2 in mehr als 70% der Calbindin-positive Purkinje-Zellen (2B) detektiert. Unter diesen Bedingungen haben wir keine signifikante histologische oder behaviora beobachtenl Phänotypen 10 Monate alten Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Mäusen 20. Es ist wichtig sicherzustellen, dass jeder morphologischen oder Verhaltensphänotyp nicht durch ektopische Expression von EGFP-KASH2 in einem unbeabsichtigten Zellentyp / Gewebe. Zu diesem Zweck wurde EGFP-KASH2 nicht in der Körnerzellschicht oder der Molekularschicht des Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Kleinhirn (2B) beobachtet. Schließlich ist es wichtig, das Ausmaß des LINC komplexe Störung in Zellen EGFP-KASH2 bestätigen. Dies kann unter Verwendung hochwertiger Anti-Nesprin Antikörper gegen ihre Vertreibung aus dem NE von Zellen, die EGFP-KASH2 betonen, erreicht werden. Wie in Figur 3 gezeigt, ist die endogene Nesprin2 von der Kernhülle der Purkinje-Zellen, die EGFP-KASH2 exprimieren (Figur 3 obere Platte, gelbe Pfeile) verschoben wird, während Purkinje-Zellen, die nicht exprimieren EGFP-KASH2 behalten endogenen Nesprin2 an der Kernhülle (Abbildung 3 </strong&gt; obere Platte, weißer Pfeil). Wie erwartet, Steuerwurfgeschwistern, die nicht Cre-Rekombinase exprimieren, zeigen Nesprin2 an der Kernhülle des gesamten Purkinje-Zellpopulation (Abbildung 3 unten weiße Pfeile). Mehrere Berichte haben nun bestätigt die Expression von EGFP-KASH2, begleitet von der Verschiebung des endogenen Nesprine in weiteren Geweben und Zelltypen, wie beispielsweise Skelettmuskelfasern und Zapfenrezeptoren 19,21. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> Abbildung 1 LINC Komplexen verbinden den Kern mit dem Zytoskelett und werden durch die Überexpression von EGFP-KASH2 gestört. (A) Darstellung des LINC-Komplexe, die das Innere der Zellkern in das Zytoplasma-Zytoskelett verbinden. Beachten Sie, dass SUN Domänen interagieren wahllos mit KASH Domänen von allen Nesprine (Nesprine 1-4). (B) Die Überexpression of-EGFP KASH2 verdrängt endogenen Nesprine aus der Kernhülle in die Notaufnahme, in einer beherrschenden negativen Art und Weise, so dass dem Trennen des Kerns aus dem umgebenden Zytoplasma-Zytoskelett. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53318/53318fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Überexpression von EGFP-KASH2 speziell auf Kleinhirn Purkinje-Zellen ausgerichtet. (A) Zucht von Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) bis Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu einer Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Nachkommen in denen die Rekombinase Cre ist speziell in cerebellar Purkinje-Zellen exprimiert. Nach der Expression (P6), transloziert Cre-Rekombinase in den Zellkern, wo es schneidet das LacZ ORF und induziert EGFP-KASH2 Ausdruck. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Mäusen spezifisch exprimieren EGFP-KASH2 in Purkinje-Zellen des Kleinhirns mit Calbindin identifiziert (rot eingefärbt). Beachten Sie, dass beide Kleinhirnkörnerzellen und Interneuronen der Molekularschicht sind negativ für EGFP-KASH2 Ausdruck. Abkürzungen: Mol: Molekülschicht, PCL: Purkinje Zellschicht und GCL:. Körnerzellschicht <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53318/53318fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> Abbildung 3. Störung der endogenen LINC-Komplexe in Kleinhirn Purkinje-Zellen. Einzel Konfokalebene zeigt die Expression von EGFP-KASH2 die endogene Nesprin2 (rot gefärbt) von der Kernhülle der Purkinje-Zellen (gelbe Pfeile oben) verdrängt. Beachten Sie, dass Purkinje-Zellen ohne EGFP-KASH2 Ausdruck beizubehalten endogenen Nesprin2 an ihren Kernhülle (White arrow top). In Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Steuerwurfgeschwistern, wird keine EGFP-Signal beobachtet und Nesprin2 ist an der Kernhülle aller Purkinje-Zellen (weiße Pfeile unten) festgestellt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53318/53318fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Aufrufe.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Serie: Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Induktion der Protein Deletion Durch<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Verhalten

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mausmodelle

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all females are heterozygous for X-linked gene expression. One of the key regulators of XCI is Xist, which is essential for the initiation and maintenance of XCI. Previous studies have identified 13 trans acting X chromosome inactivation factors (XCIFs) using a large-scale, loss-of-function genetic screen. Inhibition of XCIFs, such as ACVR1 and PDPK1, using short-hairpin RNA or small molecule inhibitors, reactivates X chromosome-linked genes in cultured cells. But the feasibility and tolerability of reactivating the inactive X chromosome in vivo remains to be determined. Towards this goal, a Xist&#916;:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp mouse model has been generated with non-random XCI due to deletion of Xist on one X chromosome. Using this model, the extent of inactive X reactivation was quantitated in the mouse brain following treatment with XCIF inhibitors. Recently published results show, for the first time, that pharmacological inhibition of XCIFs reactivates Mecp2 from the inactive X chromosome in cortical neurons of the living mouse brain.

Here, we describe a protocol to generate a viable female murine model with non-random X chromosome inactivation, i.e., the maternally-inherited X chromosome is inactive in 100% of the cells. We also describe a protocol to test feasibility, tolerability, and safety of pharmacological reactivation of the inactive X chromosome in vivo.

Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Immunologie und Infektion

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Neurowissenschaften

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Modeling Prostate Cancer in Genetically-engineered Mouse Models: A CRISPR/Cas9-mediated Localized Gene Editing Technique in Mouse Anterior Prostate Lobe Cells

Source: Riedel, M. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/57525" target="_blank">Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method for editing specific genes in prostate gland cells using an adenovirus-based delivery system. The approach allows for orthotopic and localized alteration of gene expression utilizing CRISPR technology to develop novel mouse models for prostate cancer.

Modellierung von Prostatakrebs in gentechnisch veränderten Mausmodellen: Eine CRISPR/Cas9-vermittelte lokalisierte Gen-Editing-Technik in vorderen Prostatalappenzellen der Maus

Source: Riedel, M. et al. Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration. J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

Prostate Cancer

Animal model studies

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

Source: Pang, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64059">A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the generation of a focal demyelination mouse model using a two-point Lysophosphatidylcholine (LPC) injection. The skull of an anesthetized mouse is exposed. The injection coordinates are determined, and a hole is drilled to enable LPC injections at targeted sites. LPC induces focal demyelination of neurons via inflammation, while a two-point injection ensures its sustainability.

Source: Pang, X., et al. A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice. J. Vis. Exp. ...

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Zusammenfassung

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Induktion der Protein Deletion Durch