This work was supported by the Max Planck Society, the German Cancer Research Center, the University of T&#252;bingen, and the Bundesministerium f&#252;r Bildung und Forschung (grant no. 0312040).
We thank Eduard Hermann for helping us automate the analysis of the force curve data and Dr. Jakob Suckale for careful reading of this manuscript.

1. Vorbereitung der unterstützten Lipiddoppelschichten (SLB) 11,12,21 <ol><li> Herstellung von Lipid-Mischung und Multilamellare Vesikelsuspensionen <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Puffer vorher. <ol><li> Vorbereitung PBS-Puffer bei Konzentrationen von 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 und 137 mM NaCl, pH 7,2. </li><li> Vorbereitung SLB (unterstützte Lipiddoppelschicht) Puffer bei Konzentrationen von 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4. </li><li> Es wird eine Lösung von 1 M CaCl 2. </li></ol></li><li> Man löst die folgenden Lipide in Chloroform in einer gewünschten Konzentration: beispielsweise Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC) bei 25 mg / ml, Sphingomyelin (SM) bei 25 mg / ml und Cholesterin (Chol) bei 10 mg / ml. </li><li> Nehmen 18,38 ul DOPC 17,10 ul SM und 11,30 ul Chol, um eine Lösung mit 1 mg Gesamtlipiden in einem 2 zu machen: 2: 1 DOPC: Molverhältnis Chol: SM. Variieren die Volumina entsprechend auf der Grundlage der concentrations der in 1.1.2 hergestellten Lipide. Behält jedoch das Molverhältnis von 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol als Änderung des Molverhältnisses wird die Phaseneigenschaften der Membran 25 zu ändern. </li><li> Mischen Sie die Lösung vollständig durch Vortexen. Hinzufügen eines fluoreszierenden lipidischen Farbstoff bei 0,05 Mol-%, wenn man die Doppelschicht mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen wünscht. Hinweis: Die Familie von langkettigen dialkylcarbocyanines, mochte, DiI und DiO umfassen einen weiten Bereich von Wellenlängen und können idealerweise verwendet werden, um Lipidmembranen zu markieren. Alternativ können fluoreszenzmarkierten Lipiden, wie Rhodamin- Phosphatidylethanolamin oder BODIPY-Cholesterin verwendet werden. In jedem Fall sollte die Konzentration des Farbstoffs gemäß der Mikroskopie Einstellung optimiert werden, wenn man bedenkt, dass hohe Konzentrationen des Fluorophors an das Lipid gebunden ist, kann die Lipid Verhalten 19 zu ändern. </li><li> Trocknen Sie das Chloroform unter Verwendung von N2-Gas (oder einen beliebigen verfügbaren Inertgas wie Ar und He). </li><li> Weitere dry-Ter Lipidgemisch unter Vakuum für mindestens 1 Std. Hinweis: Wenn das Speichern dieser Lipidmischung, Spülluft mit Inertgas (N 2, Ar oder He) und bei -20 ° C. Aliquot überschüssige Lipide-in-Chloroform in kleine braune Fläschchen. Trocknen Sie sie in einer ähnlichen Weise wie die Lipid-Mischung, verdrängen Luft mit Inertgas (N 2, Ar oder He) und bei -20 ° C. </li><li> Auflösung der getrockneten Lipide in einem PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10 mg / ml. </li><li> Wirbel die Mischung kräftig für etwa 20 sec bis 1 min, um eine trübe Suspension zu erhalten, mit einem multilamellaren Vesikeln. Stellen Sie sicher, dass die keine Lipidfilmen Festhalten an den Seiten des Fläschchens. </li><li> Verteilen Sie diese Suspension in 10 ul Aliquots (1 mg Lipid macht 10 Teilmengen). </li><li> Lagerung bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Herstellung unilamellare Vesikel Anmerkung: Verschiedene Größen von unilamellare Vesikel können mit dem Beschallungsverfahren oder dem Extrusionsverfahren hergestellt werden. Beschallung verwendet sound Energie, um das Gemisch zu rühren und trenne die Schichten des multilamellaren Suspension. Dies wird durch Bereinigung der trübe Suspension angezeigt. Extrusion zwingt die multilamellaren Vesikeln, um durch einen Membranfilter mit einer bestimmten Porengröße bestehen. <ol><li> Beschallungsverfahren <ol><li> Nehmen Sie die 10 ul multilamellaren Lipidsuspensionen und fügen Sie 150 ul SLB-Puffer. </li><li> Übertragen Sie die Mischung in kleine (2 ml) bedeckten Glasfläschchen und Dichtung mit Parafilm. </li><li> Beschallen des Gemisches bei Raumtemperatur in einem Ultraschallbad für 10 min oder bis sie klar wird, kleine unilamellare Vesikel (SUVs mit einem Durchmesser unter 50 nm) zu erhalten. </li></ol></li><li> Extrusionsverfahren <ol><li> Nehmen Sie die 10 ul multilamellaren Lipidsuspensionen und fügen Sie 150 ul SLB-Puffer. </li><li> Übertragung der Suspension in einen kryogenen Röhre. </li><li> Einfrieren der Lipidsuspension durch Eintauchen des kryogenen Schlauch für ein paar Sekunden in flüssigen Stickstoff. </li><li> AuftauenLipidsuspension durch Eintauchen des kryogenen Rohr in einem Wasserbad bei Raumtemperatur oder 37 ° C für ein paar Minuten. Wiederholen Sie die Frost-Tau-Stufen mindestens 10-mal. </li><li> Um die Lipidsuspension zu extrudieren, mit einem Polycarbonatmembran mit 200 nm Porengrße (andere Porengrößen sind verfügbar, wie 100 nm oder 400 nm) und einem kommerziellen Extrusionsvorrichtung 26. Hinweis: Zur Zeit gibt es zwei Extruder Geräte im Handel erhältlich: ein Handbuch Extruder ist für kleine Volumen (200 ul auf wenige ml) erhältlich. In diesem Fall wird die Probe durch die Membran durch manuelles Schieben der Suspension hin und her zwischen zwei Spritzen extrudiert. Je nach Hersteller, würde Lipid Aliquots müssen kombiniert werden, um Mindestvolumen von der Einrichtung zu erreichen. Für größere Mengen (bis zu 50 ml) ausgefeiltere Vorrichtungen verwendet werden, in dem die Suspension durch die Polycarbonat-Membran mit Hilfe von Druckgas gepresst. Aufbau und Extrusionsbedingungen können entsprechend der mod ändernel. Beachten Sie die Hinweise des Herstellers beachten. Dieses Protokoll bezieht sich auf die manuell bedienbarer Extruder für kleine Volumina. </li><li> Ins Gleichgewicht des Extruders in Wasser, indem Wasser durch den Extruder. Tauchen Sie die Membran in Wasser. </li><li> Platzieren der Membran zwischen den beiden Kolben, montieren die Vorrichtung und im Gleichgewicht belassen, Puffer, indem man den Puffer durch den Extruder von einer Spritze zur anderen. Zusätzlich ermöglicht dieser Schritt die Prüfung der Undichtheit des Systems. Wenn sie undicht ist, zerlegen und wieder zusammenbauen es wieder Veränderung der Membran. </li><li> Nehmen Sie die Lipidsuspension mit Hilfe einer Spritze des Extruders (&quot;Schmutzseite&quot;). </li><li> Befestigen Sie die Spritze mit der Lipidsuspension auf einen Kammer und die leere Spritze auf der gegenüberliegenden Kammer. </li><li> Schieben Sie die Spritze an einem Ende. Übergeben Sie die Lösung durch die Membran und in das gegenüberliegende Spritze. Dies ist der 1. Pass ab. </li><li> Führt es durch die Membran für eine Gesamtzahl von 31 mal solchendaß die Lösung endet an der gegenüberliegenden Spritze (&quot;saubere Seite&quot;). Hinweis: Prüfen Sie die Membran nach dem Extrudieren. Wenn es war gebrochen, dann Extrusionsverfahren war nicht erfolgreich und muss wiederholt werden. </li><li> Leeren Sie die Spritze in einem Röhrchen. Große unilamellare Vesikel (LUVs) sind für 1-2 Tage stabil, wenn sie bei 4 ° C gehalten. </li></ol></li></ol></li><li> Herstellung von Mica und Deckgläser <ol><li> Waschdeckgläschen erst in Wasser und dann in Ethanol. Luftgetrocknet. </li><li> Nehmen Glimmerscheiben und ziehen Sie die äußere Schicht mit Klebeband. </li><li> Befestigen Sie die Glimmerscheibe auf dem Deckglas. Transparente optische Klebstoffe sind optimal, so dass man die Doppelschichten mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüfen. </li><li> Bringen Kunststoffzylinder (2,5 cm Außendurchmesser, 2 cm Innendurchmesser und 0,5 cm Höhe) mit optischen Kleber / Fett. Stellen Sie sicher, dass alles dicht ist und keine Lecks vorhanden sind. Verwenden Sie Fett zu wollen, wenn Wiederverwendung der Zylinder, da sie leicht von th abgelöst werdene Deck und gewaschen. Wobei die Abmessungen der Kunststoffzylinder, abhängig von der Größe des AFM Cantileverhalter und sollte entsprechend eingestellt werden. </li></ol></li><li> Ablagerung von unilamellare Vesikel auf einem festen Träger <ol><li> Pipette das gesamte Liposomenlösung direkt auf den Glimmer. Noch ein SLB Puffer auf ein Volumen von 300 &amp; mgr; l zu erreichen. </li><li> Add 0,9 ul 1 M Calciumchlorid-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 3 mM Ca 2+ erreichen. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 2 min und dann bei 65 ° C für mindestens 10 min. Immer decken die Doppelschichten mit Puffer. Kontakt mit Luft und Luftblasen zu zerstören. Während der Inkubation fügen weitere Puffer, wenn notwendig, insbesondere, wenn die Inkubation bei höheren Temperaturen. Anmerkung: Die Inkubationstemperaturen je nach den Lipidmischungen und Phasen erforderlich. Inkubationszeit von mindestens 10 min erforderlich ist, um getragen Doppelschichten zu bilden, aber es länger sein könnte, abhängig von der Temperatur und Zusammensetzung. </li><li> Wäschedie Doppelschicht mit heißem (65 ° C) SLB Puffer 15-20 mal Calcium und nichtkondensierten Vesikeln zu entfernen. Seien Sie besonders vorsichtig während der Waschschritte, um die Doppelschicht unter Puffer zu halten und vorsichtig pipettieren der Waschlösung zu verhindern die Zerstörung der Doppelschicht. </li><li> Coole unterstützt Doppelschichten auf Raumtemperatur vor AFM-Messungen. Dies ist erforderlich, um die unterschiedlichen Phasen der Membran sowie bilden Minimierung thermischer Drift im Gerät. </li></ol></li></ol> 2. Rasterkraftmikroskopie-Messungen 11,12 <ol><li> Imaging Hinweis: Führen Sie die Rasterkraftmikroskopie-Bildgebung im Kontaktmodus oder Tapping-Modus. Bild unterstützt Doppelschichten in Lösung; erlauben keine Lösung vollständig verdampfen, da dies die Doppelschichten zu zerstören. Wie man es mit einem Puffer zu arbeiten, beachten Sie bitte Vorsichtsmaßnahmen, dafür zu sorgen, dass jeder AFM Teil von Flüssigkeiten geschützt. <ol><li> Wählen Sie ein weiches Ausleger (unter 0,2 N / m Federkonstante wird empfohlen) und montieren Sie ihn auf ter AFM. Die Wahl des Auslegersteifigkeit für die Kraftspektroskopie kritischer (und dies wird später diskutiert werden). </li><li> Montieren Sie die Probe auf der Bühne AFM und stellen Sie sicher, dass alle Schwingungsisolationsmodule eingeschaltet sind. Wartezeit von mindestens 15 min äquilibrieren und verringern die thermische Drift des Systems. In Abhängigkeit von der AFM-Set-up kann Tuning und Imaging-Spezifikationen variieren. Wenden Handbuch des Herstellers. </li><li> Nähern Sie sich der Probe mit der AFM-Spitze bis zum Kontakt. </li><li> Da Lipiddoppelschichten sind in der Regel 4 nm in der Höhe, verwenden die Z-Bereich des Instruments, die den höchsten z-Auflösung (beispielsweise 1,5 um) erhalten wird. </li><li> Wählen Sie eine Region, die dem Bild. Um einen Überblick über die Lipiddoppelschicht, eine 50 &amp; mgr; m × 50 &amp; mgr; m oder 25 &amp; mgr; m × 25 &amp; mgr; m-Region wird ein guter Ausgangspunkt, um sein Bild zu bekommen. Wenn kleinere Features erscheinen, kann man Bild in kleinere Bereiche (10 &amp; mgr; m × 10 &amp; mgr; m oder 2 um x 2 um). Die Wahl der Abbildungsbereich hängt auch von der Arbeits range des piezoelektrischen Scanner. Bitte konsultieren Sie die Instrumentenhand dafür. </li><li> Als Doppelschichten sind sehr zerbrechlich, den Sollwert der AFM-Spitze einstellen während der Bilderzeugung, die Kraft bei minimalem und richtig für thermische Drift zu halten, dabei ständig in Kontakt mit der Probe. Im Kontaktmodus, den Sollwert zu minimieren. Im Tipp-Betrieb, den Sollwert zu maximieren. </li><li> Prozessbilder durch Anbringen jeder Scanlinie zu Polynom Ausgleichsfunktionen. Führen Linienentfernung für Scans, die Kontakt mit der Membran unter Verwendung der proprietären Software der AFM-Produktionsunternehmen zu verlieren. </li></ol></li><li> Kraftspektroskopie <ol><li> Kalibrieren des Auslegers entsprechend den Anweisungen nach dem Protokoll des Herstellers. Kalibrierung ermöglicht die Umwandlung des elektrischen Signals der Photodioden, um eine Kraft (1B). <ol><li> Kalibrieren Sie die Empfindlichkeit der Spitze zur Ablenkung als z-Piezo-Bewegung (in Längeneinheiten) zu messen, anstatt elektrische Signal in Volt. <br /&gt; Anmerkung: AFM detektiert Änderungen in der Auslenkung des Auslegers mit Hilfe eines Lasers auf der Rückseite des Auslegers reflektierten. Der Laser erreicht eine Photodiode, die die Position des Laserspots räumlich erfassen kann. Eine Änderung in der Durchbiegung des Auslegers, da es bei Kontakt mit der Probe biegt durch diese Fotodiode als &quot;vertikale Ablenkung&quot; erkannt, und dies ist in den Einheiten der Spannung. Da der Ausleger durch den z-Piezo bewegt wird, wird die vertikale Ablenkung auf die Bewegung in der z-Piezo verwandt. Das Verhältnis von vertikalen Ablenkung und z-Bewegung Empfindlichkeit genannt und wandelt Spannung an Distanz. </li><li> Berechnung des Auslegerfederkonstante mit dem thermischen Rauschfrequenzverfahren, in der Regel in der AFM-Software integriert. Bei diesem Verfahren zeigen die Amplitude der Schwingung von Rauschen mit Bezug auf die Frequenz der Schwingung, wodurch eine spektrale Leistungsdichteverteilung. Dieses Grundstück wird eine Spitze um die Resonanzfrequenz zu zeigen. Die Frequenz, bei der die Amplitude idas Größte ist die Resonanzfrequenz. Setzen Sie eine Lorentz-Funktion rund um den Gipfel zu berechnen automatisch die Federkonstante durch die Software. Hier werden einige nützliche Ressourcen für die Theorie des thermischen Rauschens Verfahrens sind in den Artikeln 27 bis 30 angegeben. </li></ol></li><li> Nach der Bebilderung eine Fläche von der Doppelschicht, wählen Sie eine 5 um x 5 um-Bereich in der Doppelschicht auf Kraftspektroskopie durchzuführen. </li><li> Einrichten des AFM so, dass es Kraftkurven in einem 16 x 16 Raster von der Region. Dies führt zu 256 Kraftkurven pro Region. Der Raum zwischen zwei benachbarten Punkten sollte ausreichen, um zu vermeiden, dass die Membranfläche von einem Punkt untersucht würde mit dem nächsten Punkt übereinstimmt. Dies ist abhängig von der Spitzenradius. A 100 nm Abstand zwischen zwei Punkten wäre ideal. Teilen Sie die 5 &amp; mgr; m × 5 &amp; mgr; m Bereich in 16 x 16 Gitter. Abhängig von der Größe der Phasen kann man einen kleineren oder größeren Bereich auszuwählen, und dann entsprechend an die Rastergröße. </li><li> Stellen Sie z-Piezoverschiebung zu400 nm. Dies bestimmt die maximale Reichweite der Bewegung des z-piezo. Sie sollte groß genug sein, um sicherzustellen, dass der Ausleger vollständig weg von der Probe in zwischen den Messungen eingefahren werden. </li><li> Stellen Annäherungsgeschwindigkeit bis 800 nm / sec und zurückzuziehen Geschwindigkeit bis 200 nm / sec. Verwenden Sie eine Annäherungsgeschwindigkeit von 400 bis 6000 nm / s in Abhängigkeit von der Doppelschichtzusammensetzung und Lipidphase zu unter 6,16 werden. </li><li> Nach dem Einstellen aller Parameter, erwerben Kraftkurven, durch Drücken der Taste &quot;RUN&quot; der AFM-Software. </li><li> Sparen Kraftkurven als Kraft-Höhenkurven (ein Maß der z-Piezo-Bewegung). Dies berücksichtigt nicht die Biegung des Auslegers in Kontakt mit der Probe zu nehmen. Während der Datenverarbeitungsschritt, kann der AFM-Software-Korrektur für Auslegerbiege zu Kraft-Spitze und Probe-Kurven (Abbildung 1c), die richtigen Werte für die Doppelschichtdicke zu geben erhalten. Die Korrekturwerte werden in der Regel im calibr eingeation, die mit jedem Kraftkurve gespeichert wird. Berechnen Spitze und Probe durch Subtrahieren der vertikalen Ablenkung vom piezoBewegung an einem gegebenen Punkt. Anmerkung: Der Peak in der Annäherungskraft-Kurve (der Kraftwert sinkt, auch wenn die Auslegerbewegung noch auf dem Ansatz-Zyklus) ist die Bruchkraft der Membran, während die Differenz zwischen der Position der Spitze und der Position des Punktes wo die Kraft zu steigen beginnt wieder stellt die Dicke der Membran. </li><li> Erwerben Sie mindestens 500 Kraftkurven für jede Bedingung, um gute Statistiken zu erhalten. Zeichnen Sie ein Histogramm der Werte mit Programmen wie Origin oder MatLab, und passen Sie die Histogramme zu einer Gauß-Verteilung, um die Spitze und Breite der Verteilung zu erhalten. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

SLBs composed of DOPC:SM:Chol (2:2:1) were formed on mica after vesicle adsorption and rupture induced by calcium chloride. This lipid composition separated into Ld and Lo phases. The Lo phase is enriched in sphingomyelin and cholesterol and is less fluid/more viscous (Figure 1A) than the Ld phase11. The separation of Lo from Ld phase manifests as circular structures elevated above the surrounding (Figure 1B, C). The platforms are the Lo phases surrounded by the Ld phases. Membrane defects (or holes in the membrane) are also seen (Figure 1B, blue arrow) and a height profile across this defect shows the thickness of the bilayer. The Ld/Lo height difference can also be examined by looking at an AFM height profile (Figure 1C).
The preparation of lipid mixture is very important as the composition determines the bilayer properties. During the preparation of the supported bilayer, it is important to work at the indicated temperatures for the proper formation of lipid phases (step 1.4.5). During imaging, keeping a low force is very important so as not to destroy the bilayer nor to accumulate dirt on the tip.
After AFM imaging, regions of the SLB are selected and probed using force spectroscopy. Force spectroscopy allows us to probe other properties of the membrane, specifically the breakthrough force (Figure 1D). The Ld and Lo phases show different breakthrough force and thickness (Figure 1E, F). The properties are summarized in Table 1. We note that compared to Chiantia et al.11, similar values for breakthrough force in the Ld phase were obtained but a lower value for the Lo phase. This could be due to lower amounts of cholesterol used in our membranes (we used DOPC:SM:Chol ratio 2:2:1, while they used of 1.5:1.5:1). This also demonstrates the importance of mixing the right lipid ratio &#8212; a critical factor in reproducibility of results. Furthermore, using different lipids (chain length, and degree of unsaturation) also changes the bilayer properties6,15,18.
While plotting the distribution of breakthrough forces is useful and can already show differences in the bilayer properties, further analysis of the breakthrough force distribution can be used to deduce other mechanical properties including line tension and spreading pressure11,17,21. Briefly, the probability, P(F) of measuring a certain breakthrough force, F, is described by the continuum nucleation model11,15,17:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/52867/52867eq1.jpg" />
where A is the resonance frequency of the cantilever, K is the spring constant of the cantilever, v is the speed of the approach, &#915; is the line tension (the edge energy required to keep a hole in the membrane open), R is the radius of the AFM tip, kB is the Boltzmann constant, T is temperature, and S is the spreading pressure or the energy associated to close the hole (opposite of membrane tension &#8212; the energy needed to be exerted by the membrane to open a hole32). This equation can be integrated and dP/dF can be calculated as:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/52867/52867eq2.jpg" />
A, K, R are properties of the AFM cantilever/tip that can be acquired through cantilever calibration. T and v are experimental parameters that should be kept constant throughout the experiments. dP/dF is then fitted to the histogram to acquire the line tension and the spreading pressure. As several parameters affect P(F), experimentalists are advised to use similar tips and acquisition conditions to have comparable values for line tension and spreading pressure. Contamination of the AFM tip (including dirt and unfused vesicles on the tip acquired during imaging) leads to non-reproducible results. Furthermore, the choice of support affects the mechanical properties of the membrane20.
Another technique that can characterize mechanical properties of lipid bilayer is the micropipette aspiration of giant unilamellar vesicles (GUVs)33. In this technique, membrane tension is calculated from the deformation of GUVs during aspiration. Furthermore, by increasing the suction, one can calculate the tension at which the GUV ruptures (or lysis tension)34, which could be related to the line tension in the continuum nucleation model. One drawback of this techniques is the complexity of calculating membrane tension to phase separating membranes, as the different phases have different mechanical properties35. This is in contrast to AFM force spectroscopy, where individual phases can be characterized separately. Furthermore, whereas many GUVs are needed to produce statistically relevant results, the AFM can produce one distribution per SLB. However, membrane remodeling effects (for example, tubulation and invaginations) are more easily visualized with GUVs, making them better systems for characterizing these shape-related effects together with mechanical properties.
In further applications to study the effects of membrane proteins on bilayer properties, purified proteins may be incorporated in these vesicles to make proteoliposomes. One technique for doing this uses detergents to help the proteins to stabilize and insert into the membrane. Subsequent purification via dialysis or size-exclusion chromatography removes free proteins and detergent in solution36. Another approach requires the tagging of the purified proteins (for example, Histidine or Streptavidin tags) and incorporating affinity partners for this tag in the liposomes (with nickel-nitriloacetic acid (Ni-NTA) or biotinylated lipids).
In summary, we described a method to analyze lipid bilayers. Due to its high-resolution, AFM can reveal sub-micrometer structures in the membrane, which include lipid phases among others. Force spectroscopy, here used for characterizing lipid membranes, can also be used on membrane proteins and other biomolecules on the membrane.

Rasterkraftmikroskopie (AFM) erzeugt ein Bild einer Oberfläche durch Abtasten über einen Bereich der Probe unter Verwendung eines Auslegers mit einer sehr scharfen Spitze 1. Die Bewegung des Auslegers tastet die Oberflächentopologie der Probe. AFM wurde weithin an biologische Moleküle aufgebracht - einschließlich Proteinen, DNA und Membranen, die aufgrund ihrer Flexibilität bei der Analyse von festen Proben in Luft oder nahezu native Zustand in flüssiger 2-5. Abgesehen von seiner hochauflösenden Imaging-Fähigkeit im Nanometerbereich, wirkt der AFM Cantilever als Feder, um Wechselwirkungskräfte (Adhäsion und Repulsion) und mechanischen Eigenschaften der Probe 5,6 sondieren. Dies wird als Kraftspektroskopie bekannt. In diesem Modus wird zuerst nähert die Sonde die Probe und übt eine Kraft auf, dann zurückgezogen wird, bis er den Kontakt verliert mit der Probe (1A). Die erzeugten Kurven zeigen Kraft als Funktion der Entfernung des Auslegers sowohl für den AppRotauge und Einfahren. Mehrere Objekte einschließlich des Elastizitätsmoduls, die Steifigkeit eines Materials zu messen, und Adhäsionskräfte ableiten. Unterstützte Lipid-Doppelschichten sind biologische Modellmembranen auf einem festen Träger liegend - in der Regel Glimmer, Borosilikatglas, Quarzglas, oder oxidierten Silizium 7. Sie werden mit verschiedenen Techniken wie Vesikel Abscheidung hergestellt, Langmuir-Blodgett-Verfahren und Spin-Coating 8,9. AFM verwendet wurde, um die Bildung dieser abgestützt Doppelschichten 10 zu folgen, und der Sonde unterschiedliche Strukturen von Membranen unterschiedlicher Zusammensetzungen 11-15 gebildet. Darstellende Kraftspektroskopie auf unterstützten Doppelschichten führt zu einer Spitze in der Ansatz-Kurve. Dieser Peak zeigt die Kraft, die benötigt, um die Doppelschicht zu durchdringen, und heißt Durchbruch Kraft. Die Doppelschichtdicke kann auch über die Kraftkurve 6 gemessen werden. Die typische Durchbruchkraft von DoppelschichtenBereich zwischen 1-50 nN 6. Diese Eigenschaften hängen von Lipidpackung (flüssig oder Gelphase) und Struktur (Acylkettenlänge und Grad der Ungesättigtheit) von membranaktiven Mittel 16 verändert. Die Theorie hinter dem Bruch wurde erläutert, 17 und andere experimentelle Parameter wie Cantilever Weichheit, Spitzenradius und Annäherungsgeschwindigkeit auch die bahnbrechende Kraft 15,16,18 beeinflussen. Kraftspektroskopie wurde verwendet, um die Eigenschaften der verschiedenen Lipidphasen 11,19, Zusammensetzung abhängigen Änderungen 12,20 sowie Wirkungen anderer Biomoleküle wie Peptide zu analysieren, auf die Stabilität der Membran 21. Die flache Orientierung unterstützt Doppelschichten ist für die Kombination von AFM mit anderen Verfahren wie Oberflächenplasmonresonanz 22 und der Fluoreszenzmikroskopie 11,19 eine bessere Charakterisierung Struktur und die Eigenschaften von Membranen vorteilhaft. Diese ausführliche Video protocol soll unterstützten Lipiddoppelschichten bereiten Vesikel mit Abscheidung und mit AFM und Kraftspektroskopie zu analysieren. Während Vesikel in verschiedenen Größen verwendet werden, um Doppelschichten herzustellen, konzentriert sich dieses Protokoll auf kleinen und großen unilamellaren Vesikeln. Unterstützte Doppelschichten, die in flüssige Phase bestellt (L o) und flüssige ungeordneten (L d) Phasentrennung wurden 11,15 aus. 2: 1-Verhältnis die Membran aus Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC), Sphingomyelin (SM) und Cholesterin (Chol) bei 2 besteht. Diese Zusammensetzung Modelle die Lipid Rafts, die vorgeschlagen werden, um als Plattform für wichtige Proteintransport und Sortierung, Zellsignalisierung und andere zelluläre Prozesse 23,24 verhalten.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogenphosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), &gt;99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogenphosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip, 24&amp;nbsp;x&amp;nbsp;60&amp;nbsp;mm, 1&amp;nbsp;mm thickness</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die Set</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blocks</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&amp;nbsp; Always handle mica with gloves or tweezers.</td></tr><tr><td>Laboratory Equipment Grease</td><td>Borer Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (&lt;a href=&quot;http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf&quot;&gt;Data sheet&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Silicon Nitride AFM Cantilever&amp;nbsp;</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>DNP-10</td><td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60&amp;nbsp;nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Unterstützte Lipid-Doppelschichten von DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) wurden in AFM abgebildet (Abbildung 2 AC). Aufgrund der Lipidzusammensetzung wurden SM / Chol reiche L o und DOPC reiche L d Phasen beobachtet. Das Höhenprofil der AFM-Bildgebung kann wichtige Informationen über die Membranstruktur zu schaffen. Indem man die Höhenprofils kann die Dicke der Doppelschicht in Anwesenheit von Defekten in der Membran (2B), oder die Differenz in der Höhe zwischen den L o / L d-Phasen gemessen werden, bereitgestellt werden. Darüber hinaus ermöglicht AFM speziell ausgewählten Regionen, die diese Phasen und ihre mechanischen Eigenschaften unter Verwendung von Kraftspektroskopie (Abbildung 2 D - F) zu analysieren. Die Kraftkurven aus der Kraftspektroskopie-Modus abgeleitet werden verwendet, um die bahnbrechende Kraft, die von der Suche nach der Kraftwert auf dem Höhepunkt der Kraftkurve (2D und E) zu messen, und die membrane Dicke durch Subtrahieren der Abstandswert von dem Spitzenwert des Kraftverlaufes auf den Distanzwert, wenn der Kraftverlauf wieder zu steigen beginnt (2D und F). Die Sensitivität der AFM-Messungen ist abhängig von piezoelektrischem Material und elektronische Rückkopplungsschleifen. Als solcher, bevor Sie Experimente, ist wichtig, um sich mit der AFM einrichten vertraut. Es gibt zwei übliche Instrument für die piezoelektrische Materialien ein: (1) Rollenscanner, bei dem die Probe auf die Oberseite des piezoelektrischen Materials auf einer unbeweglichen Spitze aufgesetzt und die Probe abgetastet wird; oder (2) Biegeabschnitt, in dem die Spitze auf dem piezoelektrischen Material anstelle der Probe angebracht ist. Im letzteren Fall werden die piezoelektrischen Material und andere Elektronik vor Verschmutzungen geschützt. Eine Menge von AFM Modelle für biologische Anwendungen haben diese Konfiguration. Während der Bilderzeugung kann die AFM-Spitze mit der Probe zu verlieren und zu mir fehlerhaftasurements. Je nachdem wie viele Abtastungen verloren gegangen sind, kann das Bild durch Entfernen der Abtastzeilen und mit einem mittleren Intensitätsfilter, um die neuen Werte von Umgebung (3) abzuleiten korrigiert werden. Doch in den meisten Fällen bedeutet dies nicht, ergeben ein gutes Bild und es wird empfohlen, einfach zu verwerfen, das Bild. Es gibt andere Artefakte, die überwacht werden müssen. Diese ergeben sich aus stumpf / beschädigt / verschmutzt Tipps sowie die Beugung des Laserpunkt hinter dem Ausleger 31. In diesen Fällen sollten die Bilder entfernen, und die AFM-Spitze ersetzt werden sollte. Während der Kraftspektroskopie-Messungen können mehrere Herausforderungen ergeben: (1) Fehlen von Peaks (4A), (2) Vorhandensein von Schultern statt wohldefinierte Peaks (4B), (3) ein kleiner Anstieg und anschließende Plateaubildung bei sehr niedrigen Kräfte (4C - D). Die Abwesenheit eines Peaks zum Messen in einem Bereich ohne bil zurückzuführenayer oder Aufnahmebedingungen nicht optimiert. Es wird empfohlen, ein AFM-Bild ist, bevor Sie Kraftspektroskopie, um sicherzustellen, dass der Doppelschicht ist in der Tat, die gemessen erworben. Erwerbsbedingungen sowie tip / Cantilever Spezifikationen Einfluss auf die Wahrscheinlichkeit, dass ein Durchbruch Ereignis 17. Eine schärfere Spitze kann leicht durchstechen eine Doppelschicht als solche kann die bahnbrechende Kraft erscheinen gering oder gar nicht angezeigt, da es unter den Rauschpegel ist. . Die Erhöhung der Annäherungsgeschwindigkeit erhöht auch die bahnbrechende Kraft 16. Da die Doppelschicht durch die Spitze gedrückt wird, die Lipidmoleküle reagieren auch auf diese Kraft zu zerstreuen. Bei einer niedrigeren Annäherungsgeschwindigkeit weist die Lipiddoppelschicht genügend Zeit, um vor dem nächsten Schritt in Kraft zu äquilibrieren, und dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass ein Durchbruch Falle passieren kann. Bei einer höheren Annäherungsgeschwindigkeit die Kraft Rampen schneller als die Reaktion der Lipide und als solche ist die Wahrscheinlichkeit eines Durchbruchs Falle niedriger bei der gleichen Kraft. Es ist possIVK, dass durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Ansatz, der Sollwert vor den Doppelschicht bricht, was zu keinen beobachtbaren Peaks erreicht wird. Es gibt keine Berichte, um das Auftreten von Schultern auf der Kurve zu erklären, aber wir postulieren, dass es aufgrund der Materialverdichtung vor dem Durchbruch sein könnte. Ferner kann ein Plateau oder breite Peaks bei sehr geringen Kräften auf das Vorhandensein von Schmutz oder lose Lipidmaterial in der Spitze. Spitzen können Schmutz und Lipidmaterial in der Spanne von mehreren Messungen akkumulieren. Schmutz und Material an der Spitze befestigt macht es stumpf, wodurch die Durchbruchkraft erhöht. Es wird empfohlen, Kraftkurven sind in verschiedenen Bereichen erworben werden, wenn diese Herausforderungen entstehen. Eine zweite Empfehlung ist es, Tipps zu ändern (dies wird eine Neukalibrierung erforderlich). Schließlich muss die Anströmgeschwindigkeit auf eingestellt werden, oder die Verwendung einer Spitze mit unterschiedlichen Spezifikationen (Spitzenradius und Steifigkeit) in Betracht gezogen werden. Der Durchbruch Kraft variiert zwischen 0-50 nN 6, als solche, ter Federkonstante des Cantilevers in dem Bereich von 0,05-0,7 N / m sein. Die meisten kommerziellen Ausleger haben eine Nennspitzenradius um 20-40 nm. Anstelle der Verwendung von herkömmlichen Tipps, könnte spitzenlose Cantilever auch gekauft werden und Sphären bekanntem Radius (die in der Regel in monodisperse Größenverteilung) konnte mit ihnen verbunden werden. Um reproduzierbare Daten zu erhalten, verwenden Sie immer die gleichen Aufnahmebedingungen und Ausleger für den gleichen Satz von Experimenten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52867/52867fig1.jpg" /> Abbildung 1: Grundlagen der Kraftspektroskopie (A) Reihenfolge der Ansatz-Zurückziehen des Auslegers aus der Probe.. Die rote Linie zeigt den Cantilever Auslenkung aus der Gleichgewichtslage (schwarze Linie). (B) Cantilever Kalibrierung wandelt elektrische Signal (in Volt) bis (in Newton) zu erzwingen. Durch Aufnahme des Auslegers Sensivität und Federkonstante der Vertikalablenkung (in Volt) in Abstand und der Abstand in Kraft mit Hookeschen Gesetz umgewandelt. (C) Bei Kontakt in Kraftspektroskopie-Messungen, ist z-Piezo-Scanbewegung nicht berücksichtigt, den Cantilever zu verbiegen. Eine Korrektur kann durch Subtrahieren der vertikalen Ablenkung, x (in Längeneinheiten) von der z-Piezobewegung durchgeführt, z (auch in Längeneinheiten). Auf diese Weise bleibt der Spitze und Probe, anstatt einfach z-Piezobewegung kann gemeldet werden, was eine genauere Messung der Abstände ist und um die Dicke der Probe zu messen wichtig. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52867/52867fig2.jpg" /> Abb. 2: AFM von SLBs (A) Schematische Darstellung SLBs von DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) getrennt in Flüssigkeit ungeordnet (L d) und flüssige bestellt (L o) Phasen. (B </strong&gt;) Eine 50 &amp; mgr; m × 50 &amp; mgr; m AFM-Bild der SLBs. Das Linienprofil unten entspricht der gelben Linie im Bild. Membrandefekte (blauer Pfeil) zeigen die Dicke der Doppelschicht, um ca. 4 nm. (C) entspricht dem gelben Quadrat in B (10 &amp; mgr; m × 10 &amp; mgr; m). L o und L d Phasen sind gekennzeichnet. Das Linienprofil unten entspricht der gelben Linie im Bild. Die L o Phase erscheint 1-2 nm höher ist als die L d Phase. (D) Eine Probe Kraftkurve zeigt, wie die bahnbrechende Kraft und Membrandicke abgeleitet werden. (E) Bruchkraft und (F) Membrandicke Verteilung für L d und L O-Phasen mit Gaußschen Anpassung für die Quantifizierung. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52867/52867fig3.jpg" /> Abbildung 3: Kontaktverlust während der Bilderzeugung führt zu. Scanlinien, die nicht zum Rest des Bildes entsprechen, ist ein unterstützter Doppelschicht aus DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) mit Kontaktverlust in einigen Linien-Scans. Maßstabsleiste 2 um. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52867/52867fig4.jpg" /> Abb. 4: Herausforderungen bei der Kraftspektroskopie (A) Einige Kraftkurven haben keine Spitzen. (B) Die Kurve kann Schultern statt wohldefinierte Peaks. (C) Nach einer geringen Zunahme ein Plateau kann in Abwesenheit des Peaks auftritt. (D) Aussehen eines Plateaus zusammen mit einem gut definierten Peaks. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Membranbereich </td><td> Durchbruch Force (nN) </td><td> Membrandicke (nm) </td></tr><tr><td> L d Phase </td><td> 6 ± 1 </td><td> 4.7 &amp;# 177; 0,5 </td></tr><tr><td> L o Phase </td><td> 8 ± 1 </td><td> 6 ± 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Eigenschaften der Membran DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLBs Die L d Phase eine bahnbrechende Kraft von 6 ± 1 nN und einer Dicke von 4,7 ± 0,5 nm. Die L o hat 8 ± 1 nN und eine Dicke von 6 ± 1 nm. Der Höhenunterschied zwischen den beiden Phasen 2 ± 1,4 nm.

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Serie: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Forschung

Biochemie

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Ingenieurwesen

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Biotechnik

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Visualizing Solution Structure at Solid-Liquid Interfaces using Three-Dimensional Fast Force Mapping

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the solution conditions such as ion concentrations, pH, ligands, and trace additives, as well as the underlying crystallography and chemistry. In this context, three-dimensional fast force mapping (3D FFM) has emerged as a promising tool for investigating solution structure at interfaces. This capability is based on atomic force microscopy (AFM) and allows the direct visualization of interfacial regions in three spatial dimensions with sub-nanometer resolution. Here we provide a detailed description of the experimental protocol for acquiring 3D FFM data. The main considerations for optimizing the operating parameters depending on the sample and application are discussed. Moreover, the basic methods for data processing and analysis are discussed, including the transformation of the measured instrument observables into tip-sample force maps that can be linked to the local solution structure. Finally, we shed light on some of the outstanding questions related to 3D FFM data interpretation and how this technique can become a central tool in the repertoire of surface science.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualisierung der Lösungsstruktur an Fest-Flüssig-Grenzflächen mit Hilfe von dreidimensionalem Fast Force Mapping

Here, we present a protocol for using three-dimensional fast force mapping - an atomic force microscopy technique - for visualizing solution structure at solid-liquid interfaces with the subnanometer resolution by mapping the tip-sample interactions within the interfacial region.

Visualisierung der Lösungsstruktur an Fest-Flüssig-Grenzflächen mit Hilfe von dreidimensionalem Fast Force Mapping

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the ...

Chemie

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Visualisierung der Lösungsstruktur an Fest-Flüssig-Grenzflächen mit Hilfe von dreidimensionalem Fast Force Mapping

Visualisierung der Lösungsstruktur an Fest-Flüssig-Grenzflächen mit Hilfe von dreidimensionalem Fast Force Mapping

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen