Name: do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis at JoVE.com

We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tissue Ernte und Einfrieren von Muskelgewebe <ol><li> Euthanize die Maus mit einer Überdosis Isofluran (2-Chlor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan). Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug und verwenden Sie eine Auffangverfahren, wie einem Exsikkator oder einer Glasglocke, die ein Wattestäbchen in Isofluran getränkt. </li><li> Tod Bestätigen fest drückte Fußballen. Verwenden Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie wie Genickbruch. </li><li> Befeuchten Sie das Fell mit 70% Alkohol, um das Anhaften von losen Haarsträhnen auf die Muskeln zu reduzieren. Schälen Sie die Haut von dem Schenkel mit einer feinen Pinzette, wie # 5. </li><li> Trennen Sie vorsichtig die Muskeln von Interesse (tibialis anterior (TA) in diesem Fall) von den Knochen unter, ausgehend von der Sehne und zu entfernen. </li><li> Auszuschneiden den Muskel, bedecken Sie es in OCT (optimale Schnitt Temperatur-Verbindung), und legen Sie ihn flach auf einem markierten Einweggefrierform. Stellen Sie sicher, dass der Muskel an seinem normalen physiologischen Orientierung (Kopf bis tail) ohne Dehnung. Alternativ einfrieren den Muskel auf kleinen Styropor-Plätze und stecken Sie es mit Insektenstifte auf die richtige Länge der Muskeln zu gewährleisten. </li><li> Chill-2-Methylbutan (Isopentan) in einem Stahlbecher mit Hilfe von flüssigem Stickstoff. Dies dauert im Durchschnitt 3-5 min. Halten Sie das Rühren mit Unterbrechungen bis weiße Niederschläge beginnen, sich auf den Boden und die Wände des Bechers zu bilden. HINWEIS: Wenn dies geschieht, Isopentan optimale Gefriertemperatur erreicht hat (150 ° C) </li><li> Tauchen Die Formen, die Muskeln in der gekühlten 2-Methylbutan. Einfrieren kleinen Muskeln, wie der Membran und extensor digitorum longus (EDL) für 6-12 sec und größere Muskeln wie gastrocnemius soleus (GS) und Trizeps für 15-20 sec. Die Muskeln Nicht einfrieren zu lange, da dies zu Rissen führen. </li><li> Übertragen Sie die gefrorenen Gewebe auf Trockeneis und lassen Sie die Isopentan verdampft (beachten Sie, dass dieser Prozess dauert im Durchschnitt etwa 15 bis 20 min). Wickeln Sie das Gewebe in Aluminiumfolie und im Kühlschrank bei ultra niedriger Temperatur (-70 ° C bis -80 ° C) bis zum Schneiden. </li></ol> 2. Einbindung der Gewebe in OCT zu Tissue-Block vorbereiten <ol><li> Transport Gewebe auf Trockeneis zu cyrostat zu Auftauen zu verhindern. Transfer Gewebe Kryostatkammer (bei -20 bis -24 ° C eingestellt, um volle Auftauen der Gewebe zu vermeiden) und lassen Sie sie für 30 Minuten ins Gleichgewicht kommen. </li><li> Drehen Sie das Peltier-Kühlschacht auf. Wenn der Kryostat nicht diese Kühlung haben, verwenden Aerosolkühlspray, schnell einfrieren Oktober Lassen Sie sich nicht den Muskel Tauwetter zu irgendeinem Zeitpunkt während der Einbettung, da dies zu Frostschäden führen. </li><li> Fügen Sie eine gleichmäßige dünne Schicht von Oktober auf der Probenscheibe und abkühlen lassen. Wenn die meisten der Oktober ist auf dem Boden, während immer noch Flüssigkeit auf der Oberseite eingefroren, legen Sie die Gewebe an der richtigen Ausrichtung (senkrecht zur OCT zur Querabschnitte und parallel Oktober für Längsschnitte). Benutzen Sie Aerosol-Kühlspray, schnell einfrieren Oktober Tippen Sie auf die unembeded Teil des Gewebes mit Wärme extRactor und warten Sie 45 Sekunden. </li><li> Fügen Sie eine weitere dünne Schicht Oktober rund um die Muskeln, Aerosolspray mit Kühlspray und extrahieren Sie die Hitze wie im vorherigen Schritt. </li><li> Halten Sie das Hinzufügen Oktober in kleinen Schritten und schnell einfrieren des OAT mit einer Kombination von Aerosol-Kühlspray und Wärmeableitblock bis der ganze Muskel wird abgedeckt. </li><li> Legen Sie die Wärmeableitblock auf der Oberseite der Gewebeblock, und warten Sie 5 Minuten. </li></ol> 3. Vorbereitung Profile und Identifizieren der Teile von Mid-Bauch Region der Muskeln <ol><li> Montieren Sie die Probe auf die Probe Kopf. Ziehen Sie den Knopf, um die Disc zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Objektplatte ist in einem guten Kontakt mit dem Objektkopf. </li><li> Passen Sie die Raumtemperatur zwischen -21 und -24 ° C, und warten Sie, bis die eingestellte Temperatur erreicht ist. </li><li> Passen Sie die Einstellungen Dicke (7 &amp; mgr; m); schneiden Sie den Block durch Vorschieben oder Zurückziehen des Blocks mit Grob- und Feineinstellungen. </li><li> Sammeln Sie die AbschnitteAuf vorgewärmten positiv geladenen Objektträgern durch Drücken der Oberseite des Schiebers auf die Abschnitte mit der Anziehung zwischen entgegengesetzten Ladungen, um die Haftung der ausgeschnittenen Abschnitte zu der Folie zu erleichtern. </li><li> Identifizieren Sie die Mitte der Bauchabschnitte durch Messung Querschnittsfläche (CSA) der Abschnitte. Tun Sie dies mit Imaging-Software auf dem Computer, an das Mikroskop angeschlossen ist. HINWEIS: Phasenkontrastbilder aufgenommen und Umfang des gesamten Muskel wird über eine Rückverfolgung-Funktion auf dem Software-Programm gemessen. Dies wird sowohl CSA sowie minimale Frettchen Messer (Maß für die Faserquerschnittsgröße, die als der kleinste Abstand zwischen zwei parallelen Tangenten an gegenüberliegenden Seiten eines Teilchens ausgedrückt wird) Messungen zu erhalten. Hinweis: Bei der CSA und Frettchen Mindestdurchmessermessungen beginnen, Plateau, hat Mitte Bauch erreicht ist. </li><li> Inventur und Archivierung der Objektträger bei -80 ° C für die künftige Färbung. HINWEIS: Oktober muss nicht vor der entfernt werden, um staining Verfahren. Sobald Folien eingedeckt werden, sind sie bereit, sofort gefärbt werden. </li></ol> 4. Die Färbung HINWEIS: Während ausführliche Schritt-für-Schritt-Verfahren finden Sie auf der Produkt-Datenblatt entnommen werden und sollte für Färbeverfahren befolgt werden, können persönliche Optimierung erforderlich, um eine optimale Färbung zu erhalten. <ol><li> Da die Montage Medien (siehe Tabelle) ist nicht mit Wasser mischbar ist, dehydrieren gleitet durch zunehmende Grade von Alkohol (2 min jeweils in 70%, 95% und 100% Ethanol), und deaktivieren Sie sie mit Xylol (100% für 5 Minuten), um sicherzustellen, Dias nicht undurchsichtig über die Zeit. </li><li> Deckglas Sektionen und trocknen lassen. Bild mit Mikroskop mit Bildbearbeitungssoftware ausgestattet. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Histologie und Immunhistochemie wurden als wichtige Instrumente für das Verständnis der Manifestation und Progression der Pathologie in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen eingesetzt. Klassischerweise wurden Muskelbiopsien ersten in Formaldehyd fixiert und dann mit Paraffinwachs eingebettet. Während Formaldehydfixierung bewahrt Gewebearchitektur und ermöglicht Gewebe Lagerung und Transport bei RT, inaktiviert es auch Enzyme und Proteine ​​Vernetzungen erfordern weitere Schritte, um genaue Immunfärbung zu erzielen. Dieses Problem wird bei der Verwendung von Gefrierschnitten eliminiert aber diese Methode ist mit besonderen technischen Herausforderungen bei der Erzielung optimaler Färbeergebnisse und genaue Auslegung 14,15. Erstens ist es wichtig, daß die Proben nach der chirurgischen Exzision sofort eingefroren werden, da die Autolyse und die Zersetzung beginnt kurz nach der Entnahme aus dem Körper. Gewebe muß schnell und gründlich für die richtige Menge an Zeit, die in Abhängigkeit von der Größe abhängig gefroren/ Dicke des Gewebes. Wenn dies nicht richtig gemacht, Frostschäden auftreten Rendern des Gewebes nutzlos für die histologische Auswertung. Nach dem Gefrierpunkt, muss Gewebe sofort auf Trockeneis gelagert werden und dann zu einem extrem niedrigen Temperaturen (-80 ° C) Gefriertruhe übertragen bis zum Schneiden. Es ist wichtig zu beachten, dass Gewebe nicht aus dem Gefriergerät ohne auf Trockeneis weil Gefrier-Tau auch Gewebearchitektur beschädigen entfernt werden. Noch ein Hinweis von Bedeutung bei der Durchführung histologische Analyse ist darauf zu achten, immer den gleichen Teil des Gewebes von Interesse zu analysieren, um die Einheitlichkeit unter Analyse zu gewährleisten. Dies kann für die Muskelabschnitte durch Ausführen Analyse der midbelly erfolgen. Dies ist der Teil des Muskels, der am dicksten ist und damit die größte Querschnittsfläche haben. Um sicherzustellen, dass Sie tatsächlich die Schnitt midbelly sollte CSA von nachfolgenden Abschnitten mit histologischen Imaging-Software gemessen werden. Measurements sollte weiterhin gemacht werden, bis die Querschnittsfläche beginnt Plateau. Sobald dies der Fall, hat die Mitte der Bauch erreicht ist; nur diesen Teil des Gewebes für die histologische Analyse sollte verwendet werden, um die Einheitlichkeit unter Vergleiche zu gewährleisten. 2 Stunden - nach dem Schneide abgeschlossen und Folien hergestellt worden sind, sollten sie bei RT 1 trocknen. Trocknen ermöglicht die richtige Einhaltung des Abschnitts auf den Objektträger und verhindert auch, dass überschüssiges Wasser zu kristallisieren folgenden Transfer auf -80 ° C Tiefkühltruhe. Es ist wichtig zu beachten, dass Objektträger sollte auch nur auf Trockeneis bei der Auswahl von Folien für die Analyse, um Einfrieren und Auftauen zu verhindern behandelt werden. Sobald Objektträger für die Färbung gewählt wurde, enthalten Protokolle mit der Fleck sollte zunächst probeweise gefolgt werden, bis optimale Ergebnisse erreicht wurden. Bei der Durchführung von Immunfärbung, ist es wichtig, um sicherzustellen, gleitet nicht während des gesamten Verfahrens zu trocknen. Das Trocknen der Folien kann in transienten Interaktion führens auf intakte nach Inkubation bleiben. Diese Wechselwirkungen können nicht während Waschvorgängen entfernt werden, und führen zu nicht-spezifische Färbung. Die Trocknung kann, indem Objektträger in einer feuchten Atmosphäre vermieden werden. Darstellende Inkubationen mit Abschnitten mit Parafilm und gleitet auf einem feuchten Papiertuch in einer kleinen Rutsche Box versiegelt abgedeckt ist ausreichend, um Objektträger wird nicht trocken zu jedem Zeitpunkt während des Verfahrens zu gewährleisten. Histologie ist ein wichtiges Instrument bei der Visualisierung Morphologie und verschiedene Aspekte der Pathologie. Während etwas trivial, ist es von größter Bedeutung, um große Sorgfalt bei der Herstellung von Gewebe zu ergreifen, um für die Histologie verwendet werden. Von Exzision, um ein Einfrieren, Schneiden und Färben, sollten Gewebe in einer Weise, die Frostschäden zu vermeiden wird und liefern die genauesten Bilder möglich behandelt werden. Ohne die richtige Konservierung, wird die Färbung nicht genau Physiologie und damit zu Fehlinterpretationen führen.

Prüfung der Muskel Histologie spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis der verschiedenen Arten von neuromuskulären Störungen 1-4. Wenn sie mit anderen Techniken kombiniert, erlaubt es Forschern, eine bessere Vorstellung von der Manifestation und Progression der Pathologie zu bekommen und kann auch wichtig sein, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Interventions 5-10 bewerten. Jedoch genau zu sein, müssen die Gewebe in der richtigen Art und Weise gespeichert, die den physiologischen Zustand unmittelbar vor dem Herausschneiden erhalten. Dies erfordert große Sorgfalt bei der Entnahme, Konservierung, Schnitte, und Färbung. Gewebe können auf zwei verschiedenen Wegen für lichtmikroskopische Untersuchung vorbereitet werden. Das erste Verfahren, Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Abschnitten erfordert Gewebe in 10% gepuffertem Formaldehyd natürlichen bevor sie mit Paraffin eingebettet 11,12 fixiert werden. Der Fixierungsschritt hilft, Morphologie besser zu bewahren, sondern auch Querverbindungen endogenen proteins macht es erforderlich komplizierte Antigen-Retrieval-Verfahren für die Immunfärbung und die Beseitigung der Möglichkeit der enzymatischen Flecken auf solche Abschnitte 12. Gefrierschnitte andererseits brauchen nicht vor, eine feste oder verarbeitet werden sollen; daher sind Proteine ​​in der Lage, native biologische Konformationen 13,14 beibehalten. Ferner gefrorene Schnitte auch schnelle Durchlaufzeit, die manchmal notwendig ist, beispielsweise in der intraoperativen Diagnose von Sarkomen und anderen chirurgischen Biopsien 15 ermöglichen. , Wenn nicht richtig gemacht, Diese Methode ist jedoch anfällig für Schäden, die Änderungen an Muskel-Architektur macht die Abschnitte ungeeignet für die histologische Untersuchung stellt einfrieren. Dieses Papier wird die effektivste Methode, um Muskelbiopsien, um eine optimale Färbung für die ordnungsgemäße Prüfung zu erreichen vorbereiten zu skizzieren.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123&lt;br /&gt;Alternative: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500&lt;br /&gt;Alternative: Olympus</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Nikon Imaging Software Basic Research</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500&lt;br /&gt;Alternatives: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.</td></tr><tr><td>OCT</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Disposable tissue mold</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis

Histologische Bewertung von Muskelbiopsien wurde als unverzichtbares Instrument für das Verständnis der Entwicklung und Progression von Pathologie der neuromuskulären Erkrankungen serviert. Um dies zu tun, muss jedoch die richtige Pflege, wenn das Ausschneiden und die Erhaltung Gewebe, um eine optimale Färbung erreichen ergriffen werden. Eine Methode der Gewebekonservierung beinhaltet Befestigungs Gewebe in Formaldehyd und dann Einbettung mit Paraffinwachs. Dieses Verfahren bewahrt Morphologie gut und ermöglicht langfristige Lagerung bei Raumtemperatur, ist aber umständlich und erfordert Umgang mit giftigen Chemikalien. Ferner Formaldehydfixierung ergibt Antigen Vernetzung, die Antigen-Retrieval-Protokolle für eine wirksame Immunfärbung erfordert. Im Gegenteil, ist gefrorene Schnitte nicht Fixierung erfordern und somit behält biologischen Antigen-Konformation. Dieses Verfahren stellt auch einen entscheidenden Vorteil in der schnellen Durchlaufzeit, so dass es besonders hilfreich in Situationen, brauchen schnelle histologische Auswertung wie intraoperative chirurgischen Biopsien. Hier beschreiben wir die effektivste Methode zur Herstellung von Muskelbiopsien zur Visualisierung mit unterschiedlichen histologischen und immunologischen Flecken.

Das Set-up für die Ernte und das Einfrieren von Gewebe kann in 1 gesehen werden kann. Entfernte Gewebe sollte auf eine Gaze in PBS eingeweicht, um das Trocknen (1A) zu vermeiden, gespeichert werden. Werden die Gewebe so ausgewählt sind, für die histologische Analyse verwendet werden, sollten in OCT eingetaucht werden und auf Kryo Form gelegt in der richtigen Orientierung und so nahe physiologischen Länge möglichst genaue Morphologie (1B) zu gewährleisten. Aufschlämmung von Isopentan geeignet für Gewebe Gefrieren kann durch Kühlung Isopentan in flüssigem Stickstoff und Rühren bis sich kleine weiße Niederschläge am Boden erscheint erreicht werden. An diesem Punkt ist die Medien eignet sich zum Einfrieren (Abbildung 1c). Gewebe sollten 6-15 sec in gekühltem Isopentan abhängig von der Größe / Stärke des Gewebes (1D) eingefroren werden. Nach dem Gefrieren wird der Muskel kalkweiß an welcher Stelle es sollte auf Trockeneis gelagert werden angezeigt und später übertragen auf -80 &lt;strong&gt; ° C Tiefkühltruhe. Kryostat-Einstellung und Zutaten für die Zubereitung der Muskel-Block durch die schrittweise Einbetten des Gewebes im Oktober erforderlich sind in Abbildung 2 dargestellt. Der Kryostat sollte zwischen -20 und -24 ° C (Abbildung 2A) festgelegt werden. Oktober und gefrier Es sollte leicht zugänglich Block geeignet zum Schneiden zu schaffen. Im Inneren des Kryostaten sollten kleine Bürsten zu manipulieren und zu glätten Zuschnitte für Dia machen und Pinzette zur Handhabung von Gewebeblock, weil sie niemals mit den Händen berührt, um das Gewebe zu gewährleisten müssen eingefroren (2B). OCT sollte, um Gewebe hinzugefügt, um Schnittblock zu erstellen, sondern muss sofort eingefroren mit gefrier Es sprühen und dann weiter mit Wärmeschleuder hier abgebildet (Abbildung 2C) gekühlt werden. Für Querschnitte sollten Gewebe auf der Objektkopf, so daß sie senkrecht zu der Klinge (2D) ausgerichtet ist, platziert werden. SeArmaturen sollte so eingestellt werden, um die gewünschte Schnittdicke (5-10 &amp; mgr; m je nach Gewebe) zu erreichen. Wenn es richtig gefroren sollte das Gewebe Gesicht kreideweiß sein, während ein Gewebe, das bei der Montage nicht ordnungsgemäß eingefroren oder aufgetaut wurde, wird rot / rosa angezeigt. Abbildung 3 zeigt repräsentative Gewebe für unsachgemäß behandelt Proben (3A) und richtig gehandhabt Proben (3B) . Die Mitte der Bauchregion wird durch Messen CSA und Frettchen Mindestdurchmesser mit einem Mikroskop mit Phasenkontrastoptik und Bildanalyse-Software eingesetzt wurde. Ein Vertreter Screenshot von Analyse-Software ist in Abbildung 4 dargestellt. Hämatoxylin und Eosin gefärbt Bilder einer ordnungsgemäß eingefroren und geschnitten Biopsie sowie ein Einfrieren beschädigt Biopsie tibialis anterior (TA) Muskeln werden in Abbildung 5 dargestellt. Bereiche, die ordnungsgemäß verarbeitet werden müssen konsistente morphology und sogar Färbung im gesamten (5A). Nicht ordnungsgemäß verarbeitet Muskeln, die freeze beschädigt sind oder vorzeitig aufgetaut wird angezeigt, mehrere Pausen in der Morphologie haben und haben das Aussehen von &quot;Weizenschrot&quot; (5B). Abbildung 6 zeigt feuchten Kammer für eine optimale Immunfärbung. Die Objektträger sollten mit Parafilm abgedeckt werden, auf einem nassen Papiertuch gehalten und in einer kleinen Box, um Austrocknen der Abschnitte während Immunfärbung zu vermeiden versiegelt. 7 zeigt eine Beispiel Immunhistochemie Folie, die gut vorbereitet und gefärbt worden ist. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Herstellung und bis zur richtigen Gewebe eingestellten Gefrier. (A) Herausgeschnittene Gewebe sollten auf Gaze in PBS getränkt gespeichert werden. (B) Gewebe selectedfor histologischenAnalyse eingetaucht in OCT und ausgelegt auf Kryo Form in der richtigen Orientierung (von Bauch-Sehne) und so nah an physiologische Länge wie möglich. (C) Gülle Isopentan geeignet für Gewebe. Hinweis: kleine weiße Niederschläge an der Unterseite angezeigt. (D) Gefrorenes Gewebe nach dem Eintauchen in Isopentan. Hinweis:. Kreidig weiße Erscheinung <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Kryostat Einstellungen und Zutaten zum Schneiden erforderlich. (A) Kryostat gesetzt zwischen -20 und -24 ° C mit Oktober und Aerosolkühlspray leicht verfügbar. (B) Im Inneren des Kryostaten Setup komplett mit kleinen Bürsten zu manipulieren und zu flach geschnitten Abschnitons für Dia machen und Pinzette zur Handhabung der Gewebeblock. (C) Gefrorene Gewebeblock bereit, mit Wärmeableitblock (weißer Pfeil) gekühlt werden. (D) Gewebeblock am Montagekopf bereit, geschnitten werden gesetzt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Representative Gewebe richtig und falsch erhaltenen Muskeln. (A) ist nicht ordnungsgemäß eingefroren oder verarbeitet (B) ordnungsgemäß eingefroren und behandelt Muskel. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt= &quot;4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52793 / 52793fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 4. Bestimmung der Querschnittsfläche der TA Muskel mit Nikon Imaging-Software. Screenshot Phasenkontrastbild der Muskel Abschnitt mit vorstellen Software zur Messung von CSA und min Frettchen Durchmesser, die eingekreist hat von. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig5highres.jpg" width="700" /> Abbildung 5. Repräsentative Bilder von richtig und falsch vorbereitet H &amp; E gefärbten Muskeln. (A) richtig verarbeitet Abschnitt. (B) ist nicht ordnungsgemäß verarbeitet Einfrieren beschädigt Muskelbereich. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte cli</a>ck Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig6highres.jpg" width="600" /> Abbildung 6. feuchten Kammer für Immunfärbung. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig7highres.jpg" width="350" /> Abbildung 7. Beispiel Immunhistochemie Schieber richtig vorbereitet und fleckig Rutsche. Slide mit Fibronectin (grün) und DAPI (blau) gefärbt wurden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

31.8K Aufrufe.  Boston University. Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Serie: Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Neurowissenschaften

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Biologie

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

Medizin

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible cytoplasmic compartments. Another hurdle is the tight apposition of myofibers to the surrounding tissues. Because the process of tissue fixation and paraffin embedding leads to the shrinkage of muscle fibers, freezing is an optimal means of hardening muscle tissue for sectioning. However, a commonly encountered issue, the formation of ice crystals, occurs during the preparation of frozen sections because of the high water content of muscle. The protocol presented here first describes a simple and efficient method for properly freezing muscle tissues by immersing them in liquid nitrogen. The problem with using liquid nitrogen alone is that it causes the formation of a nitrogen gas barrier next to the tissue, which acts as an insulator and inhibits the cooling of the tissues. To avoid this "vapor blanket" effect, a new cryovial was designed to increase the speed of liquid flow around the tissue surface. This was achieved by punching a total of 14 inlet holes in the wall of the vial. According to bubble dynamics, a higher rate of liquid flow results in smaller bubbles and fewer chances to form a gas barrier. When liquid nitrogen flows into the cryovial through the inlet holes, the flow velocity around the tissue is fast enough to eliminate the gas barrier. Compared to the method of freezing muscle tissues using pre-chilled isopentane, this protocol is simpler and more efficient and can be used to freeze muscle in a throughput manner. Furthermore, this method is optimal for institutions that do not have access to isopentane, which is extremely flammable at room temperature.

This protocol describes a procedure to freeze muscle tissues by plunging them directly into liquid nitrogen. This protocol also highlights a new cryovial that can avoid the &#34;blanket effect&#34; of nitrogen gas when liquid nitrogen contacts the tissue surface of a specimen.

Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.