Name: in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow
Uploaded: 2015-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
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The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

HINWEIS: Die Universität von Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt alle Experimente. 1. Herstellung von Ultraschall-Mikroinjektion Instrumente und Embryonen <ol><li> Up-Phase, Berg und Sonde (Abbildung 1) sowie chirurgische Instrumente (Abbildung 2) ein. Statt phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,4) in einem 37 ° C Wärmebad. Füllen Mikroinjektionsnadel vollständig mit Mineralöl, mit 1 ml Spritze auf eine zweite flexible 25 G Nadel befestigt, über seine Basis. </li><li> Fix Nadel auf Drehhalterung Arm und leere Nadel des Mineralöllösung. Re-fill mit 2,5 ul TL Lösung. Sicherzustellen, daß keine Luftblasen innerhalb der Injektionsnadel vorhanden sind. Drehen Nadel Arm in Richtung Wand, weg von der Bühne. </li><li> Anesthetize die schwangere Mutter in der Anästhesie Kammer über eine kontinuierliche Infusion von Isofluran. Als Mutter ist bewusstlos, übertragen Sie die Narkose zu Nasenschlauch auf der c positioniertaudal Seite der Bühne und Ort Mutter in Rückenlage mit der Schnauze in Nasenschlauch, eine Fortsetzung einer vollständig betäubt Zustand ermöglichen. </li><li> Band Gliedmaßen in 45 ° Winkel oder mit Händen und Füßen ausgeruht und positioniert overtop ECG / Temperaturwächter Registerkarten. Wichtig ist, dass die schwangere Damm wird kontinuierlich überwacht, um sicherzustellen, dass die Anästhesie reicht und Salbe in angewandter für die Augen, um das Trocknen zu reduzieren. </li><li> Übernehmen Haarentfernung Produkt in Unterleib der Mutter, wischen Sie mit einem trockenen Wattestäbchen, und dann noch einmal mit 70% Ethanol-gesättigte Wattestäbchen, um überschüssiges Produkt und Haare zu entfernen. Achten Sie darauf, um Bauchhaut sauber aus aller Haare an der Stelle der Inzision (Abbildung 3). </li><li> Führen Sie eine Laparotomie auf der schwangeren Mutter mit feinen chirurgischen Pinzette und Schere. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, schneiden keine großen Gefäße oder inneren Organen. Stellen Sie zuerst, gerade Schnittführung der Epidermis 1,5-2 cm über Vagina und weiter in Richtung Rippen für approximat geschnittenely 2-3 cm. Setzen Sie das Unterhautmembran, suchen Sie die Linea alba (&quot;weiße Linie&quot;) (Abbildung 3) und parallel zur anfänglichen Schnitt geschnitten, entlang der gleichen Länge, zu entlarven interne Eingeweide und Gebärmutter Säckchen. </li></ol> 2. Gewinnung von Embryonen <ol><li> Verwenden Sie 6-Zoll-Wattestäbchen, um Mutter und Embryonen zu manövrieren. Drücken Sie vorsichtig (nicht mit Gewalt) auf der Haut mit Applikator zum ersten Embryo aus Schnitt Öffnung manipulieren. Nach der Extraktion der ersten Embryo Sacculus, langsam und vorsichtig ziehen Sie den Rest der Uterushorn durch und auf Außen der Mutter. Vermeiden Sie es, Darm und andere Organe durch Einschnitt in dieser Phase. </li><li> Quantifizieren Embryonen und schonend zu platzieren linken Uterushorn wieder in die Mutter. Dann beginnen Platzierung der rechten Uterushorn wieder in die Mutter mit dem Embryo Sacculus weitesten von der Scheide auf dem Horn und nach unten bewegt. Setzen Sie diesen, bis nur noch zwei Embryonen bleiben ausgesetzt (FiAbbildung 4). Schließlich Position Embryonen in einer Säule über und parallel zur Schnittführung, wird bewusst nicht abzuschneiden Gebärmutterblutung. </li><li> Zeigen Mauerziegel und Position zwischen Armen und Körper sowie Beine und Schwanz. Stellen Sie sicher, dass die Ton-Oberflächen sind etwa in Höhe Laparotomieschnitts. Befeuchten Sie die gefenstert Petrischale mit 37 ° C PBS. </li><li> Fassen Erweiterung Zange mit der rechten Hand und gefenstert Petrischale mit der linken Hand (Fenster parallel Embryonen), und bringen geschlossenen Pinzette ~ 5 cm durch Fenster, von der Spitze der Petrischale. Offene Zange komplett ohne zu reißen Fenstergitter. </li><li> Manövrieren Sie die Hände über Embryonen und konzentrieren Blick auf die beiden Embryo Säckchen. Ohne (oder leicht) berühren Säckchen mit Fenster Vernetzung oder Zangen, schieben Sie sie durch den Schlitz und legen Petrischale auf Bauch der Mutter. Mit einer Pinzette noch erweitert, manipulieren gefenstert Mesh, um es auf beiden Seiten und am Boden jeder Embryo zu setzen (Abbildung 5 </strong&gt;) und aus der Schlitzöffnung ziehen Pinzette. </li><li> Als nächstes legen blauen Gummi Umfassungswand in Petrischale, ohne zu drücken oder zu verletzen Embryonen (Abbildung 6). Stellen Sie sicher, Mauerziegel fest Ausgleich Petrischale, Embryo und kautschukhaltige Wand. Schließlich füllen Petrischale mit 37 ° C PBS bis Embryonen vollständig eingetaucht ist (Abbildung 6), bei der Kontrolle auf Dichtheit bei gefenstert Vernetzung. </li></ol> 3. Injektionsverfahren <ol><li> Niederinjektionsstufe mit Mutter und Embryonen nach unten mit Z-Ebene Einstellknopf (Bild 1) und drehen Injektionsnadel und montieren Arm und richten Sie direkt mit Ultraschallsonde, mit Nadel ½ cm nach links und unter der Sondenspitze (Abbildung 7) . Schieben nadel Arm (nicht Nadel) 45 ° von der Sonde. Darauf achten, dass die Spitze der Nadel mit der Schale oder Ultraschallsonde getroffen. </li><li> Heben Injektionsstufe zurück zur ursprünglichen Höhe, mit Ultraschall pBademantel direkt über Embryonen Probe muss leicht eingetaucht werden und innerhalb von 3-4 mm der embryonalem Gewebe. Verwenden Sie X &amp; Y-Tisch Einstellknöpfe (Abbildung 8), um den Embryo / Mutter / Tischposition systematisch suchen Sie das Schlagen embryonalen Herzen ändern. </li><li> Direkt Zentrum von Ultraschall-Bildschirm beobachten ein schwarzes Zentrum Zielmarkierung gezeichnet (*). Suchen linken Herzkammer (empfohlen) oder den Vorhof über die Bühne Einstellknöpfe X &amp; Y (Bild 8) und dann nach oben oder unten die Bühne mit Drehknopf auf der Bühne, um Einspritzziel genau über der schwarzen Mittelmarkierung auf dem Ultraschallbildschirm zu positionieren. </li><li> Verwenden Sie X Bühne Einstellknopf, um Embryos nach rechts zu bewegen, aus der Ultraschall-Bildschirm. Repositionieren Mikroinjektionsnadel und wieder an seinen Platz zu bewaffnen, ½ cm von 90 ° zu der Ultraschallsonde (7). </li><li> Mit Hilfe der Mikroinjektion montieren Einstellknöpfe (9C-G), Position Nadel mit der Spitze deutlich almit der Mittenmarkierung igned. Einstellen Injektionswinkel (mit Noppen in 9C &amp; EG), und X, Y und Z Vektoren Mikronadel sicherzustellen Nadelspitze in der richtigen Ebene fokussiert. Einfahren Mikroinjektionsnadel mit ausschließlich den &quot;Einspritzen&quot; Knopf (9F), darauf achten, nicht zu anderen Dimensionen anzupassen. </li><li> Auch ausschließlicher Verwendung des X Feineinstellung der Bühne Knopf bewegen Embryo wieder unter die Sonde mit Ziel genau auf dem Mittelpunkt auf dem Ultraschallbildschirm. Sicherzustellen, dass die linke Herzkammer ist nun genau auf der gleichen X, Y und Z-Ebene. </li><li> Als nächstes wird mit nur der &quot;Injektion&quot; Knopfes auf der Mikroinjektion zu montieren, langsam stechen Embryo mit der Mikroinjektionsnadel und allmählich Spitze in die linke Herzkammer zu bringen. Injizieren Sie den vollen 2,5 ul TL-Lösung in die linke Herzkammer oder, bis die Leermeldung ertönt ein Signalton, indem &quot;leer&quot; und tippen Sie &quot;füllen&quot; einmal (2A &amp; B). Zu diesem ZeitpunktInjektions beobachten einen Schatten von der Spitze der Nadel, die der TL Eintritt in die Herzkammer (10) ist ausgeht. In umgekehrter Richtung, schnell zurückzuziehen Mikroinjektionsnadel Drehen des &quot;Einspritzen&quot; Knopf (9F) auf der Mikroinjektion zu montieren, wenn die Einspritzung abgeschlossen ist. </li><li> Weiter geht es zum nächsten Embryo und wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Embryonen nach dieser Reihe von Schritten, anschließend noch die letzten Embryonen wieder in der Mutterleib. Schalten Narkose Kammer Box und sanft bewegen Mutter hier für 15 Minuten vom Zeitpunkt der letzten Injektion. </li></ol> 4. Ernten Embryonen und Analyse <ol><li> Sacrifice Damm über Genickbruch. Erweitern Sie den Laparotomieschnitts leicht zu entfernen Uterushörner von der Mutter. Halten Sie die Embryonen im Uterus-sac. Zeigen Embryonen in PBS gekühlt. </li><li> Sezieren Embryonen aus Gebärmuttersack (ggf. sammeln Gewebe für die Genotypisierung) und setzen Sie die gesamte Embryo in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht, dann in 30% Saccharose über Nacht gefrier in Kryostaten Schnitt Medium. Dann schneiden Sie die Kryoschnitt und legen Sie sie auf Objektträger für die immunhistochemische Analyse. Optional können Gewebe für ganze Montage durch Dehydratisierung in 100% Methanol, nach Fixierung in 4% PFA. </li><li> Für immunhistochemische Analyse legen Sie die Gefrierschnitte in PBS, um die OCT entfernen. Dann blockieren die Schnitte mit 10% normalem Eselserum für 30 min. Dann fügen Sie PECAM primären Antikörper bei 1: 100 Verdünnung über Nacht bei 4 ° C. Am nächsten Tag, waschen Sie die Folien in PBT 3 mal für 10 Minuten jeweils, und fügen Sie Esel-anti Ratte 594 sekundäre und Inkubation für 1 h bei RT. Anmerkung: Dies ist eine sehr anspruchsvolle Technik zur Optimierung und Koordinierung von Ultraschall und Mikroinjektion erfordern. Es gibt eine sehr steile Lernkurve, um diese Technik verwandt und benötigt vier bis sechs Wochen von Mentor-Injektionen vor wird man kompetent. </li></ol>

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	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Mikroinjektionsanästhesie und Zeitrahmen Im Hinblick auf die Betäubung der Mutter, ist es wichtig, um den Luftstrom konstant (2-3 l / min) und bei niedrigen PSI halten. Die Strömung des Beruhigungs muß bei etwa 1,75-2 L / min gehalten werden. Gleichzeitig müssen Zeitrahmen, in dem die Injektionen erfolgen genau beobachtet und mit jedem Wurf gesteuert werden. Für jeden Wurf sollte das Injektionsverfahren unter 45 Minuten gehalten werden. Die Bedeutung dieser Frist ist ausschlaggebend f?...

Während der Embryonalentwicklung zwei diskrete, aber gleichzeitigen, vaskuläre Prozesse ab: Angiogenese, der Prozess, bei dem ein Schiff wächst aus einem großen bereits vorhandenen Behälter und Vaskulogenese, die eine Neubildung von Gefäßen aus Wohn endothelialen Vorläuferzellen 1,2 ist. Beziehungsweise die erstere auch mit dem Blutfluss, während die letzteren wird angenommen, dass in Abwesenheit von weitgehend übernehmen. Parallel zur Bildung von Blutgefäßen, beginnt ein zyklischer und dynamischer Prozess von Nierenvorläuferzellen Synthese, Proliferation und Differenzierung der embryonalen Tag 9.5 (E9.5) zu entfalten. An diesem Punkt der Ureterknospe (UB) dringt dorsal in das umgebende Mesenchym metanephrischen (MM), und wird fortgesetzt, bis der Geburt 3. Wiederholtes Verzweigung des UB in schnell Kondensieren metanephrischen Kappe Mesenchym beginnt somit die Bildung der funktionellen Einheiten der Niere, Nephron. Mit jeder neuen Generation von UB und nephron, werden die älteren Generationen in inneren kortikalen und medullären Regionen, in denen sie dann weitere Reifung und Differenzierung in erster Linie Gefäßreichen Umgebungen zu unterziehen verdrängt. Wie von Dressler et al. 3 hervorgeht, wird diese embryoProzess durch eine induktive Signalfällt, wie Übersprechen zwischen UB und M, und eine Vielzahl von extrazellulären Faktoren 3-6. Zwei vor kurzem untersuchten extrazellulären Faktoren innerhalb des Entwicklungs Bauchspeicheldrüse und Nieren gehören Sauerstoffdruck und Blutfluss 7,8. Letzteres wird in weiteren Einzelheiten nachstehend mit Bezug auf die Nierenentwicklung diskutiert. Um die induktive Rolle, Blutfluß potentiell spielt in Nephron Vorläuferzelldifferenzierung, sowie in anderen Organprozessen präzise und genaue Methoden der embryonalen Blutfluß Mapping belichten ist zwingend erforderlich. Alternative Methoden zur Messung des Blutflusses sind die Verschreibung von ultrasound Bildgebung und Harz wirft 9,10. Abschließend diese Modi wurde gezeigt, dass von Natur aus fehlen in ihrer Fähigkeit, gleichzeitig zu enthüllen zeitlichen und räumlichen Nebeneinander zwischen den Blutfluss und der Stammzelldifferenzierung. Harzabgüsse zum Beispiel geben Sie eine gültige Modell des Schiffes Strukturierung in adulten Geweben jedoch in unreifen Gefäße, wie zum Beispiel mit embryonalen Zeitpunkten, sind Gefäße stark unterentwickelt und undicht. Daher wirft Harz nicht innerhalb der winzigen, oft porös, Schiffe zu halten. Für diese offensichtliche Hindernisse, unter anderem, haben wir beschlossen, ultraschallgeführte in vivo intrakardiale embryonalen Tomaten Lektin (TL) Mikroinjektionen in unseren Untersuchungen der Nierenentwicklung zu integrieren. In diesem Verfahren verwenden wir eine Ultraschallsonde zum synchronen Führen eines montierten Mikro Nadel mit 2,5 ul TL Lösung gefüllt ist, in den linken Ventrikel von Mausembryonen an E11.5, E13.5, E15.5 und E17.5 Zeitpunkten. E17.5 Ist die letzte Entwicklungsalter, wenn die Nadeln sind nicht stark genug, um den weiter entwickelten Embryo eindringt. Die Vorteile dieser Methode der Mikroinjektion sind reichlich vorhanden. Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion ermöglicht präzise Positionierung einer Injektionsnadel in der embryonalen linken Herzkammer, passive und kontrollierte Vertreibung der Lösung in das schlagende Herz des Tieres, minimale Schäden an Herz und das umgebende Gewebe und die Vermeidung des plötzlichen Herzstillstand und Tod des Embryo vor der Ganzkörper-Durchblutung. Mit der Verwendung eines FITC-markierten TL wird jede perfundiert Vaskulatur der Marker entlang ihrer endothelialen apikalen Membran aufrechtzuerhalten. In Kombination mit Immunohistochemie unter Verwendung von PECAM (CD31, Platelet endothelial cell adhesion molecule) und verschiedene andere vaskuläre Marker sind wir in der Lage, klar zwischen perfundiert und un-durchbluteten Gefäße sowie charakterisieren anyaberrant Färbung der umgebenden Gewebe.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>022M4004V</td><td>concentration 1:5,000</td></tr><tr><td>Pecam</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>concentration 1:100</td></tr><tr><td>FITC-Tomato Lectin</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1321</td><td>concentration 2.5 &amp;micro;l / embryo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-585-150</td><td>concentration 1:200</td></tr><tr><td>Microinjection Needle</td><td>Origio Mid Atlantic Devices</td><td>C060609</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-20</td><td></td></tr><tr><td>Clay Blocks</td><td>Fisher Scientific</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-380</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9763655</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Product</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Marking Pen</td><td>Fine Science tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>Right angle forceps (for hysterectomy)</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

Die Bildung und die Durchblutung der Entwicklung von Nierenblutgefäße (abgesehen von Glomeruli) stark under. Als Gefäßsystem entwickelt über Angiogenese und Vaskulogenese (De-novo-Gefäßbildung), Perfusion Abbildungsverfahren wie Harzabgüsse, In-vivo-Ultraschallbildgebung und Mikrodissektion haben beim Nachweis der intimen Beziehungen zwischen beschränkt (das ist die Abzweigung der großen Gefäße ist) diese beiden Prozesse und Entwicklung von Nierenstrukturen im Embryo. Hier beschreiben wir das Verfahren der in utero intrakardialen Ultraschall-geführte FITC-markiertem Lektin Tomatenmikroinjektionen auf Mausembryonen, die Ontogenese der Nierendurchblutung zu messen. Tomaten-Lektin (TL) wurde während des gesamten Embryos und Nieren geerntet perfundiert. Nephron Vorfahren, Nephronstrukturen, Harnleiter Epithel und Gefäßsystem: für unterschiedliche Nierenstrukturen einschließlich Gewebe wurden zusammen gefärbt. Schon ab E13.5 großkalibrige Gefäße durchblutet jedoch PeripherieSchiffe blieb unperfused. Durch E15.5 und E17.5, kleinen peripheren Gefäße sowie Glomeruli begonnen, durchströmt wird. Dieses experimentelle Verfahren ist für die Untersuchung der Rolle der Vaskulatur und den Blutfluss während der embryonalen Entwicklung.

Gefäßbildung vorausgeht Fluss in Entwicklung von Nieren Ein Großteil der embryonalem Gewebe (einschließlich der Niere) enthält eine dichte Gefäß (beide unperfused und durchströmt), auch in frühen embryonalen Zeitpunkten. Um besseres Maß und Analyse des Blutflusses in der Entwicklung von Nieren wir verwendeten eine Methode der in utero embryonalen intraMikroInjektionen. Mit der Verwendung eines hochauflösenden Ultraschall die embryonalen Herzens bei E11.5 durch E17.5 identifizieren...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

In Utero Intraherz Tomato Lektin-Injektionen auf Maus Embryonen zu Nierendurchblutung Messer

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.7K Aufrufe.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Serie: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Immunologie und Infektion

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

A Novel Surgical Ansatz intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in einem Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Medizin

Murine Fetal Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding the molecular mechanisms underlying both normal cardiovascular function and the pathophysiological basis of human cardiovascular disease. Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development 1-3. In order to study the role of genetic or pharmacologic alterations in the early development of cardiac function, ultrasound imaging of the live fetus has become an important tool for early recognition of abnormalities and longitudinal follow-up. Noninvasive ultrasound imaging is an ideal method for detecting and studying congenital malformations and the impact on cardiac function prior to death 4. It allows early recognition of abnormalities in the living fetus and the progression of disease can be followed in utero with longitudinal studies 5,6. Until recently, imaging of fetal mouse hearts frequently involved invasive methods. The fetus had to be sacrificed to perform magnetic resonance microscopy and electron microscopy or surgically delivered for transillumination microscopy. An application of high-frequency probes with conventional 2-D and pulsed-wave Doppler imaging has been shown to provide measurements of cardiac contraction and heart rates during embryonic development with databases of normal developmental changes now available 6-10. M-mode imaging further provides important functional data, although, the proper imaging planes are often difficult to obtain. High-frequency ultrasound imaging of the fetus has improved 2-D resolution and can provide excellent information on the early development of cardiac structures 11.

Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development. High-frequency ultrasound imaging has improved 2-D resolution and can provide excellent information on early cardiac development and is an ideal method to detect the impact on cardiac structure and function prior to death.

Murine fetale Echokardiographie

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetale kardiovaskuläre Bildgebung mit einem Hochfrequenz-Ultraschall (30 / 45MHZ) Maus

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Intravenöse und Intra-Fruchtwasser In der Gebärmutter Transplantation in den Mausmodell

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Quantitative Micro-CT-Analyse der Aortopathy in einem Mausmodell der β-Aminopropionitrile-induzierte Aortenaneurysma und Dissektion

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...