Name: subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
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T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

1. Gene Targeting Design- <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bestellen Sie eine entsprechende BAC-Klon für den genomischen Region von Interesse. Damit dies isogen zu der Art von ES-Zellen zu modifizieren zB werden RPCI-23 und-24 RPCI BAC-Klone zur Gen-Targeting mit C57BL / 6-ES-Zellen. </li><li> Bewerben konventionellen Gen-Targeting-Kriterien bei der Gestaltung des Targeting-Vektors. Wichtige Parameter sind, ob die Änderung erforderlich ist konstitutiv oder bedingte zu sein, die Definition kritischer Exons (CE) zum Löschen in einem Gen-Knockout-Strategie und den Abstand und die Anordnung der Intron-Kassetten. Hinweis: Jeder von ihnen ist im Detail an anderer Stelle 10 diskutiert. </li><li> Wählen genomischen Regionen jeweils von 5-6 kb flankieren das Ziel Modifikationsstelle. HINWEIS: Die Größe des subklonierten Einsatz ist daher typischerweise 10-12 kb, obwohl die obere Grenze kann so hoch wie 80 kb mit einer niedrigen Kopien Subklonierung Plasmid p15A dergleichen sein, pBR322 usw. und bis zu 200 kb einer BACVektor. </li></ol> 2. Multiplex Recombineering Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Design-Oligos zur Plasmidrückgrat (Subklonierung Plasmid) und den selektierbaren Marker (Insertionskassette). Entwerfen jedes Oligos, daß er 180 bp HA flankierenden genomischen Zielstelle und 20 bp der spezifischen Anfangssequenz des Einschubkassette oder Subklonieren Plasmid (Figur 2) enthält. HINWEIS: Homologiearme sollten keine sich wiederholenden Elemente enthalten, werden Vorhandensein von repetitiven Elementen in falscher Ausrichtung und Subklonierung führen. Repetitive Elemente können mit Web-basierte Tools wie die &#39;&#39; Wiederholen Masker &#39;&#39; erkannt werden. </li><li> Umfassen eine einzigartige Restriktionsenzym (RE) vor Ort auf eine der Vektor Oligos, die Gen-Targeting-Vektor für die ES-Zell-Targeting (Abbildung 2) zu linearisieren. </li><li> Überprüfen Oligo Parameter unter Verwendung eines Oligo Analyzer Programm. Achten Sie darauf, Sekundärstrukturen in der Primerregion zu vermeidens. </li><li> Kürzere HA (50 bp) der Einschubkassette wird toleriert und führt zu geringeren Anzahl von Rekombinanten jedoch sicherzustellen, dass die Subklonierung Plasmid HA immer mehr (180 bp). </li><li> Bestimmen Sie die Ausrichtung der genomischen DNA-Inserts des jeweiligen BAC-Klon mit Web-basierte Tools wie &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Stellen Sie die Richtung der Replikation von Oris, indem Sie die Karte von der BAC Plasmidrückgrat im BAC-Bibliothek Konstruktion. HINWEIS: Oris ist in der Regel gegenüber dem Transkriptionsrichtung des Chloramphenicol (Chl) Marker für alle gängigen BAC-Plasmide. </li><li> Hinzufügen zwei terminalen Phosphorothioat (PTO) Bindungen an das 5&#39;-Ende des Oligos, die entgegengesetzt zu der Richtung der Replikation auf dem BAC-Klon ist. Hinzufügen eines 5&#39;-Phosphat Modifikation der Rückwärts Oligo (Abbildung 2). HINWEIS: Die asymmetrische phosphorthioiertes PCR-Kassette auf Red Verdauung erzeugt ss-DNA-Zwischenprodukt, das die Hauptverzögerungsstrang kannder Replikationsgabel. HINWEIS: Maximal Multiplex Rekombinationsfrequenz mit den Folgestrangs geschützt Kassetten beobachtet. Führende Strang geschützt oder Dual geschützt Kassetten können gleichwertige Rekombination Effizienz irgend loci nicht zu produzieren. </li><li> Bestellen Oligos mit PAGE oder HPLC-Reinigung. </li></ol> 3. BAC Klon Transformation mit pSC101 BADgbaA Recombineering Plasmid. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Um die E. machen coli-Stamm mit dem BAC Rekombination beherrschen, verwandeln es mit der pSC101 BADgbaA Plasmid, das die Red Gene 16. HINWEIS: Die pSC101 BADgbaA Plasmid enthält die Rot-RecA-Gene unter der Kontrolle des Arabinose-induzierbaren araC-P BAD-Promotor, ein Tetracyclin-Selektionsmarker und dem temperaturempfindlichen pSC101-Replikon. <ol><li> Erstechen eine sterile Pipettenspitze in der BAC-Agar-Kultur und impfen 5,0 ml LB-Medium (LB), pH 8,0, 12,556; g ml -1 Chl. Wachsen bei 37 ° C für 5 Stunden unter Schütteln bei 200 rpm. </li><li> Kühlen Sie 10% (v / v) Glycerin-Lösung, Mikrozentrifugenröhrchen und Elektroporationsküvetten auf Eis. Kühlen eines gekühlten große Zentrifuge und Mikro bis 4 ° C. </li><li> Bestimmen Sie die optische Dichte (OD) der Kultur mit einem Spektralphotometer und Messung der Extinktion bei 600 nm. Bereiten elektro Zellen (wie unten beschrieben), wenn ein OD 600 Lesung von 0,3 bis 0,8 erreicht wird. </li><li> Spin down Zellen in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen in einer großen Zentrifuge bei 1.216 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Wash-Zellen mit 1 ml gekühltem 10% Glycerin und Spin-down-Zellen bei 17.949 × g für 20 sec bei 4 ° C. Führen Sie den Waschschritt insgesamt 3 mal. </li><li> Resuspendieren der Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 ul 10% Glycerin und fügen 10-200 ng der Plasmid pSC101 BADgbaA Rekombinationstechnologie. Besorgen Sie sich eine Einzelzellsuspension durch Pipettierennach oben und unten mehrere Male und dann übertragen Sie die Zellen in ein vorgekühltes 1 mm Lücke Elektroporationsküvette. </li><li> Elektroporation der Zellen mit einem Wert von 1,8 kV, 25 &amp; mgr; F und 200 Ω. HINWEIS: Überprüfen Sie die richtigen Einstellungen für jede Marke von Elektroporator. Eine Zeitkonstante der Elektroporation unter 4 zeigt die Anwesenheit von Salz und anderen Verunreinigungen. </li><li> Der Zellen sofort erholen in 1 ml LB und Übertragen der Zellen in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wachsen die BAC GBAA Kultur bei 30 ° C für 2 Stunden unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die pSC101 BADgbaA Plasmid verloren, wenn die Zellen bei 37 ° C aufgrund der Inaktivierung des temperaturempfindlichen RepE Replikationsfaktor gezüchtet. Wachsen GBAA Zellen bei 30 ° C, um die Rekombination Funktionen aufrecht zu erhalten. </li><li> In 9 ml LB, die 12,5 &amp; mgr; g ml -1 Chl und 4 ug ml -1 Tetracyclin (Tet) auf den wiederhergestellten BAC GBAA Kultur. Wachsen dieBAC GBAA Kultur O / N bei 30 &#160; ° C unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die Transformationseffizienz von Elektroporation der supercoiled Plasmid GBAA ausreichend hoch ist, um eine Sättigung Wachstums O / N in flüssigen Medien zu ermöglichen. </li></ol></li></ol> 4. Vorbereitung der Insertion Kassetten und Subklonierung Plasmide <ol style="margin-left: 40px;"><li> HA in die Einschubkassette (n) und die Subklonierung Plasmid einzubauen, führen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der langen modifizierten Oligos, wie unten beschrieben. <ol><li> Optional: Plasmid Verschleppung in die Rekombination Reaktion zu vermeiden, verwenden Sie ein R6K Herkunft oder ähnlich engen Wirtsbereich Plasmidmatrize die Insertionskassette verstärken. </li><li> Alternativ Arisierung der Plasmid-Vorlage mit einem RE-Digest (Tabelle 2). Wählen Sie ein RE, die außerhalb der PCR-Amplifikation Region schneidet und hitzeinaktiviertem. Hitze inaktiviert die RE wie vom Hersteller, Produzent empfohlenacturer. </li><li> Einrichten der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines High-Fidelity DNA Polymerase hotstart Systems. Bereiten Sie ein PCR-Mastermix so detailliert (Tabelle 3). Führen Temperaturwechsel, wie dargestellt (Tabelle 3). </li></ol></li><li> Analyse der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Last 1-5 ul jeder PCR auf ein 1% (w / v) Agarosegel, das 0,5 mg ml -1 Ethidiumbromid (EtBr). HINWEIS: Die Anwesenheit von nicht-spezifischen Amplifikationsprodukte nicht in der Rekombinationstechnologie Reaktion stören. In einigen Fällen jedoch können Primer-Dimere Rekombinationstechnologie Effizienz verringern. </li><li> Reinige PCR-Produkte unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kits. <ol><li> Optional: Entfernen Sie die Plasmidmatrize von PCRs durch Behandlung mit DpnI gefolgt von PCR-clean-up. Eluieren der DNA in einem minimalen Volumen von sterilem, deionisiertem Wasser (wie vom Hersteller empfohlen). HINWEIS: Die Zugabe von DpnI zu PCR-Reaktionen führt zu einer verringerten Effizienz der Spaltung von th ungereinigteme methylierte Plasmid-DNA-Vorlage. </li></ol></li><li> Quantifizierung PCR amplifizierte DNA durch Agarose-Gel-Analyse gegen einen bekannten Satz von DNA-Standards zB λ HindIII Verdau oder durch Verwendung eines ND-Spektrophotometer. </li></ol> 5. Subklonierung Plus-Insertion <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verdünnen Sie die O / N BAC GBAA Kultur 50-fach durch Zugabe von 200 ul in 10 ml LB + Chl + Tet. Wachsen bei 30 &#160; ° C unter Schütteln bei 200 Upm für 1 h 50 min. Gehören Probe als negative Kontrolle verwendet werden. </li><li> Kühlen aller Rekombinationstechnologie Materialien und Ausrüstung auf 4 ° C, wie in Schritt 3.1.2 beschrieben. </li><li> Gießen LB Agar pH 8 Platten, die das korrekte Konzentration des geeigneten selektiven Antibiotikums (en), die die Auswahl des DNA-Fragments, das für die Auswahl der Subklonierungsvektor (Tabelle 4) sowie eingeführt wird ermöglicht. HINWEIS: Einige Antibiotika sind pH-empfindlich. Verwenden LBAgar pH 8 in der Regel. </li><li> Eine 10% ige (w / v) Lösung von L-Arabinose. Filtersterilisieren durch einen 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter. HINWEIS: Arabinose induziert die Expression der Proteine ​​von der Rekombination GBAA Plasmid. </li><li> Überprüfen Sie die OD der BAC GBAA Kultur mit einem Spektralphotometer. Sobald eine OD600 von 0,25-0,3 erreicht ist, induzieren die Rekombination Proteinen wie im folgenden Schritt beschrieben. </li><li> Gib 200 ul der 10% Arabinose Lösung auf 10 ml der BAC Kultur bis zu einer Endkonzentration von Arabinose von 0,2% zu erreichen. Gehören nicht-induzierten Kultur (ohne Arabinose), die als negative Kontrolle verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie die BAK-Kultur zu einem 37 &#160; ° C Schüttelinkubator und induzieren Red Ausdruck für 45 min Schütteln bei 230 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die Expression von Red Proteine ​​ineffizient bei 30 ° C. </li><li> Spin down Zellen und wäscht mit 10% Glycerin 3-mal, wie in Schritt 3.1.5 beschrieben. </li><li> Fügen 600-1,000 ng von jedem der Subklonierung Plasmid und die Insertion Kassette (n) zu der Rekombinationstechnologie Reaktion. Fügen Sie einen Vektor nur und Vektor plus Einzeleinsatz steuert, um die Rekombination Kompetenz und Integrität des Vektors und den Kassetten zu überprüfen. </li><li> Besorgen Sie sich eine Einzelzellsuspension durch Auf- und Abpipettieren. Führen Elektroporation in Schritt 3.1.7 und anschließende Erholung in 1 ml LB bei 37 ° C für 1 Stunde für Multi-copy Plasmiden oder in 10 ml LB 3 h für BAC-Vektoren beschrieben, bei 37 ° C. </li><li> Platte verschiedene Verdünnungen der Kultur gewonnen zB 90%, 10%, 1% auf die duale Selektions Agarplatten wachsen bei 37 &#160; ° C für 16 Stunden. </li></ol> 6. Analyse von Rekombinanten <ol style="margin-left: 40px;"><li> Optional: Wählen Sie 6 bis 12 Kolonien und durchzuführen, Kolonie-PCR mit einem HA flankierenden Primer und einen Einsatz spezifischer Primer. Fügen Sie die Subklonierung Plasmid und das Einsetzen cassette Plasmid sowie die Mutter BAC-Klon als negative Kontrollen. <ol><li> Führen Agarosegel-Analyse der Kolonie PCRs. Identifizieren positiver Klone durch die Anwesenheit von einem hellen Band an der erwarteten Größe. HINWEIS: Der hohe Wirkungsgrad des SPI Klonens erzeugt meist richtig Rekombinanten. </li></ol></li><li> Wählen Kolonien in 5 ml LB pH 8, der die selektive Antibiotikum und wachsen O / N bei 37 ° C. </li><li> Bereiten DNA-Minipreps Verwendung einer Säule Reinigungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bereiten BAC Miniprep DNA unter Verwendung von Standard Phenol-Chloroform-Isolation oder ein ähnliches Protokoll. </li><li> Führen RE verdaut, auf dem Miniprep-DNA. Separate DNA durch Agarose-Gelelektrophorese. Analysieren RE Mustern, um die Klone, die die erwarteten Fragmente Größen der richtigen Zielvektor zu identifizieren. Wähle eine RE, die eindeutig diskriminiert zwischen dem Vektor fehlt Einlage (n) und dem Vektor, der die Einlage (n). </li><li> Optional: Zellen, die frei von der BAC, die immer noch in der E. vorhanden sind erhalten coli nach Rekombination, verwenden Sie die Miniprep-Plasmid-DNA, um DH5alpha oder DH10B E. verwandeln coli-Zellen. </li><li> Führen Sie die DNA-Sequenzierung über den HA und Insertionskassette zu Oligosynthese Fehler zu überprüfen. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue.">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li><li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells.">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).</li><li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+use+of+YACs,+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals.">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li><li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+trimming:+minimizing+clone+overlaps.">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li></ol>

T.R.R is the inventor of a British patent application on multiplex recombineering technology.

Der Bau der ES-Zelllinien und Maus-Modellen ist historisch beteiligten Gene Targeting unter Verwendung von Plasmid-Konstrukte, die die modifizierte Allel 4 enthalten. Jedoch ist die Konstruktion dieser Komplex das Gen-Targeting-Vektoren hat sich als eine erhebliche Engpass bei der rechtzeitigen Herstellung derartiger Modelle. Die Entwicklung der Rekombination auf der Basis der Konstruktion des Vektors Strategien hat verbesserte Vektor-Design und effizienter Vektor Montage erlaubt. Dennoch aktuellen Rekombination Protokolle beinhalten noch mehrere Schritte erfordern Zwischen Plasmidreinigung und verschiedene Bakterienstämme. Subklonierung und Einfügen bietet einen neuartigen Ansatz zur Konstruktion des Vektors, die in einem Elektroporation Ereignis in der Wohn BAC Wirtsstamm durchgeführt werden können. Die Nützlichkeit der SPI in Gen-Targeting wurde hier eine Vielzahl von Vektor-Konstruktionsanwendungen getestet. In allen hier betrachteten Fällen erwiesen SPI effizient zu sein und die richtige rekombinante Plasmid wurde hergestellt.In der Mehrzahl der Fälle wurden die mehrere unterschiedliche Kassetten richtig im Targeting-Vektor inseriert. Große DNA-Kassetten und Vektoren wurden leicht in dem SPI-Protokoll aufgenommen und zeigte die Flexibilität dieses Systems. SPI beruht auf der Verwendung langer Homologiesequenzen und Phosphorothioat (PTO) Schutz der linearen DNA-Kassetten. PTO Modifikation verleiht Schutz gegen Exonukleasen zu der linearen DNA 20,21 und die lange HA erhöht Rekombinationseffizienz zu Multiplexing ermöglichen. Synthese von längeren Oligo-Sequenzen erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit des Ansammelns Fehler insbesondere Deletionen. Mutationen im Oligo kann besonders nachteilig sein, wenn sie zu decken Protein kodierenden Regionen. DNA-Sequenzierung über den HA und die das gesamte Länge des eingelegten Kassette ist empfehlenswert, um Klone mit allen Sequenzänderungen zu eliminieren. Verwendung eines High-Fidelity-DNA-Polymerase-System wird auch vorgeschlagen, um die Einführung eines zu vermeideny PCR-Fehler. Die Länge und Zusammensetzung der HA des Subklonierung Plasmid kritischer ist relativ zu der Einschubkassette (Daten nicht gezeigt). Für besonders empfindliche Anwendungen wie Bau von Knockin-Vektoren, in denen alle Mutationen in Exon Regionen werden nicht toleriert, kann der HA des Insertionskassette gekürzt werden (50 bis 120 bp) Probleme mit langen Oligos assoziiert zu vermeiden. Insertionskassette können unmodifiziert oder dual phosphorthioiertes (wenn die anhand der Richtung der Replikation nicht verfügbar ist) gelassen werden. Aber Multiplexen in diesen Fällen immer noch erfordert lange geschützt HA Subklonierung Plasmide. Eine Einschränkung dieser besonderen Strategie ist die Senkung der Multiplexing Effizienz, die möglicherweise Auswirkungen kann SPI Klonen an verschiedenen Loci. Die Länge der Insertionskassette und dem Subklonieren Plasmid ist ein weiterer wichtiger Parameter bei der SPI Klonen. Größere DNA-Moleküle zu elektroporieren weniger wirksam, und die Wirkung ist kumulativ, da die Wiederquirement alle Kassetten in der gleichen Zelle einzuführen (Daten nicht gezeigt). Multiplexing ist am effizientesten mit kleineren Einschubkassetten. DNA-Fragmente größer als 3 kb stellen auch eine Grenze für Red vermittelte ssDNA Verarbeitung, die effizienteste bis zu 3 kb 30 ist. Eingefügt Kassetten mehr als 3 kb sind Dual reseziert und weniger effizient rekombinieren über eine Beta-unabhängigen Weg 20. Daher wird Screening von Kolonien ausreichen, um die korrekte Klon identifiziert in diesen Fällen wichtig. Eine längere Dauer der Rekombination nach der Elektroporation erhöht auch die Chancen für eine Erholung der richtige Klon in schwierigen SPI Übungen. Bis zu vier kleine Kassetten (&lt;1,5 kb) können gleichzeitig mit dem SPI-Prozess eingeführt werden, wenn die Multiplexeffizienz mit jedem zusätzlichen Kassette verringert (Daten nicht gezeigt). Jedoch spiegelt dies das Ergebnis einer optimalen SPI Experiment und sinnvoll, die Grenzwerte des Multiplexens beachten, wenn viele große Kassetten ist. </p&gt; Die Entwicklung von Genom-Editing-Tools wie Cluster regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -cas9 Endonuklease-System hat die Schaffung neuer Genom-Modifikationen aktiviert werden und hat zu einer effizienteren Genomtechnik 36 geführt. Jedoch haben diese neueren Technologien Gen-Targeting-Vektoren ergänzt, anstatt sie verdrängt. Es ist vorgesehen, dass die CRISPR-cas System könnte Antibiotika-Selektion zu ersetzen und zu verfeinern die Multiplex-Rekombination Protokoll.

Die Entwicklung von Gen-Targeting-Technologien, hat den Bau von Zelllinien und Maus-Modellen ermöglicht, verschiedene biologische Systeme 1-3 zu untersuchen. Ein Schlüssel der ersten Stufe in der Modifikation einer genomischen Sequenz ist die Gestaltung und Konstruktion eines Gen-Targeting-Vektor 4. Targeting-Vektoren sind Plasmidkonstrukte, die das Allel von Interesse, die die gewünschten Modifikationen (n) durch einen Selektionsmarker (beispielsweise Neomycin) flankiert tragen und langen genomischen Regionen für effiziente homologe Rekombination in Säugerzellen 5 erforderlich. Präzise Genveränderung durch Einbringen des Targeting-Vektors in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) 6 oder somatischen Zellen 7, dadurch gelöst, dass eine homologe Rekombination zwischen identischen Abschnitte der DNA-Sequenz auf dem Zielvektor und den genomischen Locus resultiert in der Übertragung von der beabsichtigten Modifikation um das Genom durch Genkonversion 8. Solche modified ES-Zellen können in der Maus Blastozysten injiziert werden, um Nachkommen (Chimären) herstellen, die dann übertragen können diese modifizierten Allele über die Keimbahn 9. Ein alternativer Weg, um transgene Mäuse zu erzeugen beinhaltet die Mikroinjektion eines Genexpressionsvektor in einzelligen Maus Zygoten, die der zufälligen Integration des Vektors in das Genom der Maus 10 führt. Traditionelle Methoden der Vektorkonstruktion wurden auf herkömmliche verlassen &#39;cut and paste&#39; Klonen Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA-Ligasen, um die verschiedenen Selektionsmarker und genomische Fragmente in einen Vektor-Rückgrat zu klonen. Jedoch ist eine inhärente Begrenzungsfaktor herkömmlicher Klonen die Positionierung und die Wahl der Restriktionsstellen, vor allem bei längeren DNA-Sequenzen. Dies erfordert häufig mehrere Subklonierungsschritte und führt auch fremde DNA-Sequenzen in den Vektor, die oft zu einer geringeren Effizienz des Gen-Targeting. Recombineering (rekombinogenen gerineering) ist ein DNA-Engineering-Technologie, die diese Einschränkungen überwunden durch die Verwendung der homologen Rekombination (HR) durch Phagen Rekombination Proteine ​​in E. vermittelte coli-Zellen 11,12. Da jede Region eine homologe Sequenz kann als Substrat Rekombination dienen, werden die Beschränkungen der Verfügbarkeit von Restriktionsstellen entfernt wurde. Große DNA-Sequenzen können nahtlos direkt in vivo modifiziert werden, so auch ihre strukturelle Integrität bewahren 13. Recombineering ist sehr effizient mit kurzen Homologien (50 bp) 14 und damit Homologiearme (HA) können bequem in synthetische Oligo-Sequenzen integriert werden. In einem typischen Experiment Rekombinationstechnologie, einem Oligo oder einem Doppelstrang-DNA (dsDNA) Fragment, HA in Rekombinationstechnologie kompetente E. elektroporiert coli-Zellen, welche die Ziel entweder auf dem Chromosom oder auf einem Plasmid 15 angeordnet. Die Rekombination Potential wird durch induzierbare Expression des Red rec tragenenombination Proteine ​​der Phagen 16,17 bzw. die RecET Proteine ​​der rac Prophagen 18. Die Rot / RecE Exonuklease wandelt lineare dsDNA zu einer Einzelstrang-DNA (ssDNA) Zwischen, die dann von ihrem Partner, Rot / RecT, eine einzelsträngige Glühen Protein (SSAP) 19 gebunden. Das Tempern eines langen ssDNA oder eine kurze Oligo an seinen komplementären Zielsequenz auf der Folgestrang der Replikationsgabel und führt zum Einbau der Sequenz an der Targetstelle. Verzögerungsstrang ssDNA Rekombination ist die Grundlage für die hohe Effizienz der Rekombination und können durch die &quot;Beta&quot; Rekombinationsmodell 20,21 beschrieben. Ein typischer Workflow Rekombination zum Aufbau einer Gen-Targeting-Vektor umfasst eine der beiden folgenden Strecken. Ein Weg beinhaltet Subklonieren der gewünschten genomischen Region von einem Maus-BAC-Klons in ein Plasmid, gefolgt von dem sequentiellen Einführen LoxP Rekombinationsstelle, einen Selektionsmarker <sbis&gt; 22 etc. oder die alternative Route beinhaltet gezielt den BAC genomischen Locus mit den verschiedenen Zielvektorelemente durch mehrere Runden von Rekombination 10,23 und Subklonierung des modifizierten Locus in ein Plasmid durch Lücke Reparatur Klonen 24,25. Variationen zu diesem Thema wurden in verschiedenen High-Throughput-Rekombination Rohrleitungen im Rahmen der großen Maus Produktionsprogramme 26,27 verwendet. Diese Verfahren umfassen jedoch komplizierte und langwierige Stufen erfordern die Verwendung von speziellen Vektoren und E. coli-Stämmen (zB Cre-exprimierenden Zellen) und nutzen die eine oder mehrere Zwischenschritte der Vektor DNA Aufreinigung und Rücktransformation (Tabelle 1). Subklonierung und Einfügen (SPI) ist eine neue Technik, die Beta-Rekombination Rekombination und Reparatur Lücke Klonierung in einem einzigen Prozess (Abbildung 1) verbindet. SPI Vektor Montage ist einfach, schnell und flexibel und bietet deutliche Verbesserung gegenüber Standard recombiEngineering nähert (Tabelle 1). Hier zeigen wir, wie einfach und Nutzen des Einsatzes von SPI für verschiedene Vektorkonstruktion Anwendungen mit besonderem Schwerpunkt auf den Aufbau Nicht-Standard-und herausfordernde Vektor-Designs. Testfälle enthalten den Bau eines fluoreszierenden Reporter Knockin Vektor, eine doppelte Fotos mit Namensproteinexpression Knockin Vektor, ein BAC fluoreszierenden Reportervektor und eine Knockout-Vektor. Verschiedentlich die Forderung, einen Zelloberflächenrezeptor zu lokalisieren, zu reinigen, eine Kernproteinkomplex Diese untersucht oder bedingt abzutragen die Expression eines Gens.

<table><tbody><tr><td>Antibiotics except Zeocin</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>Ampicillin, A9518-5G;&lt;br/&gt; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G;&lt;br/&gt; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen:&amp;nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin is also available from Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 BAC clones</td><td>CHORI: https://bacpac.chori.org/&amp;nbsp;</td><td>RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries</td><td>129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>KOD hotstart DNA polymerase system</td><td>Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Long oligos</td><td>IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com</td><td>IDT Ultramers or Gene Link long oligos</td><td>PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.</td></tr><tr><td>MinElute PCR purification kit</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&amp;nbsp;</td><td>28004</td><td>Minimum elution PCR purifications kits are preferred.</td></tr><tr><td>QIAPrep Spin Mini Prep kit</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&amp;nbsp;</td><td>27104</td><td>Silica column or similar matrix kits are preferred.</td></tr><tr><td>Restriction enzymes</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>See NEB website for a list of RE.</td></tr></tbody></table>

subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

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Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

16.5K Aufrufe.  University of Leicester. Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Serie: Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Forschung

Genetik

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

Ein Protokoll für mehrfache Gen-Knockout in Maus-Dünndarm-Organoiden mit einem CRISPR-Concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Biotechnik

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

Entwicklungsbiologie

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Schnelle Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit modularem Golden Gate Klonen

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Biologie

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Immunologie und Infektion

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Herstellung von Rohvektoren und effiziente DNA-Verabreichung in Zellkulturen

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue types, making them a popular choice for gene delivery in animal models and in clinical settings. In addition to therapeutic applications, rAAVs are a useful laboratory tool for delivering transgenes tailored to the researcher&#39;s experimental needs and scientific goals in cultured cells. Some examples include exogenous reporter genes, overexpression cassettes, RNA interference, and CRISPR-based tools, including those for genome-wide screens. rAAV transductions are less harmful to cells than electroporation or chemical transfection and do not require any special equipment or expensive reagents to produce. Crude lysates or conditioned media containing rAAVs can be added directly to cultured cells without further purification to transduce many cell types&#8212;an underappreciated feature of rAAVs. Here, we provide protocols for basic transgene cassette cloning and demonstrate how to produce and apply crude rAAV preparations to cultured cells. As proof of principle, we demonstrate the transduction of three cell types that have not yet been reported in rAAV applications: placental cells, myoblasts, and small intestinal organoids. We discuss appropriate uses for crude rAAV preparations, the limitations of rAAVs for gene delivery, and considerations for capsid choice. This protocol outlines a simple, low-cost, and effective method for researchers to achieve productive DNA delivery in cell culture using rAAV without the need for laborious titration and purification steps.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung des Potenzials von ungereinigten rekombinanten AAVs in der Zellkulturforschung 

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is widely used for clinical and preclinical gene delivery. An underappreciated use for rAAVs is the robust transduction of cultured cells without the need for purification. For researchers new to rAAV, we provide a protocol for transgene cassette cloning, crude vector production, and cell culture transduction.

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

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