Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) Forest Rohwer ausgezeichnet unterstützt. Wir danken Epicentre, ein Illumina Unternehmen für die Bereitstellung frühzeitigen Zugang zu Ribo-Zero Epidemiologie Kits. Wir danken Mark Hatay für das Design und die Herstellung der Ultrazentrifuge Rohrhalter. Wir danken Andreas Haas und Benjamin Knowles für kritische Lesungen und Diskussionen des Manuskripts und Paul Lauren zur Unterstützung der Dreharbeiten.

The authors have nothing to disclose.

Viral Metagenomics Viruspartikel konzentriert werden unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) Fällung oder kleinvolumigen Konzentratoren. In einigen Fällen kann die Konzentration nicht benötigt werden, aber pre-Filtration oder langsame Zentrifugation Schritte werden verwendet, um eukaryontische mikrobielle Zellen zu entfernen. Viral Lysate weiter angereichert und mit Dichtegradientenzentrifugation 9,41 oder kleiner Größe Filter (zB 0,45 um) zu eukaryotischen und großen mikrobiellen Zellen 25 zu entfernen. Gereinigt werden Dichtegradientenzentrifugation wird typischerweise mit dichten aber inerten Lösungen, wie Saccharose oder Cäsiumchlorid zur Isolierung und Konzentration viraler Partikel 41 durchgeführt. Physikalische Trennung wird von der Größe und Auftriebsdichte von viralen Partikel. Daher richtige Wahl der Filterfeinheit und der strengen Vorbereitung der Gradienten sind unerlässlich, um spezifische virale Isolation der Gemeinden, wie der Erfolg der physischen WiederherstellungVLPs bestimmt die Gemeinschaft isoliert 41 (dh Viruspartikel, die nicht durch den Filter oder fallen in den Entnahmedichte bestehen, werden nicht in der Metagenom erkannt werden). Nach virale Isolation und Konzentration kann es sein kontaminierenden in der Probe sowohl in Form von freien Nukleinsäuren und mikrobielle und eukaryotischen Zellen nicht-viralen vorliegenden genomischen Materials. Daher ist es wichtig, die Reinheit des Viruspartikeln in Proben (1A und 1B) zu verifizieren. Eine Chloroform-Behandlung wird üblicherweise verwendet, um die verbleibenden Zellen, gefolgt von Nukleasebehandlung um freie Nucleinsäuren vor der Extraktion von Nukleinsäuren abbauen lysieren. Eine Einschränkung auf die dargestellte Arbeitsablauf war der Einsatz von Dichtegradiententrennung, um virale Partikel zu isolieren, wie es umhüllten Viruspartikeln, die zu Auftriebs die CsCl Gradienten betreten können, auszuschließen. Eine Alternative &quot;Catch-all&quot; Verfahren ist es, den Dichtegradienten getr weglassenation und zu isolieren, die Community-DNA aus den 0,45 um - Filtrate mit Chloroform und DNase I. Dieser Ansatz behandelt wird, ist es angezeigt, einen kleinen Probenvolumina, wie sie aus Abstrichen oder Blutplasma unterzubringen. Jedoch kann dies in Chloroform-resistenten bakteriellen Kontamination und höhere Menge an DNase I beständigen extrazelluläre DNA führen. Aktuelle Sequenzierungsprotokolle erfordern 1 ng bis 1 ug von Nukleinsäuren zur Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung wodurch höhere DNA-Ausbeuten eine größere Auswahl an Optionen Sequenzierung. Die DNA-Konzentration der erzeugten viromes oft im Bereich von unterhalb der Nachweisgrenze von mehr als 200 ng / &amp; mgr; l. Die Höhe der viralen Nukleinsäuren erholt reicht möglicherweise nicht zur direkten Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung sein. In solchen Fällen ist die Nukleinsäure-Amplifikation von wesentlicher Bedeutung. Linker Verstärkung Schrotflinte-Bibliotheken (LASLs) 2,42,43 und Amplifikation des gesamten Genoms auf der Basis mehrerer Displacement Amplification (MDA) sind die beidenVerfahren am häufigsten verwendet werden, um ausreichende DNA für die Sequenzierung zu erzeugen. MDA Verfahren, wie sie anhand von Phi29 DNA-Polymerase ist bekannt, dass aus der Amplifikation spannt leiden und können bevorzugt amplifizieren ssDNA und kreisförmige DNA, was zu einer nicht quantitativen taxonomischen und funktionelle Charakterisierung 44,45. Eine optimierte Version des LASLs Ansatz hat sich gezeigt, dass nur minimale Verzerrungen einführen, fördert die höhere Empfindlichkeit (für kleine Mengen an Ausgangsmaterial), und ist leicht für verschiedene Sequenzierplattformen 43 angepasst. Jedoch weist der Ansatz viele Schritte, erfordert spezielle Ausrüstung, um DNA Verlust zu minimieren, und ist auf dsDNA Vorlagen. In unserem Labor wurde dieser Ansatz erfolgreich eingerichtet ist, nachweisbar und nicht nachweisbaren Menge von bronchoalveolären lavage-, Korallen-und seewasser abgeleitete VLPs (unveröffentlicht und Hurwitz et al. 46) extrahierte DNA zu amplifizieren. Entwicklung von Datenanalyse-Pipelines hat classically einer der schwierigsten Aspekte der Virus Metagenom-Analyse aufgrund der sehr unterschiedlichen und weitgehend unbekannten Natur der viralen Gemeinden. Zwar gibt es schätzungsweise 10 8 viralen Genotypen in der Biosphäre bis heute aktuellen Virendatenbanken enthalten ~ 4.000 viralen Genomen, die etwa 1 / 100.000 dieser ungefähren Gesamt virale Vielfalt ist. Daher Ähnlichkeit basierte Suchen (wie BLAST 47) für taxonomische und funktionelle Zuordnung der Virus Metagenomen besitzen inhärente Herausforderungen. Viele Sequenzen nicht zu signifikanten Ähnlichkeiten mit Genomen in der Datenbank haben, und deshalb werden als unbekannt eingestuft. Obwohl Homologie-basierte Suchanfragen sind die wichtigsten Anwendungen für die Zuordnung von Taxonomie und funktionieren, um Daten zu sequenzieren, wurden alternative Ansätze, die auf datenbankunabhängige Analyse entwickelt 48- 50. Fancello et al. 51 eine vollständige Überprüfung des Rechentools und Algorithmen in Vira verwendetl Metagenomik. Mikrobielle Metagenomics Typischerweise liegt die Gesamtmenge an DNA aus hypotonische Lyse behandelt Mikroorganismengemeinschaften (HL-DNA) extrahiert im Bereich von 20 ng bis 5 ug. Die Ausbeute ist stark abhängig von den Gesundheitszustand und die Menge der Sputumprobe gesammelt, welche die Variationen in der Gesamtausbeute in dieser Studie (Tabelle 2) extrahiert HL-DNA gesehen erklärt des Patienten. Die entscheidenden Schritte zur Erzeugung guter Qualität Sequenzdaten verlassen sich auf die Qualität der Sequenzierungsbibliotheken generiert. Abbildung 2 zeigt eine typische Größenbereich für die Sequenzierungsbibliotheken von CF Sputum abgeleitete mikrobielle DNA, die unter Verwendung eines enzymatischen-basierte DNA-Fragmentierung Verfahren. Die optimale Größe der Bibliothek ist abhängig von der Wahl des Sequenzierungsplattform und der Anwendung, und daher kann das Fragmentierungsverfahren optimiert werden, falls erforderlich, durch alternative Methoden wie Ultraschallbehandlung und Vernebelung. Zusätzlich zudie dargestellten repräsentativen Ergebnissen, der Erfolg des vorgestellten Verfahrens auf CF Sputum von mehreren Patienten über mehrere Zeitpunkte erfasst werden auch in Lim et al (2012). 9 dargestellt, und Lim et al. (2014) 10. Frühere Studien deuten darauf hin, 9,10, dass jeder Patient birgt eine einzigartige Reihe von mikrobiellen Gemeinschaft, die im Laufe der Zeit verschiebt, wodurch das Fortbestehen der Hauptakteure in der Gemeinschaft widerspiegelt, während Schwankungen dürften wegen Störungen wie Antibiotika. Ob diese Schwankungen auftreten, täglich auch ohne äußere Störungen oder aufgrund von Stichprobenverfahren und Probenverarbeitung, ist immer noch in Frage. Basierend auf der HL-DNA metagenomic und 16S rDNA Amplikon Analyse zeigt die 7-Tage-Längs Abtastung, dass die tägliche Schwankung des mikrobiellen Profile ohne Antibiotikum Perturbation (Tag 1, 2 und 3) war minimal (3A und 3B). Nach IntroHerstellung von oralen Antibiotika unmittelbar nach dem 3. Tag Probenahme wurde Änderungen in der Community-Profil offensichtlich an Tag 4. Während das Antibiotikum Ciprofloxacin zielt auf ein breites Spektrum an bekannten bakteriellen Erreger wie P. aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptococcus pneumoniae, erhöhte die Behandlung der relativen Häufigkeit von P. aeruginosa während die Verringerung der Streptococcus spp. und P. melaninogenica. Mit dem 6. Tag, die Gemeinschaft wieder langsam in die Anfangsstartgemeinschaftsstruktur. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Schwankungen der mikrobiellen Profile innerhalb eines einzelnen Patienten mit größerer Wahrscheinlichkeit aufgrund Community Störungen in den Atemwegen. Angesichts der Kohärenz zwischen den mikrobiellen Profile der 16S rDNA Bibliotheken und Metagenomen von HL-abgeleitete DNA, auszuschließen wir die Vorurteile von den in dieser Studie verwendeten 16S-rRNA-Primer Ursprung. Eine mögliche Erklärung für die Unterschiede zwischen den 16S rDNA taxonomische gesehenal Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA (3B) erzeugt wird, kann die Anwesenheit von hohen Mengen von Pseudomonas spp. extrazelluläre DNA nach der Behandlung mit Antibiotika. Dies wird durch die Ergebnisse gestützt, dass diese Unterschiede wurden am Tag 7 am deutlichsten, drei Tage nach der Behandlung mit Antibiotika, die Pseudomonas spp abzielt. neben anderen. Ciprofloxacin ist allgemein als First-Line-Behandlung bei Patienten mit CF und chronischer P. verwendet aeruginosa-Infektion, obwohl seine Wirkungsspektrum umfasst die meisten CF-assoziierter Krankheitserreger. Wir nahmen an, dass die Behandlung mit Antibiotika rottet anfälliger Gemeinschaften einschließlich Streptococcus spp. und damit die Schaffung einer Nische durch resistente P. gefüllt aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kann Widerstand durch Erhöhung der Biofilmgemeinschaften zu gewinnen und die extrazelluläre DNA wurde gezeigt, daß die wichtigsten strukturellen Unterstützung seiner Biofilmarchitektur 52 sein. Schon als ter Gemeinschaftsstruktur wiederhergestellt, extrazelluläre DNA kann auf der CF-Sputum geblieben. Deshalb lassen diese Daten vermuten, dass hypotonische Lyse und die Waschschritte in diesem Arbeitsablauf dargestellt potentiell nicht nur das Entfernen des vom Menschen stammenden DNA zu profitieren, sondern auch auf Basis mikrobieller extrazellulären DNA, die die tatsächliche mikrobielle Profile verdrehen kann. Metatranscriptomics Eine hochwertige metatranscriptome sollte relativ wenige ribosomale RNA (rRNA) Sequenzen enthalten und stellen eine unvoreingenommene Probenahme der Gemeinschaft Transkripte (mRNA). Aufgrund der kurzen Halbwertszeit und begrenzte Menge an mRNA, ist es entscheidend, dass das Protokoll, wie es hier dargestellt, minimiert Probenhandhabung, die Anzahl von Transkripten gewonnen maximieren. In den letzten Jahren verschiedene Ansätze für rRNA Depletion wurden entwickelt und im Handel erhältlichen Kits geeignet. Dazu gehören Microb Enrich, Ribo-Zero und probenspezifische subtraktiven hybridizations 53, die auf Oligonukleotid-Hybridisierung und der mRNA-ONLY-Kit, das auf Exonuklease enzymatische Aktivität Ziel RNA eine 5&#39;-Monophosphat enthält, basiert beruhen. Außerdem sind auch verschiedene Ansätze zur mRNA Anreicherungen wie MessageAmp II-Bakterien Kit, das vorzugsweise polyadenylates und verstärkt linearen RNA vorhanden. Einige dieser Verfahren (beispielsweise mRNA-ONLY, Microb E Xpress und MessageAmp) gleichzeitig für eine optimale Effizienz verwendet. Allerdings ist die Wirksamkeit aller dieser Ansätze begrenzt sind, besonders beim Arbeiten mit teilabgebauten rRNA, wie oft in Gesamt-RNA aus CF Proben extrahiert beobachtet. Polyadenylierungs-abhängigen RNA-Amplifikation kann nicht zur metatranscriptomes bestehend sowohl eukaryontische als auch prokaryontische mRNA zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Poly (A) -Schwanz hinzugefügt, um die Sequenzen kann die Menge an nützlichen Sequenzdaten reduziert. Regionen mit Homo Strecken tendenziell niedrigere Qualität Partituren haben, cAStarten eine bedeutende Anzahl von Lesevorgängen, die von Sequenzierung und Post-Sequenzer-Software, und die durchschnittliche Nutzungsleselänge nach dem Schneiden aus Poly gefiltert werden (A) Schwanz deutlich 54 reduziert werden. Der Umgang mit komplexen CF mikrobieller Gemeinschaften und teilweise abgebauten RNA (4A und 4C), unsere frühere Studie zeigte, dass die Hybridisierungs-Capture-Methode durch die Ribo-Zero Gold-Kits war wirksamer bei der Entfernung von Mensch und Mikroben rRNA im Vergleich zu den zu kombinieren Behandlungen mit anderen Kits 9 (Tabelle 3). Die sich ergebenden Daten ermöglicht die gleichzeitige Analyse von sowohl menschlichen Wirt und mikrobielle Transkripte. In Abhängigkeit von der Ausbeute und Qualität der RNA sowie ultimative Wahl für Sequenzierungsplattform, können viele dieser Prozesse einschließlich der cDNA-Synthese mit Schritt Sequenzierung Bibliothek Generation gestrafft werden. Beispielsweise kann Ribo-Zero behandelten RNA verwendet werden, um metatranscriptome Sequenzierung Waage machenries mit ScriptSeq RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung Kit. Metagenom-Analyse von Tier-assoziierten Gemeinden bietet eine umfassende Darstellung des Gesamtfunktionseinheit, die den Host und die zugehörigen Gemeinden umfasst. Die hier vorgestellte Arbeitsablauf ist an eine Vielzahl von komplexen Tierassoziierten Proben, insbesondere solche, zähen Schleim, große Mengen von Zelltrümmern, extrazellulären DNA, Protein und Glycoprotein-Komplexe, sowie Wirtszellen neben dem gewünschten viralen und mikrobiellen enthalten Partikel. Obwohl virale und mikrobielle Partikel können bei jedem Schritt verloren werden Partikel der Isolierung und Reinigung sind für die Menge der Wirts-DNA zu minimieren. Während die Metagenomik Daten bietet metabolische Potentiale der untersuchten Gemeinden metatranscriptomics diese ergänzen durch die Enthüllung der differentiellen Expression von codierten Funktionen 9. Eine umfassende Beurteilung der Genomik und Transkripte Daten neu ins ergabüge auf die Dynamik der Gemeinschaft Interaktionen und erleichtert die Entwicklung von Therapien verbessern 9,10,55.

<html> Virus- und Bakteriengemeinschaften mit dem menschlichen Körper verbunden sind ausführlich in den letzten zehn Jahren durch den Einsatz von 1,2-Sequenzierungstechnologien untersucht. Die Ergebnisse wurden auf die Anerkennung der Bedeutung Mikroben im menschlichen Gesundheit und Krankheit geführt. Die große Initiative kam von der Normalflora-Projekt, das die Bakterien beschrieben (und einigen Archaeen), die sich auf der menschlichen Haut und in Mundhöhle, Atemwege, des Urogenitaltraktes und Magen-Darm-3. Weitere microbiome Studien von gesunden menschlichen Atemwege durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) 4,5 und Nasen-Rachen-Abstrichen 4 haben gezeigt, dass die Lunge als Umweltprobenahmevorrichtung, führt zu transienten mikrobiellen Besiedlung der Atemwege dienen. Allerdings können die Auswirkungen der mikrobiellen Besiedlung in beeinträchtigt Atemwegsoberflächen zu schweren und chronischen Infektionen der Lunge, wie sie bei zystischer Fibrose (CF) Patienten gesehen führen. t &quot;&gt; CF ist eine tödliche Krankheit, die durch genetische Mutation in Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) -Gen 6 verursacht wird. Diese Mutationen führen zu fehlerhaften CFTR-Proteine, die sich ihrerseits auf den transepithelialen Ionentransport durch die apikale Oberfläche des Epithels. Die Krankheit betrifft mehrere Organsysteme, aber die Mehrheit der Mortalität und Morbidität ist auf CF Lungenerkrankung 7. Der CF Lunge bietet ein einzigartiges Ökosystem für mikrobielle Besiedlung. Der Defekt in Ionentransport verursacht Schleim in den Atemwegen CF aufzubauen, wodurch Mikroumgebungen bestehend aus Aerobic- , mikroaerophilen und anaeroben Abteile durch eine statische nährstoffreichen Schleimhautoberfläche verankert. Diese Umgebung ermöglicht die Ansiedlung und Vermehrung von Mikroben, wie Viren, Bakterien und Pilze. Akute und chronische Lungen mikrobiellen Infektionen führen zu konstant, aber unwirksam Immunantworten, was zu umfangreiche Umbau der Atemwege, Verlust der Lungenkapazität und letztlich Pulmonary Versagen. Bakteriengemeinschaften mit der CF-Lunge verbunden sind gut beschrieben mit beiden Kultur-abhängigen und kulturunabhängige Ansätze, die mit 16S ribosomale RNA (rRNA) Gensequenzierung 8 und Schrotflinte Metagenomik 9,10 umfassen. Das 16S-rRNA-basierten Ansatz in der Lage, eine breite Palette von Mikrobenarten zu charakterisieren und zu erfassen breiten Verschiebungen Community Vielfalt. Es wird jedoch in seiner Entschließung bei der Festlegung der Gemeinschaften begrenzt (in Claesson et al zusammengefasst. 2010 11) und die Vorhersagen von Stoffwechselpotentiale zu diesen allgemeinen Funktionen für die Taxa identifiziert bekannte begrenzt. Daher sind 16S-rRNA-Gen-Sequenzierungsverfahren nicht ausreichend für die notwendige taxonomische und funktionelle analytische Genauigkeit der verschiedenen Mikroben in CF Lunge vorhanden Gemeinden. Die hier beschriebene Metagenom-Ansatz ergänzt die 16S-rRNA-basierten Ansatz, überwindet seine Grenzen, und ermöglicht eine relativ effektive Artum sowohl die mikrobielle Gemeinschaft Taxonomie und genetische Inhalte in CF Lungen analysieren. Mikrobielle DNA aus Tierassoziierte Proben isoliert enthält häufig eine große Menge an Wirts-DNA. CF Sputum oder Lungengewebeproben enthalten üblicherweise eine große Menge von Human-DNA durch Neutrophile bei der Immunreaktion freigesetzt wird, häufig mehr als 99% der Gesamt-DNA von 12 bis 14. Obwohl einige intakte humane Zellen vorhanden sein können, die meisten dieser DNA frei in Lösung oder an der Oberfläche der Keime adsorbieren. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von außerordentlich viskose Schleimpfropfen, Zelltrümmern und anderen unbekannten Verunreinigungen weiter zu komplizieren Isolierung von mikrobiellen Zellen. Mehrere Verfahren wurden zur Abreicherung diese Proben menschlicher DNA, einschließlich Percoll Gradienten verschiedener menschlicher aus mikrobiellen Zellen 15, die Behandlung mit DNase I, Ethidiumbromid Monoazid um selektiv menschliche DNA 16 und die MolYsis Kit, alle mit begrenztem Erfolg verschlechtern getestet.<html> Um eine möglichst wirkungsvolle mikrobiellen DNA Reinigungsverfahren für CF Sputum Termin wurde eine Modifikation der von Breitenstein et al beschriebenen Verfahren (1995). 17. Dieser Ansatz, der hierin als hypotonische Lyse (HL) Verfahren bekannt ist, verwendet eine Kombination von β-Mercaptoethanol Mucin Disulfidbindungen hypotonische Lyse von eukaryotischen Zellen und DNase I-Behandlung von löslichen DNA 9 reduzieren. Trotz des Mangels an Alternativen der HL Verfahren Anlass zu Bedenken wegen (i) mögliche Verzerrungen von unerwünschten Lyse von Mikroben und (ii) resultierenden, ob die beobachteten Schwankungen der Gemeinschaft Zusammensetzung 9,10 sind ein Artefakt der Varianten mit der Probe assoziiert ist. Zusätzlich zu der Erzeugung von Shotgun metagenomes sprechen wir diese Probleme durch Vergleich der 16S-rRNA-Gen-Profile der gesamten DNA und der HL-Methode unter Verwendung des gleichen Satzes von Sputum-Proben von einem Patienten in sieben aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt extrahierte mikrobielle DNA. ent &quot;&gt; Im Vergleich zu mikrobiellen Gemeinschaften, ist die Charakterisierung von viralen Gemeinden mit Tieren verbunden begrenzte 18,19 Die viralen Gemeinden in CF Atemwege haben nur minimal 20 gekennzeichnet worden -.. 22 Die erste Metagenom-Studie die Charakterisierung der DNA von viralen Gemeinden in CF Atemwege zeigten, dass die meisten Viren mit CF Lunge assoziiert sind Phagen 20. Die metabolische Potential des Phagen in CF und nicht-CF Individuen signifikant verschieden war. Insbesondere die Phage Gemeinschaften in Einzelpersonen CF geführt Gene reflektierende bakterieller Wirts Anpassungen an die Physiologie des CF Atemwege, und bakteriellen Virulenz 20. Im Anschluss Metagenom-Untersuchungen von Viren in CF Lungengewebe zeigten deutliche räumliche Heterogenität der Virus Gemeinden zwischen anatomischen Regionen 22. Darüber hinaus hegte CF Lungengewebe die niedrigste bisher in jedem Ökosystem 22 beobachtet virale Vielfalt. Die meisten Viren identifiziert wurden Phagenmit dem Potential, CF Pathogenen zu infizieren. Jedoch wurden eukaryotischen Viren, wie Herpes-Viren, Adenoviren und menschlichen Papilloma-Viren (HPV) erkannt. In einem Fall, wo Zysten im Lungengewebe wurden bei der Präparation beobachtet wurde, wurde mehr als 99% eines menschlichen Papillomavirus-Genom gewonnen, obwohl der Patient noch nie mit einem Lungen Papillom oder Karzinom diagnostiziert. Dies zeigt, dass die Virus bestehenden Vielfalt spiegelt nicht nur die Schwere der Gewebeschädigung, kann aber auch aussetzen und zu erklären, eine zugrunde liegende nicht charakterisierte Krankheit. Die hier beschriebenen Protokolle bieten eine einfache, aber leistungsfähige Methode, um Virusähnlichen Partikeln (VLPs) von Proben, die von großen Mengen zähen Schleim, Host und mikrobiellen Zellen, freie DNA sowie Zelltrümmer aus isolieren. Ergänzend Metagenomik ist metatranscriptomics verwendet, um die Dynamik in der Genexpression in der mikrobiellen Gemeinschaft und dem Host 9,23 überwachen. In diesem Fall werden sowohl mikrobielle und Host mRNA müssen bevorzugt ausgewählt werden. Da bakterielle mRNAs nicht polyadenyliert kann ein Oligo-dT-basierten mRNA-Pulldown-Verfahren nicht genutzt werden. Polyadenylierungs-abhängigen RNA-Amplifikation nicht in Host-assoziierte Proben verwendet werden, wenn die Proben bekannt, große Mengen von eukaryotischen mRNA enthält. Viele Tierassoziierte Proben, einschließlich CF Sputum, enthalten eine hohe Dichte der Zellen zusätzlich zu hohe Mengen von Zelltrümmern und Nukleasen, die RNasen einschließen. Daher ist eine weitere Herausforderung umfangreiche RNA-Abbau während der Verarbeitung zu verhindern metatranscriptome. In den meisten Fällen ist der Gesamt-RNA aus CF Sputum extrahiert teilabgebauten, Begrenzen der nachfolgenden Anwendungen und Nutzen des abgeleiteten RNA. In den letzten Jahren verschiedene Ansätze für rRNA Depletion wurden entwickelt und im Handel erhältlichen Kits geeignet. Die Wirksamkeit dieser Ansätze ist jedoch begrenzt, vor allem bei der Arbeit mit teilweise abgebaut rRNA 9,24. Die hier eingesetzten Verfahren erlaubened für das Abfragen von partiell abgebaute Gesamt-RNA für eine effiziente nachgeschaltete Gesamt rRNA Entfernung. Direkter Vergleich der Effizienz in rRNA Entfernung aus teilabgebauten gesamten RNA Vergleich von zwei verschiedenen Kits wurde von Lim et al veranschaulicht. (2012) 9. Insgesamt ist es das Ziel dieses Manuskripts zu einem kompletten Satz von Protokollen (Abbildung 1), um virale und mikrobielle shotgun metagenomes erzeugen und eine metatranscriptome bereitzustellen, aus einem einzigen Tier assoziierten Probe unter Verwendung induzierter Sputumprobe als Beispiel. Molekulare Labor-Workflow sollten getrennt vor und nach Verstärkung Bereiche umfassen, um eine Kreuzkontamination zu minimieren. Die Methoden sind einfach an anderen Probentypen wie Gewebe 22, Nasen-Rachen-und Oropharynxabstriche 25, Bronchiallavage (BAL) und Korallen (unveröffentlichte Daten). Jede Probe sollte sofort nach der Entnahme verarbeitet vor allem, wenn mikrobielle Metagenomik und eingehalten werdenatranscriptomics Studien erwünscht. Wenn die Proben eingefroren, schränkt sie die Isolierung der intakten mikrobiellen Zellen auf mikrobielle Metagenomen das Einfrieren möglicherweise zu einer Störung der Zellintegrität. Allerdings bedeutet Gefrieren nicht metatranscriptomics und Virusisolierung, aber die Qualität der RNA und der Menge von Viruspartikeln gewonnen kann durch die Frost-Tau-Prozeß betroffen auszuschließen. Es ist wichtig zu beachten, dass induzierten Sputum hat als primäre Quelle der Proben in vielen Studien mit erwachsenen CF-Patienten und anderen chronischen Lungenerkrankungen 26,27 verbunden als BAL kann zu invasiv werden serviert. In unseren Studien wurden Sputum-Proben mit einer sorgfältigen und konsistenten Methode, dh, nach Mundwasser und Spülen der Mundhöhle mit steriler Kochsalzlösung zur oralen Mikroorganismen Kontamination innerhalb der Sputum-Proben auf ein Minimum gesammelt.

<table><tbody><tr><td>Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td></tr><tr><td>Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>Zirconia-silicate beads were used in this study</td></tr><tr><td>Dithiothreitol, molecular grade (dry powder)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.45 &amp;micro;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I enzyme&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diameter: 25 mm</td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &amp;frac12; in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 fixed angle rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA polymerase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Previously bought from Fidelity Systems</td></tr><tr><td>Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td></tr><tr><td>Total rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td></tr><tr><td>Cesium chloride&amp;nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

Die Zugänglichkeit der Hochdurchsatz-Sequenzierung hat viele Bereiche der Biologie revolutioniert. Um Host-assoziierten viralen und mikrobiellen Gemeinschaften besser zu verstehen, wurde ein umfassendes Workflow für die DNA- und RNA-Extraktion entwickelt. Der Workflow gleichzeitig erzeugt viralen und mikrobiellen Metagenomen sowie metatranscriptomes, aus einer einzigen Probe für Next-Generation-Sequencing. Die Kopplung dieser Ansätze bietet einen Überblick über sowohl die taxonomischen Eigenschaften und den Community-Funktionen codiert. Die vorgestellten Methoden Mukoviszidose (CF) Sputum, eine problematische Probentyp, weil es außerordentlich zäh und enthält hohe Menge an Schleimstoffen, frei von Neutrophilen DNA und andere unbekannte Verunreinigungen. Die hier beschriebenen Protokolle zielen diese Probleme und erfolgreich wiederherzustellen viralen und mikrobiellen DNA mit minimaler menschlicher DNA-Kontamination. Um die Metagenomik Studien zu ergänzen, wurde eine metatranscriptomics Protokoll optimiert, um sowohl die mikrobielle erholenund Host-mRNA, die nur relativ wenige ribosomale RNA (rRNA) Sequenzen enthält. Eine Übersicht über die Datenmerkmale wird präsentiert, um als Referenz für die Beurteilung des Erfolgs der Methoden dienen. Zusätzliche CF Sputum-Proben wurden auch auf (i) die Konsistenz der microbiome Profile in sieben aufeinander folgenden Tagen zu bewerten innerhalb eines einzelnen Patienten, und (ii) Vergleichen der Konsistenz von Metagenom-Ansatz zu einer ribosomalen 16S-RNA-Gen-basierte Sequenzierung gesammelt. Die Ergebnisse zeigten, dass eine tägliche Schwankung mikrobiellen Profile ohne Antibiotikum Störung war minimal und die Taxonomie Profile der gemeinsamen CF-assoziierten Bakterien waren sehr ähnlich zwischen den 16S rDNA-Bibliotheken und metagenomes vom hypotonische Lyse (HL) stammenden DNA erzeugt. Jedoch sind die Unterschiede zwischen den 16S rDNA taxonomischen Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA erzeugt vorschlagen, dass hypotonische Lyse und die Waschschritte nicht nur das Entfernen des vom Menschen stammenden DNA zu profitieren, sondern auch mikrobielle extracellular DNA, die die tatsächlichen mikrobiellen Profile falsch darstellen kann.

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Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K Aufrufe.  San Diego State University.  Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren. 

Serie: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomanalyse von Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Forschung

Genetik

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Umwelt

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

Neue Sequenz Entdeckung durch subtraktive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Entwicklungsbiologie

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Neurowissenschaften

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Biologie

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...