Name: the soft agar colony formation assay
Uploaded: 2014-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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This study was supported by a Merit Award from the U.S. Department of Veterans Affairs, and an NIH grant R01CA1385282522717 to RW.

1. Herstellung von Materialien und Reagenzien <ol><li> Beschriften Sie jede Vertiefung einer Gewebekultur behandelt 6-Well-Platte passend für jede Zelllinie oder der Zustand untersucht. </li><li> Vorbereitung 2x Zellkulturmedium durch Auflösen von 1 g Pulver Medium und 0,2 g Natriumbicarbonat in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml. </li><li> Geben dieses Medium durch ein 0,2-um-Filter sterilisiert. </li><li> Hinzufügen zusätzlicher Komponenten für normale Kultur der Zelllinie von Interesse erforderlich ist. Zum Beispiel wachsen CMT 167 Zelllinie in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung ergänzt. Warme Medium auf 37 ° C in heißes Wasserbad vor der Verwendung. </li><li> Bereiten 1x Zellkulturmedium getrennt, wie Sie es für die normale Zellkultur der Zelllinie von Interesse. </li><li> Bereiten Sie 1% Edel Agar durch Zugabe von 1 g edlen Agar auf 100 ml VE-Wasser. HINWEIS: Edel-Agar nicht vollständig unter Rühren alleine lösen. </li><li> Vorbereiten0,6% edle Agar durch Zugabe von 0,6 g Edel Agar in 100 ml entionisiertem Wasser. Beide Lösungen können Agar in 100 ml Glasflaschen mit verschließbarem Deckel für Langzeitlagerung erfolgen. </li><li> Autoklaven wird das edle Agar Mischungen zu sterilisieren. Diese Gemische können im Voraus hergestellt werden und bei 4 ° C gelagert, sondern sollte zum Zeitpunkt des Experiments wieder erhitzt, bis Agar vollständig gelöst werden. </li><li> Vorbereitung Nitroblautetrazoliumchlorid Lösung durch Herstellung einer 1 mg / ml Stammlösung in 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 in H 2 O auf ein Endvolumen von 1000 ml ). Dies wird am Ende des Experiments werden die Kolonien zu färben. </li></ol> 2. Überzug der Bodenschicht aus Agar <ol><li> Lösen Sie die Schutzkappe auf der Flasche von 1% Edel Agar und Mikrowelle für ca. 1-2 min. Unter Erhitzen in einer Mikrowelle, überwachen die Lösung eng zu vermeiden Überkochen. Weiter Heizung, beim Mischen mit Unterbrechungen,bis Agar vollständig gelöst und die Lösung klar ist. HINWEIS: Verwenden Sie hitzebeständige Handschuhe, um Kolben nach dem Erhitzen zu behandeln. Geschieht dies nicht, kann Verbrennungen oder schweren Verletzungen führen. </li><li> Zeigen geschmolzen Agarlösung und vorgewärmten 2x Kulturmedium in einem Eiskübel mit heißem Leitungswasser (42 ° C) gefüllt. Legen auch eine 50 ml konischen Röhrchen in einem Rohrhalter im Eiskübel mit heißem Wasser. Übertragen Sie Eimer, um die Zellkultur Kapuze für nachfolgende Schritte. </li><li> Für die untere Schicht aus Agar, benötigen Sie 1,5 ml einer Mischung aus Agar und Medium pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. </li><li> Um eine ausreichende Menge der Mischung zu gewährleisten, bereiten insgesamt 12 ml pro 6-Well-Platte. </li><li> Gestartet durch Zugabe von 6 ml Kulturmedium, zu dem 50 ml konischen Röhrchen und dann 6 ml der 1% Edel Agarlösung. </li><li> Kehren Sie die konischen Rohr mehrmals, um zu mischen. Arbeiten bei flottem Tempo wird ein vorzeitiges Aushärten des Soft-Agar zu verhindern. </li><li> Auszuarbeiten etwa 5,5 ml Mischung in eine 5 ml serologische piPette. </li><li> Lassen Sie die Luftblasen nach oben von Pipettensäule vor Hinterlegung 1,5 ml dieser Mischung in jedes Well steigen. Seien Sie vorsichtig, um die Ablagerung von Luftblasen in die Plattenvertiefungen zu vermeiden. </li><li> Die Platten abdecken und lassen Agar Gemisch bei Raumtemperatur verfestigt, in Zellkulturhaube, für 30 min. </li></ol> 3. Überzug der oberen Schicht der Agar enthaltenden Zellen <ol><li> Nachdem die untere Schicht aus Agar sich verfestigt hat, beginnen Herstellung der oberen Schicht. </li><li> Zuerst Ernte die Zellen durch Trypsinierung und verdünnte sie 1: 5 in Kulturmedium (zB 1 ml Trypsin, 4 ml Medium) in eine 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zählen von Zellen und die Berechnung der Anzahl der benötigten Zellen pro Vertiefung, um eine Zellsuspension zu dieser Zeit vorzubereiten. Diese Zahl wird je nach Zelltyp variieren. Verwenden 5.000 Zellen / Well als Ausgangspunkt und nach Bedarf anpassen. Aus diesem Zellzahl, können Sie eine Zellsuspension von 6667 Zellen / ml vorbereiten würde (dh jeden well werden 0,75 ml dieser Suspension und 0,75 ml des Agar mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml zu erhalten; 2 für eine endgültige Gesamtzellzahl von 5000): die Konzentration der Zellen wird auch 1 verdünnt werden. </li><li> Das Volumen, die pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen Zellsuspension wird erneut 1,5 ml betragen. Bereiten Sie zusätzliche Zellsuspension in Höhe von 12 ml pro 6-Well-Platte. </li><li> Schmelz 0,6% Agar-Lösung in einer Mikrowelle, wie oben und setzen in Eis Eimer mit heißem Wasser zusammen mit einem 50 ml konischen Röhrchen in einem Rohrhalter und der Zellsuspension aus Schritt 3.3. </li><li> Übertragen Sie die Eiskübel mit geschmolzenem 0,6% Agar, um die Zellkultur Kapuze für nachfolgende Schritte. </li><li> Mischungs 0,6% Agar und Zellsuspension in einem Verhältnis 1: 1, Herstellung eines Gesamtvolumens von 12 ml pro Platte mit 6 Vertiefungen. 1,5 ml pro Vertiefung wird erforderlich sein, aber Extra sollte wie oben durchgeführt werden. </li><li> Pipette 6 ml der Zellsuspension in 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Dann 6 ml 0,6% Agar in das Röhrchen. HINWEIS: Die Temperatur dieser Mischung mussgehalten etwa 42 ° C, um ein vorzeitiges Härten zu vermeiden und das Überleben der Zelle zu maximieren. </li><li> Schnell arbeiten, Pipetten diese Mischung 2-3x um Zellen zu verteilen, dann erarbeiten 5,5 ml Mischung in eine 5 ml serologische Pipette. </li><li> Lassen Sie eventuell vorhandene Luftblasen, um zum Anfang der Pipettensäule vor Hinterlegung 1,5 ml dieser Mischung in jedes Well steigen. Seien Sie vorsichtig, um die Ablagerung von Luftblasen in die Plattenvertiefungen zu vermeiden. </li><li> Erlauben Zelle / Agar Gemisch bei Raumtemperatur, bevor sie in eine 37 ° C befeuchteten Zellkulturbrutschrank zu verfestigen, in Zellkulturhaube, für 30 min. </li><li> Die angemessene Koloniebildung erforderliche Zeit variiert für jede Zelllinie, typischerweise etwa 21 Tage. </li><li> Eine Schicht aus Wachstumsmedium sollte über die obere Agar-Schicht, um ein Austrocknen zu verhindern, aufrechterhalten werden. 100 ul Medium zweimal wöchentlich hinzugefügt ist für diesen Zweck ausreichend. </li></ol> 4. Die Färbung der Platten und das Zählen der Kolonien <ol><li> Flecken Zellen durch Zugabe von 200 _6; l Nitroblau-Tetrazolium-Chlorid-Lösung pro Well über Nacht bei 37 ° C inkubiert Platten. </li><li> Sobald Kolonien gefärbt sind, fotografieren von Brunnen mit einem Imager und zählen Kolonien mit Bildanalyse-Software. </li></ol>

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	<li>Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+mammalian+cells+in+vitro;+growth+characteristics+of+colonies+from+single+HeLa+cells+with+and+without+a+feeder+layer.">Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer.</a> J Exp Med. 103, 273-283 (1956).</li><li>Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis:+an+emerging+hallmark+in+health+and+diseases.">Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases.</a> The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).</li><li>Wend, P., Holland, J. 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The authors have nothing to disclose.

In vitro Bestätigung tumorsuppressive Funktion von Signalproteinen, ist schwierig. Eine der härtesten Tests zur Verfügung, um diese Eigenschaft zu untersuchen ist die Soft-Agar Koloniebildungstest. Hier haben wir die Koloniebildung in Weichagar-Assay unter Verwendung eines Maus-Lungenkarzinom-Zelllinie stabil überexprimieren Wnt7a und FZD9 Vergleich zu seinem Eltern CMT167 Zelllinie dargestellt. Es gibt mehrere wichtige Punkte zu berücksichtigen hinsichtlich der Soft-Agar-Assays. Der wichtigste Schritt in diesem Assay wird Ausplattieren der Zellen. Zellzahlen müssen genau sein, und die Agar-Lösung darf nicht zu heiß sein. Wenn keine Kolonien gebildet sind, können die Zellen wurden durch Hitzebelastung beschädigt. In dieser Situation sollte der Test wiederholt werden, wobei Vorkehrungen zur Agar Temperatur nahe 42 ° C zu halten. Alternativ kann eine größere Anzahl von Zellen plattiert werden. Es gibt einige Einschränkungen bei der Soft-Agar-Assays.Eine solche Einschränkung ist, dass sie zwei bis drei Wochen für die Fertigstellung. Ein weiterer Grund ist, dass es nicht zur Zellentnahme nach Abschluss ermöglichen. Modifikationen dieser Technik beschäftigen Fach Agar Lösungen ermöglichen Zellen für DNA oder Protein-Assay nach Beendigung geerntet werden. Alternative Methoden verwenden auch fluorometrische Farbstoff für Hochdurchsatz-Tests zu ermöglichen. Dennoch bleibt die traditionelle Koloniebildung in Weichagar-Assay als eine der strengsten Tests zur Bestätigung der verankerungsunabhängigen Zellwachstum.

Die Koloniebildung in Weichagar-Assay ist eine Technik häufig verwendet, um Zelltransformation in vitro zu bewerten. Historisch weiterer Assay, der klonogenen Assay von Puck et al. 1956 wurde verwendet, um die Fähigkeit der Zellen, um Kolonien zu bilden, 1 auszuwerten. In dieser Technik wurden die Zellen auf eine Kulturplatte verteilt und in Gegenwart von &quot;Feeder&quot; Zellen oder konditioniertes Medium die notwendigen Wachstumsfaktoren bereitzustellen gewachsen. Die Einschränkung dieser Technik war, dass es nur zur Verfügung gestellten Informationen über die Koloniebildung. Normale Zellen werden von verankerungsunabhängiges Wachstum gehindert, aufgrund einer bestimmten Art von apoptotischen Tod rief anoikis 2. Jedoch haben transformierten Zellen die Fähigkeit zu wachsen und sich zu teilen, ohne die Bindung an ein Substrat. Um auf diesem Konzept profitieren, entwickelten Forscher die Soft-Agar Koloniebildungstest. Die Koloniebildung in Weichagar-Assay seit modifiziert wurden, in den letzten Jahren zu sp adressierenecific Bedürfnisse. Eine Variante beinhaltet Einbau von fluorimetrischen Farbstoff für Hochdurchsatz-Koloniezählung zu ermöglichen. Eine weitere Variation ist die Verwendung von spezialisierten Agar-Lösung, um abgerufen zu der lebensfähigen Zellen nach der Koloniebildung zu ermöglichen, wenn Protein oder DNA-Proben notwendig. Im herkömmlichen Koloniebildung in Weichagar-Assay werden die Zellen in einer Schicht von weichem Agar mit Zellkulturmedium, das auf einer anderen Schicht aus weichem Agar, auch mit Zellkulturmedium gemischt aufliegt gemischt angebaut, aber mit einer höheren Konzentration von Agar. Dies verhindert, dass Zellen aus dem Kulturplatte haften, noch erlaubt transformierten Zellen zu sichtbaren Kolonien zu bilden. Das Grundprinzip hinter dieser Technik ist, dass normale Zellen abhängen Zelle an extrazelluläre Matrixkontakt in der Lage, zu wachsen und zu verteilen. Umgekehrt transformierten Zellen die Fähigkeit haben, zu wachsen und sich zu teilen, unabhängig von ihrer Umgebung. Daher Zellen in der Lage, Kolonien in einer Verankerung unabhängig bilden waren considered transformiert und krebserregend. Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist es, diese Funktion in Zellen in einem semi-quantitative und strenge Weise zu messen. Der Wnt-Signalweg ist entscheidend in der Embryogenese und in der Tumorgenese 3-6 häufig dereguliert. Es gibt verschiedene Wege mit Wnt-Signalweg verbunden. Die kanonische Weg beinhaltet Wnt-Signalisierung und die Regulierung der Transkription stromabwärts über ihre Auswirkungen auf die transkriptionale Koaktivator beta-catenin. Wnts Signal auch durch einige nicht-kanonische Wege, beispielsweise die planare Zellpolarität Weg, die Elemente in Zytoskelettstruktur 7 beteiligt regelt, und der Wnt-Signalweg Calcium, die Freisetzung von Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum 8 regelt. Wnt-Liganden üben ihre Wirkung durch Bindung Frizzled-Rezeptoren. Obwohl mehrere Wnts wurde gezeigt, dass bei Lungenkrebs hochreguliert werden, hat sich gezeigt, Wnt7a in nicht-Smal herunterreguliert werden,l kleinzelligem Lungenkrebs durch Promotormethylierung 9. Wnt7a bindet FZD9 und wirkt als Tumorsuppressor durch eine nicht-kanonische Weg. Wiederherstellung der Wnt-7a und Frizzled-9 hemmt das Wachstum von nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen 10. Die Wirkungen von Wnt7a / FZD9 werden durch die Aktivierung von ERK-5, die wiederum aktiviert Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ (PPAR) 11,12 vermittelt. Hier zeigen wir, dass die Überexpression von Wnt7a und FZD9 resultiert in der Unterdrückung des verankerungsunabhängigen Wachstums von einem murinen Lungenkarzinom-Zelllinie. Murine CMT167 Zellen wurden aus einem Lungenkarzinom in C57BL / lcrf Mäusen 13 abgeleitet und wurden stabil mit Wnt7a und FZD9 transfiziert. Eine Überexpression von Wnt7a und FZD9 wurden durch quantitative-PCR (Q-PCR) und der Funktionalität Wnt7a und FZD9 Expression bestätigt wurde durch nachgeschaltete Aktivierung von PPAR &amp; ggr bestätigt.

<table><tbody><tr><td>Cancer Cell Line of Interest</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10032302</td><td>CMT-167 Cells</td></tr><tr><td>Powdered RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td>Used to prepare 2x cell culture medium.</td></tr><tr><td>Liquid RPMI 1650 Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Referred to as 1x cell culture medium.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td>Used to supplement cell culture medium.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>CellGro</td><td>30-002-Cl</td><td>Used in cell culture medium.</td></tr><tr><td>Difco Noble Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214230</td><td>Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher</td><td>BP-328-1</td><td>Used in 2x cell culture medium.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Bottle-Top Filters</td><td>Fisher</td><td>09-761-126</td><td>Used to sterile filter 2x medium.</td></tr><tr><td>Lipofectamine Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>18324-020</td><td>Used in PPAR-RE luciferase assay.</td></tr><tr><td>6-well Plates Tissue-culture Treated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;#176;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Doc Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Used to take pictures of colonies.</td></tr><tr><td>Quantity One Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Used to count cell colonies.</td></tr><tr><td>15 ml Conical Tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological Pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer w/ cover slip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Light Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat-Resistant Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the soft agar colony formation assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Der Ausdruck Wnt7a und FZD9 in CMT167 Zellen wirksam ist Tumorsuppression wie unsere Koloniebildung in Weichagar-Assay veranschaulicht. Vorbereitend, Q-PCR verwendeten wir zu zeigen, dass Wnt7a und FZD9 mRNA sind in geringen Mengen in CMT167 Zellen exprimiert. CMT167 Zellen zeigten geringe endogene Wnt7a und FZD9 Vergleich zu MLE-12-Zellen, eine SV40-transformierte murine Lungen-Epithel-Zelllinie (1). Dann transfiziert CMT167 Zellen mit zwei retroviralen Vektoren, die Überexpression menschlichen Konstrukte Wnt7a (LNCX-Wnt7a) und FZD9 (LPCX-FZD9), um eine stabile Zelllinie, die sowohl Wnt7a und FZD9 (CMT LL Wnt7a / FZD9) zum Ausdruck bringt. Wir bestätigten die Expression von Wnt7a und FZD9 durch Q-PCR in dieser Zelllinie (Figur 2). Da unsere bisherige Arbeit gezeigt hat, ist PPAR ein nachgeschalteter Effektor Wnt7a / FZD9 Signalisierung. Wnt Signalwege sind vielfältig. Deshalb muss die richtige Expression und Aktivierung eines bestimmten Wnt und seine Frizzled-Rezeptor Eseln seinSed mit einem nachgeschalteten Effektor, der dafür bekannt ist, durch den Wnt / Frizzled-Paar von Interesse aktiviert werden. Für Wnt7a und FZD9 wurde PPAR aus diesem Grund gewählt. Wir transfizierten CMT167 überexprimierenden Zellen leer Vektoren (LNCX / LPCX) oder Wnt7a / FZD9 mit einem Luciferase-Reporterkonstrukt, das eine PPAR-Response-Element. Wir haben gezeigt, dass unsere CMT167 LL Wnt7a / FZD9 Zelllinie hatte fast versechsfacht PPAR-RE-Aktivität (Abbildung 3). Schließlich wird, wie zuvor erwähnt, die Tumorsuppressor-Aktivität Wnt7a und FZD9 in vitro zu bestätigen, führten wir eine Weichagar-Koloniebildungs-Assay. CMT167 Vektor exprimieren und Wnt7a / FZD9 exprimierenden stabilen Zelllinien wurden auf weichen Agarplatten und dürfen Kolonien für zwei bis drei Wochen zu bilden. CMT167 LL Wnt7a / FZD9 Zellen gebildet deutlich weniger Kolonien, wenn sie Vektor transfizierten Zellen verglichen, die die Tumorsuppressor-Funktion Wnt7a und FZD9 (Abbildung 4). Bilder wurden von allen Platten genommen und Colonies wurden mit einem Bildwandler und Bildbearbeitungssoftware gezählt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51998/51998fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Vergleich zu MLE-12-Zellen Erniedrigte Wnt7a und FZD9 mRNA in CMT167 Zellen Q-PCR-Analyse wurde durchgeführt, um mRNA-Spiegel von Wnt7a und FZD9 normiert auf GAPDH bestimmen.. Levels in CME167 murinen Lungenkarzinomzellen wurden mit denen in MLE-12 SV40-transformierte murine Lungenepithelzellen, die auf 1,0 normiert wurden verglichen. CMT167 Zellen zeigten niedrigere Wnt7a (A) und FZD9 (B) mRNA im Vergleich zu MLE-12-Zellen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51998/51998fig2highres.jpg" /> Abbildung 2:. Die Überexpression von Wnt7a / FZD9 in CMT167 LL Wnt7a / FZD9 stabile Zelllinie Wnt7a / FZD9 stabile Überexpression menschliche Konstrukte wurden unter Verwendung eines LN gemacht<html> CX retroviraler Vektor. Q-PCR wurde für Wnt7a und FZD9 geführt und mRNA-Spiegel wurden normalisiert auf GAPDH in leeren Vektor transfizierten Zellen und in Wnt7a / FZD9 überexprimierenden Zellen. CMT167 LL Wnt7a / FZD9 Zellen exprimiert hohe Wnt7a (A) und FZD9 (B) mRNA. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51998/51998fig3highres.jpg" /> Figur 3: CMT167 Wnt7a / FZD9 stabil überexprimierende Zelllinie eine erhöhte PPAR-RE Promotoraktivität CMT167 LL Wnt7a / FZD9 oder leerem Vektor CMT167 LNCX / LPCX stabile überexprimierenden Zellen wurden mit einem PPAR-Response-Element-Promotor-Luciferase-Plasmid unter Verwendung von Lipofectamin-Reagens transfiziert.. Promotor-Aktivität wurde verglichen mit Vektor transfizierten Zellen, in denen die Promotoraktivität auf 1,0 normalisiert quantifiziert. CMT167 LL Wnt7a / FZD9 stabile überexprimierenden Zellen zeigten eine etwa sechsfache Erhöhung der PPAR-Promotoraktivität. _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/51998/51998fig4highres.jpg" /> Fig. 4: Koloniebildung in Weichagar-Assay von Vektor-exprimierenden CMT167 LNCX / LPCX Zellen und CMT167 LL Wnt7a / FZD9 überexprimierenden Zellen Vektor exprimierenden CMT167 LNCX / LPCX Zellen und CMT167 LL Wnt7a / FZD9 überexprimierenden Zellen wurden in eine Koloniebildung in Weichagar plattiert Assay pro oben beschriebenen Protokoll. CMT167 LL Wnt7a / FZD9 Zellen zeigten eine deutliche Abnahme der Koloniebildung. Repräsentative Vertiefungen, die Kolonien für jede Zelllinie. Bild von Brunnen sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

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The Soft Agar Colony Formation Assay

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Die Soft-Agar Koloniebildungstest

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

111.3K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Serie: The Soft Agar Colony Formation Assay

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Forschung

Biologie

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Medizin

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Immunologie und Infektion

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

Ein semi-quantitativer Ansatz, um die Biofilmbildung Mit Wrinkled Colony Entwicklung zu bewerten

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Keratinocyte Colony Formation Assay: An In Vitro Assay to Assess the Ability of Keratinocytes to Grow into Colonies

Source: Morris, R. J. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58701"> Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture</a>. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we perform a clonogenic assay of keratinocytes harvested from adult mice to determine the ability of individual cells to proliferate and form colonies. This keratinocyte harvesting technique is useful for studying other downstream aspects of cutaneous chemical carcinogenesis and tumor promotion.

Keratinozyten-Koloniebildungs-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit von Keratinozyten, zu Kolonien zu wachsen

Source: Morris, R. J. et al.  Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

Skin Cancer

Assays and techniques

Soft Agar Colony Formation Assay: A Method to Test Effects of Novel Compounds on Cancer Cell Proliferation

Source: Horibata A. et. al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52727/utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors"> Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video describes a soft agar colony formation assay to test the effects of a PADI enzyme inhibitor and BB-Cl-amidine on breast cancer tumorigenicity in vitro. This assay also enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations.

Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien: Eine Methode zum Testen der Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen

Source: Horibata A. et. al.,  Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. ...

Breast Cancer

In vitro studies

Colony Formation Assay: Assessing the Efficacy of Anticancer Agents on Colony-Forming Lung Cancer Cells

Source: Lee, J. Y.et al, <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57490/preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a>&#160;J. Vis. Exp.(2018).
This video describes the colony formation assay, which helps determine lung cancer cells&#39; ability to proliferate indefinitely and form individual colonies. We can analyze the effect of an anticancer agent on the colony-forming cells by analyzing the changes in the number and/or size of the resulting colonies.

Colony Formation Assay: Bewertung der Wirksamkeit von Antikrebsmitteln auf koloniebildende Lungenkrebszellen

Source: Lee, J. Y.et al, Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish ...

Lung Cancer

In vitro study

Giemsa Staining for Colony Formation Assay: An In Vitro Staining Procedure to Assess Proliferative Capability of Mesenchymal Stem Cells

To carry out the CFU assay, prepare 10 milliliters of Giemsa solution per dish, by using sterile water to dilute the stock solution 1 to 10. Remove the medium from the cell culture dish, and use PBS to carefully wash the cells.
With pure methanol, fix the cells at room temperature for 5 minutes, then, discard the methanol and add the Giemsa solution. Incubate in a humidified chamber at 37 degrees Celsius for 60 minutes. After the incubation, use PBS to wash the cells twice. Then, air-dry the plate head-first on a paper towel. With a marker on the back of the plate, manually count the colonies.