Name: single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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Dieses Projekt wurde vom Land Baden-Württemberg sowie von der Europäischen Union, Europäischer Fonds finanziert für sterben Regionale entwicklung. Die Autoren danken Rainer Wittig (ILM Ulm) für die Bereitstellung der U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Zelllinie und Claudia Hintze für geschickte technische Hilfe.

1. Zell Sphäroid wächst und Inkubation <ol><li> Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert <ol><li> Bereiten Agarose 1,5% im Kulturmedium durch Zugabe von 0,45 g Agarose auf 30 ml Kulturmedium (ausreichend für 6 Platten). </li><li> Das Gemisch aus Schritt 1.1.1 auf mindestens 80 ° C unter Rühren von Zeit zu Zeit. </li><li> Füllen Sie 50 ul der erhitzten Mischung aus Schritt 1.1.2 in jedes Well einer 96-Well-Platte und lassen Sie es in 1-2 Stunden fest werden. Lagern Sie die Platten geschlossen und abgedeckt im Kühlschrank bei 5 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Samen etwa 150 MCF-7-Brustkrebszellen in jeder Vertiefung der hergestellten Platte mit 96 Vertiefungen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit Ham F-12-Kulturmedium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin / Streptomycin . </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 3776, c. </li><li> Die Zell Sphäroide mit der Anthracyclin-Antibiotikum Doxorubicin-Hydrochlorid für 6 Stunden Inkubation bei einer Konzentration im Bereich zwischen 2 um und 8 um (in Kulturmedium) in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Die Zell Sphäroiden mit Kulturmedium oder Earle-Balanced Salt Solution (EBSS) vor der Mikroskopie zu waschen. </li></ol></li><li> Versuch 2: Oxidationsprozess in Sphäroiden eine Redox-Sensor zum Ausdruck <ol><li> Samen etwa 400 U251-MG-L106 Glioblastomzellen permanent mit der Glutathion-empfindliche grün fluoreszierenden Redoxsensor Grx1-roGFP2 in Agarose-Gel-beschichtete Vertiefungen (in Schritten beschriebenen Verfahren 1.1.1-1.1.3) transfiziert einer 96-Well-Platte in DMEM Kulturmedium mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Hygromycin B (150 ug / ml) ergänzt. </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Fügen Sie 10 &amp; #181; l Wasserstoffperoxid-Lösung (purum pa, ≥ 30%) auf 990 ul bi-destilliertem Wasser zu einer 100 mM Stammlösung zu schaffen, um innerhalb von 12 Stunden verwendet werden. </li><li> Von der Stammlösung aus Schritt 1.2.3 bis 50 um in EBSS direkt vor dem Experiment. </li><li> Während der Messung mit Wasserstoffperoxid 50 um EBSS zur Oxidation des Redox-Sensor die Zellkügelchen über das mikrofluidische System zu inkubieren. </li></ol></li><li> Versuch 3: Initiation und Kennzeichnung von zellulären Nekrose innerhalb Sphäroiden <ol><li> Samen etwa 400 Zellen (zB U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Glioblastomzellen) in Agarose-Gel-beschichtete Vertiefungen (in Schritten beschriebenen Verfahren 1.1.1-1.1.3) einer Platte mit 96 Vertiefungen in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Hygromycin B (150 mg / ml). </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Inkubieren Sie die ZelleSphäroide mit der mitochondrialen Elektronentransportinhibitor Rotenon für 3 Stunden bei einer Konzentration von 1 uM in einem Kulturmedium, um zelluläre Nekrose induzieren. Die gleichzeitige Inkubation mit einem grünen Farbstoff Zytotoxizität für 3 Stunden bei einer Konzentration von 1 ul in 1 ml Kulturmedium zu nekrotischen Zellen zu markieren. </li><li> Mit Kulturmedium oder EBSS vor Mikroskopie Waschen Sie die Zell Sphäroiden. </li></ol></li></ol> 2. Lichtblatt Anpassung Hinweis: Zur Erzielung bester Ergebnisse ist darauf zu achten, dass die Strahltaille des Lichtblattes ist in der Fokusebene der Objektivlinse ist. Die Position der Strahltaille kann nur durch Beobachten der Lichtblatt in vertikaler Position in bezug auf die Kapillare ausgerichtet werden (siehe Schritte 2,5-2,8). <ol><li> Verwenden Sie ein inverses Mikroskop und montieren Sie die SPIM Anregung Modul, wie in Lit. beschrieben. 16 an der Grundplatte des Positionierungstisches (siehe Abbildung 1a). </li><li> Rüsten Sie das Mikroskop mit einer 10X / 0,3 oder 20x / 0,5 Mikroskopobjektivlinse und ein geeignetes Tiefpassfilter (beispielsweise λ ≥ 515 nm) in dem Detektionspfad des Mikroskops. </li><li> Halterung eine integrierende Kamera auf den Detektionsanschluss des Mikroskops. </li><li> Eine parallele kollimierten Strahl eines Lasers oder einer Laserdiode mit einer Anregungswellenlänge von vorzugsweise 470 nm und es auf dem SPIM Modul. </li><li> Drehen die Zylinderlinse von 90 Grad, die das Licht Blatt in einer vertikalen Position für eine axiale Einstellung der Strahltaille des Lichtbogenüber. </li><li> Platzieren einer Kapillare eine Flüssigkeit mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der in den Probenhalter enthält. </li><li> Befestigen des Probenhalters mit der Kapillare auf den Positionierungstisch des Mikroskops und richten die Position der Kapillare, so dass er zentriert ist und die Strahltaille des Lichtblattes im Fokus ist. </li><li> Einstellen der Strahltaille durch Veränderung der axialen Position der Zylinderlinse sich. Drehen Sie die Linse nach Anzeigenstellung. </li></ol> 3. Zell Sphäroid Anwendung und Mikroskop-Feed Synchronisation <ol><li> Küvette Sphäroide einzeln oder in Gruppen in dem rechteckigen Borosilikatglas Kapillaren 16 mit einem Innenquerschnitt von 600 um x 600 um und einer Wanddicke von 120 um. Zwei Verfahren für die Anwendung eines Zell-Sphäroiden haben sich als erfolgreich erwiesen. <ol><li> Nehmen Sie die leeren Kapillare senkrecht mit Daumen und Mittelfinger und dichten die obere Öffnung mit dem Zeigefinger. Bringen Sie die untere Öffnung in der Nähe der Zell-Sphäroiden in seiner Umgebung Flüssigkeit (EBSS oder Kulturmedium). Lassen Sie den Zeigefinger von der oberen Öffnung. Flüssigkeit mit der Zell-Sphäroiden in sie sofort durch Kapillarkräfte eingeweicht werden. Einstellen der Position des Sphäroids innerhalb der gefüllten Kapillare durch Schwerkraft in den jeweiligen aufrechten Position der Kapillare. </li><li> Alternativ gelten die Zelle Sphäroid auf die Kapillare über Pipettieren. Achten Sie darauf, that die Öffnung der Pipettenspitze ist, die einerseits groß genug für das Sphäroid Größe und andererseits kleiner oder gleich groß wie der Innendurchmesser der Kapillare. </li></ol></li><li> Platzieren der Kapillare mit dem Sphäroid in ihm in einem speziellen Probenhalter für die Mikroskopie. </li><li> Befestigen des Probenhalters mit der Kapillare auf den Positionierungstisch des Mikroskops und richten die Position der Zell-Sphäroiden, daß sie zentriert und ausgerichtet. </li><li> Stellen Sie die Anpassung zwischen dem Lichtbogen und der Brennebene des Mikroskopobjektivlinse in dem Detektionspfad durch Einstellen der Position des Reflexionsspiegels und der zylindrischen Linse (siehe Einstellschraube in 1B). </li><li> Einstellen der Mikrometerschraube (siehe Figur 1B) entsprechend den Brechungsindices und der numerischen Apertur der Objektivlinse, um das Aquarium Effekt zu kompensieren. Anmerkung: verschiedene Brechungsindizes der Probe, und die sie umgebenden Medien ter die Objektivlinse zu einer Differenz zwischen der Verschiebung der Objektivlinse und der Verschiebung der Brennebene. Da der Lichtbogen wird durch die Objektivrevolver bewegt wird, wird die Fehlanpassung zwischen der Verschiebung des Lichtbogen (entsprechend der Verschiebung der Objektivlinse) und die Verschiebung der Fokusebene durch einen Hebelarm kompensiert (siehe Abbildung 1b). Die Mikrometerschraube wird verwendet, um den Abstand zwischen den oberen und den unteren Stift anzupassen, um die Verschiebung des Lichtbogens gemäß der numerischen Apertur der Objektivlinse und der Brechungsindizes ändern. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. (A) Bild von der an der Grundplatte des Stelltisch von einem inversen Mikroskop montiert einzigen Ebene Beleuchtungsmodul, (B) Aufbau der einzelnen Ebene BeleuchtungModul und das Mikroskop Feed Synchronisation auf die Hebe-Mismatch (Aquarium-Effekt) zwischen Brennebene und Beleuchtungsebene auszugleichen. Az o zeigt die Verschiebung der Objektivlinse und Az f die Verschiebung der Brennebene und der Lichtbogen. Die Einlage zeigt Querschnitte von Sphäroiden enthält Kapillaren. Links: rechteckige Kapillare mit Innendurchmesser von 600 um (Wand 120 um). Rechts: Setup für die Rotation eingesetzt. Einen inneren runden Kapillare (Innendurchmesser 400 um, Außendurchmesser 550 um) in dem äußeren rechteckigen Kapillare gedreht. Der Raum zwischen den beiden Kapillaren mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt ist. 4. Messung in dynamischen flüssigen Umgebung HINWEIS: Die bisherige Protokoll wird für die statische Inkubation vor einer Messung, bei der die Zelle Sphäroid zuvor in der Kapillare durch einfache Gravitation inkubiert und dann an Ort und Stelle gehalten wurde verwendet. Es besteht keine Notwendigkeit für eine weitere Befestigungsauf. Für Messungen in strömenden Medien, in denen eine dynamische Inkubation und daher ist eine dynamische Umgebung wünschenswert Aufnahmekinetik messen, kann diese Unterprotokoll auszuführen. Schritte 4,5-4,9 sind entscheidend, um Luftblasen Erreichen der Probe zu vermeiden. <ol><li> Füllen der Kapillare mit FCS für 30 min später zelluläre Adhäsion einer Zelle Sphäroid mit dem inneren Glasoberfläche zu unterstützen. </li><li> Lassen die restlichen FCS Beschichtung im abgereicherten Kapillare austrocknen mindestens 12 Stunden. </li><li> Einführung der Zell-Sphäroiden in die FCS beschichtet Kapillare, wie in Schritt 3.2 beschrieben. </li><li> Verlassen die Kapillare im Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C für weitere 2-4 h auf zelluläre Adhäsion des Sphäroids verursachen. </li><li> Den Zustrom Teil des mikrofluidischen Systems (siehe Abbildung 2). Verwenden eine peristaltische Pumpe, um die Zuströmung des Schlauchs zu füllen (Innendurchmesser: 0,89 mm) mit Kulturmedium, das den Fluoreszenzfarbstoff, Arzneimittel oder Mittel. </li><li> Connect der Zustrom Teil des mikrofluidischen Systems zu einer Blasenfalle (siehe Abbildung 2). </li><li> Erste Klemme der Kapillare blasenfrei an den Zulauf Rohr und klemmen dann die andere Seite der Kapillare an der Ablaufschlauch. </li><li> Abstimmung der Temperatur der Flüssigkeit von dem Wasserbad zu dem gewünschten Wert (zB 37 ° C). </li><li> Einstellen der Schlauchpumpe auf die gewünschte Pumpengeschwindigkeit (zB Flußrate: 9 ml / min, Pumpengeschwindigkeit in der Kapillare: 25 mm / min). </li><li> Sammeln Sie die gepumpte Flüssigkeit entweder in einem Empfänger (Open-Loop-Setup), führen Sie es zurück zu seiner Quelle (Closed-Loop-Setup) oder führen Sie es direkt in den Schlauch der Schlauchpumpe (tight Closed-Loop-Setup). </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Mikrofluidik-Setup (Open-Loop-und Closed-Loop fest); Inlay: Beleuchtung eines spheroid innerhalb einer Mikro-Kapillare mittels Lichtbogen auf der Basis der Fluoreszenzmikroskopie zu einem inversen Mikroskop gekoppelt. 5. Datenerfassung und Auswertung <ol><li> Eingestellt, die Laserleistung und die Integrationszeit für die Bildaufnahme. </li><li> Achten Sie darauf, dass die in Schritt 5.1 festgelegten Parameter nicht Licht Dosiswerte etwa 50-100 J / cm 2 für native Zellen oder 10-20 J / cm 2 für Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff inkubiert oder mit einem fluoreszierenden Protein kodierenden Plasmid transfiziert nicht überschreiten Phototoxizität zu vermeiden (Details siehe Ref. 12). </li><li> Stellen Sie die Schrittweite für die Z-Stapel, um Az = 5-10 um was bevorzugt für 3-dimensionale Datenanalyse ist als das Licht Blechdicke etwa 10 um. </li><li> Führen Messungen von Einzelbildern oder Z-Stapel durch Variation der Brennebene innerhalb des Zell-Sphäroiden. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) Gerät, das für 3-dimensionale Zellsysteme optimiert ist, zB, mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). Drei beispielhafte Anwendungen umfassen (1) die Aufnahme eines Zytostatikums und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt (deren Beitrag zur chemotherapeutischen Wirksamkeit bleibt ausgewertet werden), (2) Messung des Redox-Zustand durch Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor auf Zugabe e...

Neben den gut etablierten Methoden (oder konfokalen Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie 1-4, Structured Illumination Microscopy 5,6) Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) hat sich als eine wertvolle Methode der 3D-Bildgebung 7,8 sein, 9. Von besonderem Interesse ist die Anwendung eines 3-dimensionalen Zellkulturen, beispielsweise multizellulären Tumor-Sphäroide (MCT), die zunehmend für die Wirkstoffforschung 10,11 verwendet werden. Darüber hinaus ist eine bevorzugte Methode SPIM, wenn auch bei langfristiger Exposition oder sich wiederholende Messungen schlechten Licht Dosen sind erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Probe zu erhalten, da für die Messung von jeder Ebene der Probe nur diese Ebene dem Licht ausgesetzt wird. Dies steht im Gegensatz zu anderen Mikroskopietechniken, wobei zur Detektion der jeweiligen Brennebene die gesamte Probe beleuchtet wird, so daß bei der Aufzeichnung einer Vielzahl von Ebenen, die die Lichtdosis summiert und kann die Probe 12 zu beschädigen. </p&gt; Lichtschnittmikroskopie oder SPIM auf Beleuchtung der Probe in Richtung senkrecht zur Beobachtungspfad entweder durch die Verwendung einer Zylinderlinse oder durch Abtasten des anregenden Laserstrahls (für eine Übersicht siehe Ref. 8) basiert. Dies erfordert oft spezielle Probenkammern 13,14 oder Matrizen, zB Agarose 7,15, in speziellen High-Cost-Mikroskopen implementiert. Als Alternative zu diesen Systemen eine vergleichsweise einfache Beleuchtungseinrichtung für SPIM wurde entwickelt und mit einem herkömmlichen inversen Mikroskop 16 (siehe Figur 1) angepaßt ist. Es besteht aus einem Laserstrahl auf einen Durchmesser von 8 mm durch eine Zylinderlinse (Fokuslänge: 50 mm, numerische Apertur: 0,08) erweitert und fokussiert, um einen Lichtschnitt von 6-10 um Dicke über eine Schärfentiefe von etwa 100 um . Proben werden in einer rechteckigen Kapillare mit 600-900 um Innendurchmesser vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet len ​​befindets für die Fluoreszenzdetektion. Diese Hauptmerkmale werden gegenwärtig abgeschlossen und durch die Verwendung von fortschrittlichen Mikrokapillare Ansätze zum Halten und zum Drehen der Proben, die synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtblatt (in axialer Richtung) und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion (identischen optischen Pfad eingesetzt optimiert Längen Verschiebung erfordern eine Korrektur der mechanischen Vorschub) und die Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von fluoreszierenden Farbstoffen, pharmazeutischen Wirkstoffen oder Arzneimitteln, damit die erforderliche Menge und Kosten zu minimieren.

<table><tbody><tr><td>Microtiter plate</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>For cell spheroid growing</td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>For cell spheroid growing</td></tr><tr><td>MCF-7 cell line</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td>Cell line</td></tr><tr><td>U251-MG-L106 cell line</td><td></td><td></td><td>Cell line</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>DMEM/Ham&#039;s F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>Cell culture supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA Laboratories&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P02-015</td><td>Antibiotic</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>E3024</td><td>Cell culture supplement</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D1515</td><td>Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Green cytotoxicity dye</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Capillary</td><td>VitroCom&amp;nbsp;</td><td>8260-050</td><td>Sample preparation</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD-camera</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD-camera</td></tr><tr><td>AxioVision data aquisition software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>version 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>Used with driver PDL800-B</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone tubes</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

Ein Modul für Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einem umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert, zB mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). SPIM Anregungsmodul Formen und lenkt das Licht, so dass die Probe durch einen Lichtschnitt senkrecht zur Detektion Gang des Mikroskops beleuchtet. Das System wird durch Verwendung einer rechteckigen Kapillare zur Aufnahme (und in einer erweiterten Version auch durch eine Mikrokapillare Ansatz zum Drehen) der Proben, durch synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtbogen und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion verwendet wird, sowie dadurch gekennzeichnet, durch Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen. Ein Protokoll für die Arbeit mit diesem System gegeben wird, und einige technische Details berichtet. Repräsentative Ergebnisse umfassen (1) Messungen der bisnehmen eines Zytostatikums (Doxorubicin) und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt, (2) Redox-Messungen unter Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor bei Zugabe eines Oxidationsmittels, und (3) die Einleitung und Kennzeichnung Zellnekrose auf Hemmung der mitochondrialen Atmungskette. Unterschiede und Vorteile der vorliegenden SPIM Modul im Vergleich mit bestehenden Systemen diskutiert.

Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert Ein Z-Stapel-Scan eines zuvor inkubiert MCF-7-Zell-Sphäroiden (8 uM Doxorubicin, 6 h) wird in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt ausführliche Informationen über die zelluläre Aufnahme und Verteilung von Doxorubicin 17 und seinem Abbauprodukt 18,19. In der äußeren Zellschicht der Sphäroid roten Fluoreszenz Doxorubicin wird hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, wäh...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden.

Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

9.7K Aufrufe.  Aalen University.  Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden. 

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-Chip-tomographischen Mikroskopie beschäftigt Multi-Angle-Beleuchtung und Super-Pixel-Auflösung

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Biochemie

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Immunologie und Infektion

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living cells in real time. In this protocol, we cover the fundamental steps to realize an iSCAT microscope and complement it with additional imaging channels to monitor the viability of a cell under study. Following this, we use the method for real-time detection of single proteins as they are secreted from a living cell which we demonstrate with an immortalized B-cell line (Laz388). Necessary steps concerning the preparation of microscope and sample as well as the analysis of the recorded data are discussed. The video protocol demonstrates that iSCAT microscopy offers a straightforward method to study secretion at the single-molecule level.

We present a protocol for the real-time optical detection of single unlabeled proteins as they are secreted from living cells. This is based on interferometric scattering (iSCAT) microscopy, which can be applied to a variety of different biological systems and configurations.

Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Ingenieurwesen

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Eine Anleitung zu einem stark geneigten bauen fegte Fliese Mikroskop für erweiterte Sichtfeld der Einzelmolekül-Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...