Name: using the overlay assay to qualitatively measure bacterial production of and sensitivity to pneumococcal bacteriocins
Uploaded: 2014-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
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This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.

1. Vorbereitung der Produzentenstammes <ol><li> Streak eine Pneumokokken-Stamm für Bakteriozin Produktion auf einem 5% Schafblut CASO-Agar Platte von -80 ° C Gefrierschrank Aktien getestet werden. HINWEIS: Die Verwendung von Blut-Platten für das anfängliche Wachstum des Stammes zu Inhibitionstest erhöht die Reproduzierbarkeit des Tests. Zusätzlich können andere nicht-Pneumokokken-Stämme, die Bakteriozine verwendet werden, obwohl die Wachstumsbedingungen müssen für einen bestimmten Organismus verändert werden. Wir haben Streptococcus mitis und Lactococcus lactis in der Overlay-Assay erfolgreich eingesetzt. </li><li> Inkubieren der Platte über Nacht (O / N) bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation des Produzentenstammes, bereiten Sie die CASO-Agar (TSA) Platte durch Pipettieren von 3.000 bis 4.000 Einheiten Katalase auf Platten mit 25 ml TSA und die Ausbreitung der Katalase-Lösung mit sterilen Glasperlen. Lassen Sie die Platte trocken für etwa 10 min untereinem biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> Sammeln Sie eine sichtbare Menge von Bakterien auf einer Pipettenspitze. Stechen die Pipettenspitze in die getrocknet TSA Platte. HINWEIS: Mehr als ein Produktionsstamm können in einem einzigen TSA Platte erstochen werden. Es ist wichtig, Raum aus, so dass die Stichverletzungen resultierenden Halos nicht überlappen. <ol><li> Wenn möglich, Bakteriozin Produzent bekannt als eine positive Kontrolle und der Stamm in der Überlagerung als Negativkontrolle verwendet werden. HINWEIS: Positive und negative Kontrollen sind zuvor veröffentlicht und sind auf Anfrage erhältlich 10. </li></ol></li><li> Inkubieren TSA-Platte, die mehrere Stichverletzungen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6 Stunden. </li></ol> 2. Erstellen Glycerol Stocks des Overlay Dehnungs <ol><li> Glycerin-Stammlösungen herzustellen (Kulturen mittleren exponentiellen Phase nach Zugabe von Glycerin gezüchtet und dann bei -80 ° C gelagert) vor dem Tag des Overlay-Assay. Impfen 5-10 Kolonien von Pneumokokken-strain für Empfindlichkeit oder Pheromon-Sekretion in Todd-Hewitt-Medium mit 0,5% Hefeextrakt (THY) getestet werden. HINWEIS: Der Bau der BLPC induzierbaren Reporter ist bereits beschrieben worden und 2 Stämme sind auf Anfrage erhältlich. </li><li> Mit 5 ml THY mit fest geschlossenen Deckel in einem 37 ° C Wasserbad inkubieren 5-10 Kolonien in Glasröhrchen ohne Schütteln. </li><li> Kulturen bei 37 ° C inkubieren, bis sie eine OD 620 zu erreichen von 0,3 bis 0,5. HINWEIS: Diese wird ca. 4-5 Stunden dauern, abhängig von der Belastung eingesetzt. <ol><li> Invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig ein paar Mal vor der Messung der OD. </li></ol></li><li> Wenn das Experiment kann nicht am selben Tag durchgeführt werden, oder die Belastung wird mehrfach in der Zukunft genutzt werden, stellen Glycerin Aktien und wieder den Versuch zu einem späteren Zeitpunkt. Für Glycerinstamm Fügen Glycerin Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 20%. Aliquoten Kulturen in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. HINWEIS: Die Proben können sMonate bei -80 ° C überwacht. Wenn nicht machen Glycerin Aktien, verwenden Proben direkt für Overlay-Assay. </li></ol> 3. Overlay Assay <ol><li> Kurz vor der Anwendung zu überlagern, mischen Sie die Overlay-Komponenten. In einem 15 ml konischen Röhrchen, 5 ml THY, 3.000-4.000 U Katalase und 200 ul der Overlay-Stamm Bouillonkultur, die entweder gewachsen war, wurde an diesem Tag oder ein Glycerin Lager der Kultur, die bei Raumtemperatur aufgetaut wurde. Bei Verwendung der Reporter-Stamm, werden 50 ul X-Gal (40 mg / ml) zu dem Überlagerungsmischung. Verwenden Sie eine konische Röhrchen pro Platte. </li><li> Äquilibrieren Overlay Mischung bei Raumtemperatur vor der Zugabe des geschmolzenen TSA. </li><li> Entfernen TSA-Platte mit erstochen Belastung von Inkubator. Schmelzen festen TSA in Mikrowelle und halten bei 55 ° C Wasserbad bis zur Verwendung. 3 ml geschmolzenem TSA mit 1,5% Agar und 55 ° C abgekühlt, um Mischung zu überlagern. <ol><li> Bereiten Sie die Overlay-Gemisch unmittelbar vor dem Pipettieren wird die Mischung beginnt zu sehr verfestigenschnell. HINWEIS: Wenn die Überlagerung beginnt vor Beschichtung verfestigt, werden die Ergebnisse nicht interpretierbar sein. </li></ol></li><li> Mischen Sie die Mischung durch Overlay-und Abpipettieren mehrmals mit einer 5 ml Pipette man aufpassen, nicht zu Blasen in die Mischung einführen. Langsam pipettieren Overlay Mischung direkt auf die Platte TSA erstochen. Halten Sie die Platte auf dem Labortisch für wenige Minuten und ermöglicht es der Agar zu verhärten. <ol><li> Die Platte, um die Overlay-Mischung verteilen nicht drehen, wird dieses Wachstum von der erstochen Kultur in den Überlagerungs ziehen. </li></ol></li><li> Vorsichtig TSA-Platte mit Overlay in 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 O / N (ca. 16-18 h). </li><li> Beachten Sie die Platten nach Wachstum über Nacht. Die Platten sollten nur in Bereichen, in denen die Hemmung oder Pheromonsignal aufgetreten undurchsichtig vom Wachstum des Overlay-Belastung angezeigt. Diese werden als entweder klar oder blau Zonen rund um den Stamm erscheinen erstochen auf. HINWEIS: Obwohl Messements der Durchmesser der blau oder Clearing zur quantitativen Beurteilung bestimmt werden kann, Unterschiede in der Durchmesser kann auch in Abhängigkeit von der Menge der Bakterien, die in die Platte gestochen wurde, abhängig. Die Overlay-Assay ist ein qualitativer Test, jede quantitative Bewertung sollte mit Vorsicht interpretiert werden. Jede sichtbare Lichtung im Vergleich zur Negativkontrolle wird als Aktivität angesehen. </li></ol>

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	<li>Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blp+bacteriocins+of+Streptococcus+pneumoniae+mediate+intraspecies+competition+both+in+vitro+and+in+vivo.">The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo.</a> Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).</li><li>Sawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+enterocin+W,+a+novel+two-peptide+lantibiotic+produced+by+Enterococcus+faecalis+NKR-4-1.">Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).</li><li>Kochan, T. 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J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion.">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).</li><li>Widdick, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+engineering+of+the+cinnamycin+biosynthetic+gene+cluster+from+Streptomyces+cinnamoneus+cinnamoneus+DSM+40005.">Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).</li><li>Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+two-peptide+lantibiotic,+lichenicidin,+following+rational+genome+mining+for+LanM+proteins.">Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das Overlay-Assay ist ein schneller Weg, um den Bereich der Tätigkeit für Bakteriozin Hersteller zu ermitteln und Wettbewerbs Wechselwirkungen, die unter Pneumokokken-Stämme auftreten können, zu demonstrieren. Die Overlay-Assay lässt sich an für das Screening mehrere Stämme für Bakteriozin Produktion auf einer einzigen Platte zu verwenden. Wir haben erfolgreich große Stammsammlungen mit diesem Test mit Hilfe eines 48-Pin-Replikator an SBA-Platten von einer Hälfte einer 96-Well-Platte zu impfen gescreent. Nach Inkubation über Nacht wird das Wachstum auf der Platte mit der TSA-Replikator und Durchstechen der Agar-Oberfläche der Platte mit den Stiften der Replikator übertragen. Andere bakteriell sezernierte antimikrobielle Peptide, die in einer Dichte abhängigen Weise wie Lantibiotica geregelt werden, können auch mit Hilfe der Overlay-Technik 7,12,13 untersucht werden. Dies ist besonders nützlich, wenn die Reinigung eines Bakteriocin oder Lantibiotika ist schwierig. Obwohl die Überstände können für antimikrobielle getestet werdenAktivität, ist Ausdruck der BLP abgeleitet Bacteriocine in Brühe sehr begrenzt oder gar nicht vorhanden (Daten nicht gezeigt). Die Overlay-Assay ermöglicht Wachstum zu einer höheren Dichte, die nicht erreicht wird, wenn Organismen in flüssiger gewachsen. Wachstum auf einem festen Medium kann auch genauer die in vivo-Wachstumsbedingungen des Nasopharynx reflektieren. Die Overlay-Assay kann auch verwendet werden, um die Fähigkeit des Stammes, die gestochen Bakteriocin spezifischen Signalisierungs Pheromon sezer untersuchen. Dies erfordert Konstruktion eines Reporter-Stamm, der die Pheromonrezeptor-Protein exprimiert und in der ein Pheromon ansprechenden Promotor stromaufwärts des lacZ-Gens angeordnet. Würdigung Pheromon-Sekretion durch ein gestochen Stamm ist besonders nützlich als eine Auslese von BLP-Locus-Aktivität, wenn die Belastung nicht stachen das Overlay Stammes zu hemmen. Die Unfähigkeit, die Overlay-Stamm hemmen könnte das Ergebnis eines nicht-funktionellen BLP-Locus (wie in einem Be-Stamm mit einem Transporter-Mutation), oder weil die Bacteriocine sezerniert sind nicht gegen die insbesondere Overlay-Stamm getestet aktiv. Die Reporterstamm Overlay bietet zusätzliche Informationen, dass der Ort in der Hersteller hat eine voll funktionsfähige Zwei-Komponenten-System und BlpA Transporter so dass für die Hochregulation und Sekretion des Pheromons. Dies bedeutet, dass alle codierten Bakteriozine auch sezerniert. Es gibt einige Einschränkungen bei diesem Assay. Die Overlay-Assay ist ein qualitativer Test, so Vergleiche zwischen der inhibitorische Aktivität oder Pheromon-Sekretion verschiedener Stämme müssen sorgfältig vorgenommen werden. Wachstumsraten und Bedingungen sollten beim Vergleich verschiedener Stämme, weil das Ergebnis des Tests stützt sich stark auf die Wachstumsrate des Overlay und stach Stämme werden. Die Zugabe von Katalase sowohl der Platte und der Überlagerung ist wichtig, um die hemmende Wirkung der Pneumokokken-H 2 O 2-Produktion auf die entfernenWachstum der Overlay-Stamm, insbesondere bei Verwendung von Katalase negativ Organismus in der Überlagerung. Angesichts der bekannten Vielfalt von genomischer Gehalt in der Pneumokokken-Population, einem inhibitorischen Aktivität diesen Test gesehen nicht automatisch in die BLP-Locus ohne Deletions-Analyse zurückzuführen.

Streptococcus pneumoniae, eine gemeinsame Kolonisator des polymikrobiellen Gemeinschaft des Nasenrachenraums, ist in der Lage, mit anderen Pneumokokken und eng verwandten Arten durch die Produktion von bakteriell produzierten antimikrobiellen Peptide (Bacteriocine) konkurrieren. Jeder vollständig sequenzierten Pneumokokken-Stamm bis heute untersucht enthält eine Version des b acteriocin- l ike p eptide Ort, BLP. Bacteriocin-Produktion durch Pneumokokken nachgewiesen wurde im Ergebnis der in vitro und in vivo Konkurrenz 1-4 wichtig. Wettbewerbsdynamik werden durch die Expression von verschiedenen Bakteriozine zusammen mit verwandten Proteinen Immunität in Reaktion auf eine spezifische Peptid-Pheromon beeinflusst. Induktion der BLP-Locus durch ein Quorum Sensing System, bei dem ein Peptid-Pheromon, BLPC, bindet an das Sensorkinase, BlpH gesteuert und löst eine Signalkaskade, was zu derTranskription des BLP Locus 5,6. Es gibt vier allelische Variationen BLPC dass jede Bindung an seinen zugehörigen BlpH 6. Für die Zelle, die Auswirkungen seiner eigenen Bakteriocin überleben, werden die Gene, die Proteine ​​kodieren verwandten Immunität auf der gleichen Operon wie jede der Bakteriocin-Genen transkribiert. Tötung tritt auf, wenn ein Teilnehmer-Stamm ist nicht in der Lage, die BLP-Locus in Antwort auf exogene Pheromon hochregulieren oder, wenn der Stamm fehlt die spezifische Immunität Gen zum Schutz benötigt. Der Transporter-Komplex, BlpAB ist für die Sekretion und Prozessierung des Peptids Pheromon und Bakteriocin-Peptide 2,4 erforderlich. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein signifikanter Anteil der Pneumokokken-Stämme &quot;Betrüger&quot; bedeutet, dass sie eine Mutation im konservierten blpA Gen, das sie nicht in der Lage Pheromone und Bakteriozine 1,2 sezer macht haben. Diese Stämme sind in der Lage, auf exogene BLPC 2 durch Wiehern sezerniert reagierenBohren Stämme so dass für die Herstellung von Proteinen Immunität. Obwohl rohe Zubereitungen von Bakteriozine aus Überständen aus Produktionsstämme mit biochemischen Methoden vor, um Reinheit zu erzielen, hergestellt werden, ist dieser Ansatz nicht nützlich für das Screening von großen Sammlungen von Isolaten und wenn der Pegel des Bakteriocin Expression niedrig in Brühe gewachsenen Kulturen 2,7 9. Die Overlay-Assay ist als schnelle Möglichkeit, die Wettbewerbsdynamik zwischen den Stämmen, die in vitro zu untersuchen existieren können verwendet. Um dies zu tun, ist eine Pneumokokken-Stamm vorgeimpft auf einer Agar-Platte und erlaubt, zu wachsen, um lokale Bakterienkonzentrationen ausreichend für die Induktion des BLP Ort zu erreichen. Ein zweiter Stamm wird dann in einem geschmolzenen weichen Agar-Lösung, die dann über die vorgeimpft Stamm zur Empfindlichkeitstest wird angewendet, inokuliert. Um die Aktivität der BLP-Locus (unabhängig von der Inhibitoraktivität) zu bewerten, können Stämme mit einer Reihe von th lagert werdenree zuvor beschriebenen BLPC Reporter-Stämme. Diese Stämme wurden konstruiert, um eine von drei verschiedenen blpH Allele, die zu den drei häufigsten BLPC Pheromone vom Pneumokokken sezerniert antworten enthalten. Die Reporterstämme haben einen integrierten lacZ-Gen, das unter der Kontrolle eines BlpH abhängigen Promotor ist und tragen eine Deletion im Gen, das BLPC Selbststimulation 10,11 verhindert.

<table><tbody><tr><td>Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>Fisher</td><td>B21261X</td><td>For growth from freezer cultures</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C100-500mg</td><td>4,741 Units per plate</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY)</td><td>Fisher</td><td>DF0492-17-6&amp;nbsp;</td><td>30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O autoclave</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA)</td><td>Fisher</td><td>B11768&amp;nbsp;</td><td>30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O autoclave</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside (X-gal)</td><td>Sigma</td><td>B4252-50MG</td><td>Dissolve in dimethylformamide</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophometer</td><td></td><td></td><td>Measures the OD&lt;sub&gt;620&lt;/sub&gt; of cultures</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C incubator with 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

using the overlay assay to qualitatively measure bacterial production of and sensitivity to pneumococcal bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Es gibt zwei mögliche Ergebnisse in der Overlay-Assay. Es sollte möglich sein, das Wachstum des Stammes erstochen nach Inkubation über Nacht zu sehen. In 1A ist die Overlay-Stamm empfindlich für die Bakteriocine produziert. Ein Freiraum visualisiert die Belastung erstochen Umgebung werden. Zusätzlich ist Verwirbelung der gestochen Belastung in den Überlagerungsmischung möglich ist und in der Figur 1A zu sehen ist. In 1B ist die Overlay-Stamm immun gegen die Bakteriozine sezerniert, wie durch das Fehlen von einem Halo um das stab angegeben. Es ist auch möglich, dass der Stamm nicht stachen sezer Bakteriozine. Für die Signalisierung Assay zwei verschiedene Ergebnisse möglich. Die gestochen Stamm in der Lage ist, das Pheromon mit der Histidin-Kinase des Overlay-Stamm zusammenwirkt, wie durch den Abbau von X-gal zu sehen, wie in 2A gezeigt, zu sezernieren. Wenn das Pheromon nicht die Transkription aktivierenBLP-Locus in dem Reporter-Stamm, oder wenn die Belastung nicht stachen sezer Pheromon, Ausfall von X-gal nicht auftreten wird, wie in 2B gezeigt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51876/51876fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Aussehen von BLP vermittelte Hemmung und Immunität in einem Overlay-Assay. (A) Der Stamm P133, ein Bakteriozin Produzent wurde in ein TSA Platte versetzt und für 6 Stunden wachsen. Stamm P250, ein Bakteriozin negativen Stamm wurde in den Überlagerungs geimpft. Platten wurden nach O / N Inkubation fotografiert. Ein Freiraum wird durch den Pfeil angezeigt. (B) Dehnungs P133 wurde in ein TSA Platte versetzt und für 6 Stunden inkubiert. Stamm 130, enthält eine Frameshift-Mutation in blpA, wurde in das Overlay eingeimpft. Nach O / N Inkubation wurden die Platten fotografiert. Abbildung 2. Pheromone vermittelte Aktivierung von BLP Locus in Signalisierungstest. (A) Der Stamm P133, ein BLPC Typ R6 Sekretor, wurde in ein TSA Platte versetzt und für 6 Stunden inkubiert. Stamm P981, ein BLPC Typ R6-Reporter mit einer Deletion in BLPC, wurde in das Overlay eingeimpft. Fotografien wurden nach O / N Inkubation genommen. (B) P133 wurde in ein TSA Platte versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 6 Stunden, P845, P164 ein BLPC Typ Reporter mit einer Deletion in BLPC, wurde in das Overlay eingeimpft. Fotografien wurden nach O / N Wachstum gemacht.

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Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Aufrufe.  University of Michigan. Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.  Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. 

Serie: Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Forschung

Genetik

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Immunologie und Infektion

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Latente Growth Inhibition Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Bakterien abgeleitete Antimikrobielle auf Wettbewerb

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Zusammenfassung

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