Diese Arbeit wurde durch das BMBF Forschungsinitiative unterstützt &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für sterben nutzung von Biomasse&quot; und der Exzellenzcluster &quot;Maßgeschneiderte Kraftstoffe aus Biomasse&quot;, die durch die Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder gefördert wird, die Wissenschaft zu fördern und Forschung an deutschen Hochschulen.

1. Wachstum von Wildtyp N. tabacum Pflanzen <ol><li> Um N. wachsen tabacum L. cv. Petit Havana SR1 Pflanzen auf Erde, legen Tabaksamen über geeignete Töpfe mit normaler Blumenerde für die Keimung gefüllt. Nach 2 Wochen übertragen Sämlinge auf einzelne Töpfe. Inkubieren Pflanzen in einem Gewächshaus mit konstanten 22 ° C (dunkle Zeit) bzw. 25 ° C (Lichtperiode) und die relative Luftfeuchte 70%. Geben Beleuchtung in einem 16/8 h Licht / Dunkel-Zyklus (zB Philips IP65 400 W-Lampen, 180 mmol · s -1 · m -2; λ = 400-700 nm) und Wasser täglich. </li></ol> 2. Transiente Expression von TrCel5A und TrCel5A-Proteine ​​mCherry <ol><li> Unter sterilen Bedingungen, nehmen einzelne Kolonien von Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK GMR, KmR, RifR), die entweder pTRAkc-ER-TrCel5A oder pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry und Transfer zu einem Erlenmeyerkolben mit 10 ml HefeextraktBrühe (YEB, nach Herstellerangaben hergestellt) Medium und Kanamycin (50 mg / ml), Rifampicin (50 mg / ml) und Carbenicillin (100 mg / ml) für die Selektion. Inkubation für 36-40 Stunden bei 26 ° C und 180 UpM. Hinweis: Die Gestaltung geeigneter Konstrukte für die Proteinexpression ist außerhalb des Geltungsbereichs dieses Papier, sondern zur Orientierung, können die Verfahren der Maclean et al 13 und Munro und Pellham 14 für Konstrukt Design folgen.. </li><li> Nehmen Sie 200 &amp;mgr; l jeder Kultur zu 20 ml YEB mit den oben genannten Konzentrationen an Antibiotikum zu inokulieren und Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. </li><li> Nach 36-40 h preinduce die Kulturen durch Zugabe von 2 &amp;mgr; l Acetosyringon (200 &amp;mgr; M Endkonzentration), 100 &amp;mgr; l 40% (w / v) Glucoselösung und 200 &amp;mgr; l 1 M MES-Puffer pH 5,6. Inkubieren über Nacht. </li><li> Es werden 100 ml einer Infiltration 2x Puffer (100 g / l Saccharose, 3,6 g / l Glucose, 8,6 g / l Murashige und Skoog-Basalsalze, PH-Wert auf 5,6 mit Kaliumhydroxid). </li><li> Messen OD 600 der Kulturen mit 1.05 Verdünnungen bis eine OD 600 von 5-6 erreicht. Berechnen Kulturvolumen von 30 ml Infiltrationsmedium benötigt bei OD 600. 15 ml 2x Infiltration Puffer, dann fügen deionisiertem H 2 O, um den Puffer auf 30 ml zu machen. </li><li> Nehmen Sie Pflanzen aus Gewächshaus und eine Pipettenspitze verwenden, um den nick abaxial Seite der 3. bis 5. Blatt von oben, um die Infiltration zu erleichtern. </li><li> Verwenden Sie eine Pipettenspitze nick die unterseits der Blätter, um die Infiltration zu erleichtern. </li><li> Füllen Sie eine Spritze mit Infiltrationsmedium und legen Sie sie (ohne Nadel) auf einem der bisherigen Nicks. Unterstützen Spritze mit einem Finger auf dem adaxial Blatt Seite. Drücken Sie das Medium vorsichtig in das Gewebe zwischen den Blattblattzonen. Anmerkung: Nach der Infiltration pflegen Pflanzen im Gewächshaus unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Auch pflegen einen gleichen Anteil von untreated, nicht-transiente Expressionspflanzen (NTEPs) als Kontrollen, unter den gleichen Bedingungen wie infiltrierten Pflanzen. </li></ol> 3. Beurteilung der TrCel5A-mCherry Expression in Pflanzenblätter <ol><li> Nach 4-6 Tagen nehmen Pflanzen mit A. infiltriert tumefaciens enthält pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry aus dem Gewächshaus und legen Sie sie in einem dunklen Raum für die Fluoreszenzanalyse. </li><li> Um die Fluoreszenz in Blattstücke ausdrücken TrCel5A-mCherry, Lichtanlagen mit einem tragbaren Lichtquelle, die grünes Licht bei 515 nm mit einem roten Filter (620-750 nm) zu visualisieren. Hinweis: In Tiefe Charakterisierung von Protein-Expression in den Pflanzenblättern durch Dünnschnitt Blätter mit einem Vibratom und Prüfung unter Licht-und Fluoreszenzmikroskopie erreicht werden. Dazu gehen Sie folgendermaßen vor: <ol><li> Schneiden kleine Abschnitte von ca. 5 x 5 mm Größe aus einer infiltrierten Blatt und betten sie in 4% Agarose in 50 mM Phosphatpuffer gelöst (pH 5,7). </li><li> CutAbschnitt von 80-90 um der Größe von Embedded-Blätter mit einem Vibratom. Legen sie auf einen Objektträger, Deckel mit Puffer oder ein Deckglas und untersuchen sie mit einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzdetektor unter Verwendung der gleichen Wellenlänge und Filter oben angegeben. </li></ol></li></ol> 4. TrCel5A Extraktion aus Tabakblättern <ol><li> Schneiden Sie Stücke aus Tabakblättern zu einem ungefähren Gewicht von 1 g aus Pflanzen mit A. infiziert tumefaciens enthält pTRAkc-ER-TrCel5A und in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt. Hinzufügen einer geeigneten Menge von flüssigem Stickstoff auf den Proben. Grind Blätter zu Pulver mit Hilfe eines vorgekühlten Stößel. </li><li> 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid auf den Boden Blatt Materie und mischen, bis die Mehrheit der Blatt Materie in Suspension. Zentrifuge Extrakt bei 15.000 × g für 20 min bei 4 ° C an, um Protein-haltige Überstand. </li><li> Centrifuge der Extrakt bei 15.000 g für 20 min bei 4 ° C und nehmen proteinhaltigen Überstand man aufpassen, nicht, um das Pellet zu stören. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Teilweise zu reinigen TrCel5A durch Inkubation der proteinhaltigen Überstands bei 55 ° C für 10 min. Bei Raumtemperatur für weitere 10 min ruhen, dann Zentrifugieren bei 15.000 xg für 10 min bei RT. Wiederholen Teilreinigungsverfahren für nicht-infiltrierten Pflanzen zu Kontrollproben zu erhalten. Mit diesen Proben für alle folgenden Versuche. Achtung: Die Proteinlösungen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden. </li><li> Wiederholen Sie die Teilreinigungsverfahren für nicht-infiltrierten Pflanzen zu Kontrollproben zu erhalten. Mit diesen Proben für alle folgenden Versuche. Achtung: Die Proteinlösungen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden. </li></ol> 5. SDS-PAGE, Western Blot und Azo-Zymographie von CMC TrCel5A-mCherry &lt;/ P&gt; <ol><li> Kauf oder bereiten 12% (w / v) SDS-PAGE-Gelen nach etablierten Methoden 15. </li><li> CMC in Wasser auflösen, um eine 1,5% (w / v) Lösung zu erhalten. CMC-SDS-PAGE-Gelen zu machen, ersetzen 1 ml 1,5% CMC zu 1 ml Wasser in einem 10 ml SDS-PAGE-Gel-Mix-Lösung, was zu einer 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE-Gel-Mix. Gießen Gel normal. Hinweis: Sicherstellen, dass die CMC in der ursprünglichen Lösung ist vollständig durch eine Kombination von Rühren und Erwärmen auf 40 ° C gelöst (Wiederholung direkt vor der Herstellung der Gel-Lösung). </li><li> Denaturieren Proben durch Kochen in Gegenwart von SDS, nach etablierten Methoden 12. Als positive Kontrolle, verwenden Sie eine 1:500-Verdünnung eines kommerziell erhältlichen Cellulase Mischung aus T. reesei, wie T. reesei ATCC 26921. Als Negativkontrolle mit einem ähnlich hergestellten Proteinlösung aus nicht-infiltrierten Blätter (NTEPs). </li><li> Führen Sie die Elektrophorese wie für normale Protokolle 15,zB verwenden, 200 V für ~ 50 min mit der Elektrophorese gestoppt, sobald der Farbstofffront das Ende des Gels erreicht. </li><li> Fleck eine SDS-PAGE-Gel unter Verwendung von 0,1% (w / v) Coomassie-Brilliantblau und Entfärbung unter Verwendung eines Methanol / Eisessig-Gemisch. Hinweis: Schnellfärbung und Entfärbung kann durch leichtes Erwärmen der Färbung und Entfärbung Lösungen, dh durch Verwendung einer Mikrowelle für ~ 15 Sek. erwärmen (aber nicht kochen) zunächst die Färbung und dann die Entfärbung Lösungen, die Änderung der Entfärbelösung nach 10 Minuten durchgeführt werden oder wenn sie abgekühlt, und wiederholen Sie mit neuen Entfärbelösung. </li><li> Führen eines Western-Blotting SDS-PAGE-Gel unter Verwendung etablierter Protokolle 16,17. Mit den folgenden Antikörpern: ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen ein His-tag (primären) und einem polyklonalen Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper-Fc-Region, die zu einer alkalischen Phosphatase (sekundäre) konjugiert wurde. Hinweis: Sekundärantikörper sollten ausgewählt werden, um Visualisierung mit Nitro Tetrazol ermöglichenium chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;-p-indolyphosphate Toluidinsalz (NBT / BCIP), wie beschrieben 18. </li><li> Führen in-Gel-Protein-Rückfaltungs auf 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-Gel, das durch Inkubation des Gels in 1,5% (w / v) β-Cyclodextrin, 20 mM Phosphat-Citrat-Puffer, pH 6,5, bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln 15 min 19. </li><li> Entsorgen Sie die β-Cyclodextrin-Lösung und kurz waschen das Gel mit H 2 O. Inkubieren bei Raumtemperatur in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,8) für 15 min. Führen CMC-Zymographie unter Verwendung des rückgefalteten 0,15% CMC SDS-PAGE-Gel durch Inkubation des Gels in 30 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,8 für 20 min bei 50 ° C. </li><li> Führen CMC-Zymographie unter Verwendung des rückgefalteten 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-Gel durch Inkubation des Gels in 30 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,8) für 20 min bei 50 ° C. </li><li> Färben Sie das Gel für 10 min mit einer 0,1% w / v Kongo rote Lösung entfärben und für 30 Minuten oder bis klar Bänder werden mit 1 M Na beobachtetCl. Mit 0,3% (v / v) Essigsäure für klarere Abbildungs ​​Waschen des Gels. </li></ol> 6. 4-MUC Aktivitätstest von TrCel5A <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM 4-MUC in 50% (v / v) Methanol, und speichern sie in der Dunkelheit bei RT </li><li> Unmittelbar vor dem Test, bereiten ein 4-MUC 2x Arbeitslösung von 1 mM 4-MUC zusammengesetzt und 60 mM Natriumacetat, pH 4,8. </li><li> Diese Prüfung auf Proben mit 100 ul Protein-Blatt (mit oder ohne TrCel5A induzierbar exprimiert), 100 &amp;mgr; l einer im Handel erhältlichen Mischung aus Cellulase T. reesei 1:1.000 und reinem H 2 O auf. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Je 100 ul der 4-MUC-Arbeitslösung in einzelne Wells einer 96-Well-Platte, dann fügen Sie 100 ul jeder Probe. </li><li> Bestimmen Zeitpunkt 0 min von 4-MU-Fluoreszenz durch Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm auf. </li><li> Inkubation erfolgt während 20min bei 50 ° C, mit Klebstoff Deckel abgedeckt, um Verdampfung zu verhindern. Stoppen der Reaktion durch Einfrieren (oder durch Kombinieren von 100 &amp;mgr; l 0,15 M Glycin, pH 10,0, und 100 ul der Probe in einer separaten Platte). </li><li> Bestimmen den Endpunkt der 4-MU-Fluoreszenz durch Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm auf. Subtrahieren von 0 min Endpunkt (20 min) Zeitpunkt, um die Änderung in der Fluoreszenzwerte zu erhalten. </li></ol> 7. Azo-Carboxymethyl Cellulose Aktivitätstest von TrCel5A <ol><li> Bereiten Sie einen Bestand von 1,5% (w / v) Azo-CMC, die bei Raumtemperatur gelagert wird, und eine Fällungslösung mit 18 mM Zink-Acetat, 0,5 M Natriumacetat, pH 5 und 80% Ethanol (v / v), bei Zimmer Temperatur. </li><li> Unmittelbar vor dem Assay Vorbereiten eines Azo-CMC 2x Arbeitslösung, bestehend aus 1% (w / v) Azo-CMC (in H 2 O) und 60 mM Natriumacetat, pH 4,8. </li><li> Kombinieren 50 ul Probe und 50 ul des Arbeitsten Lösung in 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Testproben, die 50 ul Blatt Protein (mit oder ohne TrCel5A transient exprimiert); 100 &amp;mgr; l eines handelsüblichen Cellulase-Mischung aus T. reesei verdünnt 1:1000; und reinem H 2 O. Führen Proben und Standards in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Proben für 20 min Inkubation bei 50 ° C. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 250 ul Fällungslösung. Vortex jede Probe kräftig für 10 Sekunden, um sicherzustellen, Lösungen wurden vollständig zusammen. </li><li> Proben Inkubation bei RT für 10 min und dann wieder Wirbel. Zentrifuge Proben bei 1000 g für 10 min. Entfernen 200 ul jeder Probe Überstand auf eine 96-Well-Platte, kümmert sich nicht um das Pellet zu stören. </li><li> Assay unter Verwendung von Absorptionsspektroskopie bei einer Wellenlänge von 590 nm aufweist. </li></ol> 8. PAHBAH Test der TrCel5A <ol><li> Verwenden Sie einen Locher, um einen Kreis (~ Durchmesser 5,5 mm) aus Filterpapier geschnitten. 100 l 60 mM NaAc, pH 4,8 und 100 ul-Proben, enthaltend entweder Blatt-Protein (mit oder ohne TrCel5A induzierbar exprimiert) oder eine kommerzielle T. reesei Cellulase Mischung 1:1000 verdünnt, und Inkubation mit Filterpapier Kreise für 20 Stunden bei 50 ° C mit 300 rpm schütteln. Für jede Probe mit Filterpapier inkubiert, auch inkubieren eine doppelte Lösung ohne Filterpapier als individuelle Probe-Kontrollen. </li><li> Vorbereitung einer 330 mM p-Hydroxybenzoesäure (PAHBAH) Lösung A durch Auflösen PAHBAH in H 2 O unter Zugabe von 5 ml konzentrierter HCl für insgesamt 100 ml Lösung, und Lagern bei RT. Hinweis: Die besten Ergebnisse werden durch Zugabe von HCl auf einen kleineren Volumen PAHBAH Aufschlämmung, dh 30 ml, der unter Temperatur gerührt wird, um die Auflösung, bevor das Volumen auf 100 ml mit H 2 O gelöst helfen </li><li> Bereiten PAHBAH Lösung B, die 50 mM Natriumcitrat, 10 mM Calciumchlorid und 500 mM NaOH und lagern bei RT. </li><li> Immediately vor dem Test, bereiten eine 1,5 x Arbeitslösung von 1 ml PAHBAH Reagenz zu 9 ml Pufferlösung auf Eis aufbewahren bis zur Verwendung (innerhalb von 4 Stunden verwendet werden). </li><li> Bereiten Proben in thermo 0,2 oder 0,5-ml-Röhrchen. Kombinieren 5 ul jeder Lösung mit Filterpapier (Schritt 8.1), 45 ul H &amp;sub2; O und 100 ul PAHBAH Arbeitslösung inkubiert. Probenkontrollen (Proben ohne Filterpapier inkubiert) sollte unter den gleichen Konzentrationen (5 ul Probe, 45 ul H 2 O, 100 ul PAHBAH Arbeitslösung) ausgeführt werden. Auch testen 5 Standards (5 ul), die zwischen 0 und 0,2 g / l Glucose und reinem H 2 O. Führen Proben und Standards in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Proben inkubieren genau 10 min bei 100 ° C, dann bei RT abkühlen genau 10 min. Pipette Lösungen in eine 96-Well-Platte und Assay-spektroskopisch bei einer Wellenlänge von 410 nm aufweist. Subtrahieren Sie einzelne Probe-Kontrollen (ohne Filterpapier inkubiert) aus Proben endgültig zu erhaltenWerte. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Rekombinante Expression von Cellulasen ist ein Feld von großem Interesse, auf den Wunsch nach effizienteren Produktion von Biokraftstoffen Systeme ein. Pflanzen bieten viele Möglichkeiten für eine erfolgreiche Cellulaseproduktion, mit Funktionen wie wirtschaftliche Erntetechniken und Methoden Autohydrolyse sehr wünschenswerte Eigenschaften für eine groß angelegte Produktion von Biokraftstoffen. Ferner ist die Verwendung von verschiedenen Lokalisierungen zur Herstellung von Proteinen erlauben, falls erfo...

<html> Der Abbau von Lignocellulose-Biomasse und deren Umwandlung in flüssigen Kraftstoff als ein Verfahren, um die Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen verringern vorgestellt worden. Eine wesentliche Hürde bei der Gründung wirtschaftlich machbar Biomasse Verarbeitungssysteme ist in den enzymatischen Abbau von Cellulose und Hemicellulose ein. Pflanzenexpressionssystemen zeigen großes Potenzial für die Produktion von Enzymen im industriellen Maßstab. Landwirtschaftliche Anlagen bis zur Ernte Pflanzen wirtschaftlich und Volumen bereits etabliert sind, wie sie seit Tausenden von Jahren. Die Produktion von Cellulasen in Pflanzen aufgrund von Faktoren wie die Leichtigkeit der Autohydrolyse 2, und das Potential für die Maximierung der Verwendung von geringeren Enzymmengen durch die Erhöhung der Verdaulichkeit von Pflanzenzellwänden 1 wünschenswert. Schließlich Anlagensysteme ermöglichen die Ausrichtung von rekombinanten Proteinen, um bestimmte Bereiche von Pflanzenzellen und sind in der Lage, Enzyme posttranslational wo erforderlich 3 ändern. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (Tabak) ist sehr häufig als Modellorganismus für die heterologe Proteinexpressionsstudien in Pflanzen verwendet wird, durch sein schnelles Wachstum und Biomasseakkumulation verfügt über 4. Transiente Expression von rekombinanten Proteinen ist eine Technik, die die Proteinproduktion können in kurzen Zeitperioden 5, wobei die Flexibilität in Bezug auf die Lokalisierung und somit posttranslationale Modifikationen der Proteine ​​ausgewählt, dh Cellulasen. Dies ermöglicht die Herstellung der Cellulase (n) für die Grundlagenanalyse, aber auch die Grundlagen für weitere Expressionsstrategien in Pflanzen. Unter Verwendung eines solchen transienten Expressionsstrategie ist eine Endoglucanase aus Glykosylhydrolase Familie 5, Cel5A von der Pilzwirts Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) abgeleitet 6 hergestellt (nachstehend als TrCel5A bezeichnet). TrCel5A ist ein 42 kDa Protein, das nativ glykosyliert ist und in hyd hochaktivenroylzing Celluloseketten 7. Die transiente Expression Technik hier beschrieben wird, auf einem relativ häufigsten verwendete System basiert, Infiltrieren des Pflanzenblätter mit Agrobakterien, die das Gen von Interesse in einen geeigneten Expressionsvektor. Um für eine schnelle Analyse der in planta Ausdruck erfolgreich zu ermöglichen, können TrCel5A auch als Fusionsprotein mit mCherry, einer monomeren fluoreszierenden Protein ursprünglich aus Discosoma sp ausgedrückt werden. Protein DsRed 8, mit weiteren sechs Histidin-Reste (His-Tag) fusioniert der C-Terminus (TrCel5A-mCherry). Expression der heterologen Fusionsprotein, TrCel5A-mCherry, kann somit innerhalb der wachsenden Pflanze durch Verwendung von grünem Licht zu untersuchen mCherry Verbreitung überwacht werden. Wenn gewünscht, kann Dünnschnitte des Pflanzenmaterials unter grünem Licht mikroskopisch untersucht werden, um die spezifische Lokalisation des Proteins zu etablieren. Für diese Arbeit, Signal-und Übersitzen Peptide wurden in das Konstrukt eingebracht, um das heterologe Protein den Export nach dem endoplasmatischen Retikulum 9 lokalisieren. Zur Analyse der Aktivität der Pflanze exprimiert Cellulasen, einschließlich TrCel5A eine Anzahl von Cellulase-Aktivitätstests ausgeführt werden kann. Nach der Extraktion der gesamten löslichen Pflanzenproteinen, kann TrCel5A teilweise unter Verwendung eines thermischen Inkubation Technik gereinigt werden. Proteingröße wird mit SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot etabliert. Zymographie kann verwendet werden, um die Aktivität gegen Gründen, z. B. Zellulose, die seit Carboxy-methylierte hat zu analysieren (was Carboxymethylcellulose: CMC) für die Löslichkeit 10. Cellulase und Glucosidase-Aktivität kann mit dem Fluorophor 4-Methylumbelliferyl-(4-MU) mit β-D-cellobiosid assoziiert (4-MUC kombiniert) überwacht werden. Ein weiteres Verfahren zur Endoglucanase-Aktivität zu beurteilen beinhaltet die spektrometrische Analyse der CMC, die mit einer Azo-d zugeordnet worden istihr (Remazolbrilliant Blue R) 11. Darüber hinaus können Protein-Aktivität beider Endoglucanasen und eine Reihe von Cellulasen, die durch die Verwendung einer Zuckeranalyse Test, wie der p-Hydroxybenzoesäure (PAHBAH) Test 12 überwacht werden. Diese Techniken können verwendet werden, um aufzuklären und Quantifizierung der Aktivität des exprimierten Cellulase von Interesse sein.

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferyl &amp;beta;-D-cellobioside</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon (concentrated)</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - kanamycin</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - rifampicin</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic - carbenicillin</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-carboxymethyl cellulose</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase from &lt;em&gt;Trichoderma reesei&lt;/em&gt; ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>Congo red</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie brilliant blue G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper - Rotilabo blotting paper</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecylsulfate</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>Soil, Einheitserde classic&amp;nbsp;</td><td>PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer - Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy benzhydrazide&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>UV light source - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

Zellulose abbauende Enzyme, Cellulasen, sind Ziele der Forschung und industriellen Interessen. Das Übergewicht dieser Enzyme in schwer Kulturorganismen wie Hyphen bild Pilze und anaeroben Bakterien, ist die Verwendung von rekombinanten Technologien in diesem Bereich beschleunigt. Pflanzenexpressionsverfahren sind ein wünschenswertes System zur großtechnischen Herstellung von Enzymen und anderen industriell nützlichen Proteinen. Hierin sind Verfahren für die transiente Expression eines Pilz-Endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum demonstriert. Erfolgreiche Proteinexpression angezeigt wird, durch Fluoreszenz mit einem mCherry-Enzym-Fusionsproteins überwacht. Zusätzlich ist ein Satz von Basistests werden verwendet, um die Aktivität von transient exprimierten T. prüfen reesei Cel5A, einschließlich SDS-PAGE, Western Blot, Zymographie, wie Fluoreszenz-und farbstoffbasierten Substratabbau Assays. Das hier beschriebene System kann auf eine aktive Zelle verwendet werdenULASE in einer kurzen Zeitperiode, um so das Potential für die weitere Produktion in Pflanzen durch konstitutive oder induzierbare Expressionssysteme zu beurteilen.

TrCel5A und TrCel5A-mCherry wurden erfolgreich in Tabakpflanzen unter Verwendung des transienten Expressionssystem (1A und 1B) ausgedrückt. Die Untersuchung der Expressionsmuster des TrCel5A mCherry-Fusionsprotein zeigte gesunde Blätter (1C), die weit verbreiteten Proteinexpression unter grünen Licht (1D) zeigte. Extraktion der gesamten löslichen Proteine ​​wurden auf Tabakpflanzen, die Blätter, die enthalten waren ...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert.

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In Tabakpflanzen

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.8K Aufrufe.  RWTH Aachen University.  Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert. 

Serie: Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Umwelt

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biochemie

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Biotechnik

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Chemie

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biologie

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A

Zusammenfassung

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Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Optimierung und Nutzung von

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A

Zusammenfassung

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Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Optimierung und Nutzung von

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme