1. Herstellung des Gels <ol><li> Abwiegen die entsprechende Masse an Agarose in einen Erlenmeyerkolben. Agarosegele werden unter Verwendung von w / v Prozentsatz Lösung. Die Konzentration der Agarose in einem Gel wird auf der Größe der DNA-Fragmente abhängen, getrennt, wobei die meisten Gele im Bereich zwischen 0,5% -2% beträgt. Das Volumen des Puffers sollte nicht größer sein als 1/3 der Kapazität des Kolbens. </li><li> In Laufpuffer der Agarose-enthaltenden Flasche. Schwenken Sie zum Vermischen. Die häufigste Gel Laufpuffer sind TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) und TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA). </li><li> Schmelzen Sie die Agarose / Puffer-Mischung. Dies wird am häufigsten durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen durchgeführt, kann aber auch über einen Bunsenbrenner durchgeführt werden. Bei 30 s-Intervallen, entfernen Sie den Kolben und schwenken, um den Inhalt gut mischen. Wiederholen, bis die Agarose vollständig gelöst hat. </li><li> In Ethidiumbromid (EtBr) auf eine Konzentration von 0,5 mg / ml. Alternativ kann das Gel auch nach elektro gefärbt werdenphorese in Laufpuffer enthält 0,5 mg / ml EtBr für 15-30 min, von Entfärben in Laufpuffer für eine gleich lange Zeit an. </li></ol> Hinweis: EtBr ist im Verdacht, krebserzeugend und müssen fachgerecht pro Institution Vorschriften entsorgt werden. Handschuhe sollten immer getragen beim Umgang mit EtBr-Gele werden. Alternative Farbstoffe für die Färbung von DNA zur Verfügung, jedoch EtBr bleibt die beliebteste aufgrund seiner Empfindlichkeit und Kosten. <ol start="5"><li> Lassen Sie die Agarose, um entweder auf dem Labortisch oder durch Inkubation in einem 65 ° C warmes Wasserbad abkühlen. Andernfalls wird verziehen den Gelträger. </li><li> Setzen Sie den Gelträger in die Gießvorrichtung. Alternativ kann man auch kleben die offenen Kanten eines Gelträger, um eine Form zu erzeugen. Setzen Sie einen geeigneten Kamm in das Gel Form, um die Brunnen zu schaffen. </li><li> Gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Gelform. Lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur eingestellt. Nehmen Sie den Kamm und legen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer. Alternativ kann die gel kann auch in Folie eingewickelt und bei 4 ° C bis zur Verwendung (1). </li></ol> 2. Einrichten von Gel-Apparatur und Trennung von DNA-Fragmenten <ol><li> In Ladepuffer zu den DNA-Proben zu trennen (Abb. 2). Gel Ladungsfarbstoff wird typischerweise bei 6X Konzentration (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol, 30% Glycerin) hergestellt. Lädt Farbstoff hilft Ihnen wieder, wie weit Ihre DNA-Probe gereist, und ermöglicht auch die Probe in das Gel zu versenken. </li><li> Programm die Stromversorgung gewünschte Spannung (1-5V/cm zwischen den Elektroden). </li><li> In genug läuft, Puffer, um die Oberfläche des Gels bestimmt. Es ist wichtig, um die gleiche Laufpuffer wie die zur Herstellung des Gels verwendet. </li><li> Befestigen Sie die Kabel des Gel-Box an die Stromversorgung. Schalten Sie die Stromversorgung und stellen Sie sicher, dass sowohl Gel Box und Stromversorgung arbeiten. </li><li> Nehmen Sie den Deckel. Langsamund sorgfältig zu laden die DNA-Probe (n) in das Gel (Abb. 3). Eine entsprechende DNA-Größenmarker sollte immer zusammen mit experimentellen Proben beladen werden. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer. Die Kathode (schwarze Leitungen) sollte näher sein als die Brunnen der Anode (rote Leitungen). Überprüfen Sie, dass die Elektroden in die richtigen Schlitze in der Stromversorgung angeschlossen sind. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung. Führen Sie das Gel, bis der Farbstoff zu einem angemessenen Abstand migriert wurde. </li></ol> 3. Beobachten aufgetrennten DNA-Fragmente <ol><li> Wenn Elektrophorese beendet ist, schalten Sie die Stromversorgung und entfernen Sie den Deckel der Elektrophoresekammer. </li><li> Entfernen Gel aus dem Gel Box. Überschuss ablaufen lassen Puffer von der Oberfläche des Gels. Setzen Sie den Gelträger auf Küchenpapier, jede zusätzliche Laufpuffer absorbieren. </li><li> Entnehmen Sie das Gel aus dem Gel Tray und setzen Sie das Gel mit UV-Licht. Dies wird meist geschieht mit Hilfe eines Gel-Dokumentations-System (Abb. 4). DNA-Banden soll zeigen,als orange fluoreszierenden Bändern. Machen Sie ein Foto des Gels (Abb. 5). </li><li> Entsorgen Sie die Gel-und Laufpuffer pro Institution behördlichen Vorschriften entsorgen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse 5 zeigt ein typisches Ergebnis nach einer Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten. Nach der Trennung werden die erhaltenen DNA-Fragmente sichtbar klar definierten Bands. Die DNA-Standard oder einer Leiter sollte auf ein Maß, das für den nützlichen Bestimmung der Größe der Stichprobe erlaubt Bands getrennt werden. In dem gezeigten Beispiel werden DNA-Fragmente von 765 bp, 880 bp und 1022 bp auf einem 1,5% Agarosegel mit einem 2-log-DNA-Leiter getrennt. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> 1. Eine erstarrte Agarosegel nach der Entfernung des Kamms. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Abbildung 2. Eine Studentin und fügt Ladefarbstoff ihr DNA-Proben. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein Student Laden der DNA-Probe in einen Brunnen im Gel. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> 4. Ein Beispiel für ein Geldokumentationssystem. <img alt="Abbildung 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Bild 5. Ein Bild von einem Gel nach der Elektrophorese. EtBr wurde an das Gel vor der Elektrophorese in einer Endkonzentration von 0,5 mg / ml, durch Trennung bei 100 V für 1 Stunde zugegeben, gefolgt. Das Gel wurde mit UV-Licht und das Bild mit einem Gel-Dokumentations-System übernommen ausgesetzt.

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Agarosegelelektrophorese hat sich als effiziente und effektive Art und Weise der Trennung von Nukleinsäuren sein. Agarose die hohe Gelfestigkeit kann für die Behandlung von geringen Prozentsatz Gele für die Trennung von großen DNA-Fragmenten. Molekularsiebkohle wird durch die Größe der Poren durch die Bündel von Agarose 7 in der Gelmatrix erzeugt wird. Im Allgemeinen, je höher die Konzentration von Agarose, desto kleiner ist die Porengröße. Traditionelle Agarosegelen sind am effektivsten bei der Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 100 bp und 25 kb. Um DNA-Fragmente, die größer als 25 kb zu trennen, wird eine Notwendigkeit, Puls-Feld-Gelelektrophorese 6, die die Anwendung von Wechselstrom aus zwei unterschiedlichen Richtungen einbezogen werden, verwenden. Auf diese Weise größer dimensionierte DNA-Fragmente werden durch die Geschwindigkeit, mit der sie sich neu orientieren mit den Änderungen in der aktuellen Richtung getrennt ist. DNA-Fragmente kleiner als 100 bp getrennt sind wirksamer unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Im Gegensatz zuAgarosegelen, wird das Polyacrylamid-Gel-Matrix durch eine Radikalpolymerisation angetriebenen chemischen Reaktion gebildet. Diese Gele sind dünner höherer Konzentration, sind vertikal verlaufen und haben eine bessere Auflösung. In der modernen DNA-Sequenzierung Kapillarelektrophorese verwendet wird, wobei Kapillarröhrchen mit einer Gelmatrix gefüllt. Die Verwendung von Kapillarröhrchen ermöglicht die Anwendung von hohen Spannungen, wodurch die Trennung von DNA-Fragmenten (und die Bestimmung der DNA-Sequenz) schnell. Agarose kann modifiziert werden, um niedrig schmelzende Agarose durch Hydroxyethylierung zu erstellen. Niedrig schmelzende Agarose wird im Allgemeinen verwendet, wenn die Isolierung von DNA-Fragmenten getrennt erwünscht ist. Hydroxyethylierung verringert die Packungsdichte der Agarose-Bundles, eine effektive Senkung ihrer Porengröße 8. Dies bedeutet, dass ein DNA-Fragment der gleichen Größe länger dauert, bis durch eine leicht schmelzendem Agarosegel, um ein Standard-Agarosegel gegenüberliegenden bewegen. Da die Bündel miteinander verbindendurch nicht-kovalente Wechselwirkungen 9, ist es möglich, wieder schmilzt ein Agarosegel nach der Aushärtung. EtBr ist die häufigste Reagenz verwendet, um DNA in Agarosegelen 10 zu färben. Wenn UV-Licht ausgesetzt, Elektronen in dem aromatischen Ring der Ethidium-Molekül aktiviert werden, führt die zur Freisetzung von Energie (Licht) als Elektronen zurück zum Grundzustand. EtBr funktioniert durch Einlagern sich in der DNA-Moleküls in einer konzentrationsabhängigen Weise. Dies ermöglicht eine Abschätzung der Menge an DNA in einer bestimmten DNA-Bande auf ihrer Intensität. Aufgrund seiner positiven Ladung reduziert die Verwendung von EtBr die DNA-Migration Rate um 15%. EtBr ist ein Verdächtiger mutagen und karzinogen, also muss man Vorsicht walten lassen beim Umgang mit Agarosegelen enthält es. Darüber hinaus ist EtBr als Sondermüll und müssen entsprechend entsorgt werden. Alternative Flecken für DNA in Agarosegelen gehören SYBR Gold, SYBR Green, Kristallviolett und Methyl Blue. Von diesenMethyl Blue, Crystal Violet erfordern keine Exposition des Gels mit UV-Licht zur Visualisierung von DNA-Banden, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Mutation wenn die Wiederherstellung der DNA-Fragment aus dem Gel gewünscht wird. Allerdings sind die Empfindlichkeiten niedriger als die von EtBr. SYBR Gold und SYBR Green sind beide sehr empfindlich, UV-abhängige Farbstoffe mit geringere Toxizität als EtBr, aber sie sind wesentlich teurer. Darüber hinaus, alle alternativen Farbstoffe können entweder nicht oder nicht gut funktionieren, wenn sie direkt zu dem Gel gegeben, damit das Gel muss nach gebeizt nach der Elektrophorese. Wegen der Kosten, einfache Handhabung, und die Empfindlichkeit, EtBr bleibt noch der Farbstoff der Wahl für viele Forscher. Doch in bestimmten Situationen, z. B. wenn die Entsorgung gefährlicher Abfälle ist schwierig, oder wenn junge Studenten sind der Durchführung eines Experiments kann eine weniger giftige Farbstoff bevorzugt werden. Lädt Farbstoffe in Gel-Elektrophorese verwendet dienen drei wichtige Zwecke. Zuerst fügen sie hinzu Dichte der Probe, So dass sie in das Gel zu versenken. Zweitens bieten die Farbstoffe Farbe und den Ladevorgang zu vereinfachen. Schließlich bewegen sich die Farbstoffe in Regelsätze durch das Gel, so dass für die Abschätzung der Entfernung, die DNA-Fragmente migriert. Die genaue Größe der aufgetrennten DNA-Fragmente können durch Auftragen der log des Molekulargewichts für die verschiedenen Bereiche von einer DNA-Standard gegen den Abstand von jedem Band erneut bestimmt werden. Die DNA-Standard enthält eine Mischung von DNA-Fragmenten von vorbestimmten Größen, die gegen die unbekannten DNA-Proben verglichen werden können. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Formen von DNA durch das Gel mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen. Superspiralisierter Plasmid-DNA, aufgrund ihrer kompakten Konformation, bewegt sich durch das Gel am schnellsten, gefolgt von einem linearen DNA-Fragment der gleichen Größe, mit der offenen Kreisform reisen die langsamste. Abschließend, da die Annahme von Agarosegelen in den 1970er Jahren für die Trennung von DNA, hatsich als eines der nützlichsten und vielseitigsten Techniken in den biologischen Wissenschaften Forschung sein.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Agarose I </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidiumbromid </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Krebserzeugende-muss als gefährlicher Abfall entsorgt werden </td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> Fischer </td><td> BP2401-212 </td><td> Ätzend </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Fischer </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylene Cyanol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigator / FX Gel-Dokumentations-System </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Owl EasyCast B1 Mini-Gel-Elektrophorese-System </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS-301 Netzteil </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

Agarose-Gelelektrophorese ist der effektivste Weg zur Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe im Bereich von 100 bp bis 25 kb 1. Agarose wird aus dem Seegras Gattungen Gelidium und Gracilaria isoliert und besteht aus wiederholten Agarobiose (L-und D-Galactose) Untereinheiten 2. Während Gelierung, assoziieren Agarose-Polymere nicht-kovalent und bilden ein Netzwerk von Bündeln, deren Porengröße eines Gels bestimmen die Eigenschaften molekularer Siebung. Die Verwendung von Agarosegelelektrophorese revolutioniert die Trennung von DNA. Vor der Verabschiedung von Agarosegelen wurde die DNA in erster Linie getrennt mit Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, die nur unter der Voraussetzung eine Annäherung an Größe. Um die DNA unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese zu trennen, wird die DNA in vorgefertigten Vertiefungen in dem Gel und einem angelegten Strom geladen. Die Phosphat-Rückgrat der DNA (oder RNA) Molekül negativ geladen ist, damit, wenn sie in einem elektrischen Feld platziert wird, um DNA-Fragmente der p migrierenositively geladenen Anode. Da die DNA weist eine einheitliche Masse / Ladungs-Verhältnis, werden DNA-Moleküle nach Größe in einem Agarosegel in einem solchen Muster, dass die Strecke umgekehrt proportional zu dem Protokoll seiner Molekulargewicht 3 getrennt ist. Das führende Modell für die DNA-Bewegung durch ein Agarosegel ist, wobei die Vorderkante nach vorne bewegt und zieht den Rest des Moleküls entlang 4 &quot;Reptation voreingenommen&quot;. ; 2) Agarose-Konzentration; 3) DNA-Konformation 5; 4) angelegten Spannung, 5) Gegenwart von Ethidiumbromid, 6), Typ 1) Größe des DNA-Moleküls: Die Rate der Migration von einem DNA-Molekül durch ein Gel wird durch folgende Faktoren bestimmt Agarose und 7) Elektrophoresepuffer. Nach der Trennung können die DNA-Moleküle unter UV-Licht sichtbar gemacht nach dem Färben mit einem geeigneten Farbstoff. Durch Einhalten dieses Protokoll sollen die Studierenden in der Lage: <ol><li> Verständnis des Mechanismus, durch den DNA-Fragmenten innerhalb einer Gelmatrix getrennt werden </li><li> Verstehen Sie, wie die Konformation desDNA-Molekül seine Mobilität durch einen Gel-Matrix zu bestimmen </li><li> Identifizieren Sie ein Agarose-Lösung geeigneter Konzentration für ihre Bedürfnisse </li><li> Bereiten Sie ein Agarosegel für die Elektrophorese von DNA-Proben </li><li> Richten Sie die Gelelektrophorese Apparate und Stromversorgung </li><li> Wählen einer geeigneten Spannung für die Trennung von DNA-Fragmenten </li><li> Verständnis des Mechanismus, durch den Ethidiumbromid ermöglicht die Visualisierung von DNA-Banden </li><li> Bestimmen Sie die Größen der aufgetrennten DNA-Fragmente </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Ein Basis-Protokoll für die Trennung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese beschrieben.

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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763.4K Aufrufe.  University of California Los Angeles. Ein Basis-Protokoll für die Trennung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese beschrieben.

Serie: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and others. However, the traditional SGE protocol is quite tedious, and the experiment takes a long time. Moreover, the chemical consumption in SGE experiments is very high. This work proposes a simple method for the separation of DNA fragments based on an SGE chip. The chip is made by an engraving machine. Two plastic sheets are used for the excitation and emission wavelengths of the optical signal. The fluorescence signal of the DNA bands is collected by smartphone. To validate this method, 50, 100, and 1,000 bp DNA ladders were separated. The results demonstrate that a DNA ladder smaller than 5,000 bp can be resolved within 12 min and with high resolution when using this method, indicating that it is an ideal substitute for the traditional SGE method.

Traditional slab gel electrophoresis (SGE) experiments require a complicated apparatus and high chemical consumption. This work presents a protocol that describes a low-cost method to separate DNA fragments within a short timeframe.

Echtzeit-Tracking der DNA-Fragment-Trennung durch Smartphone

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

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Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

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Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

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DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of agarose, and within the gel, charge particles will migrate and separate based on size. The negatively charged phosphates of the DNA backbone cause DNA fragments to move toward the anode - a positively charged electrode.
The video explains the mechanism by which DNA fragments are resolved on an agarose gel, and it provides a step-by-step generalized procedure for how to prepare agarose gels, load DNA samples, run a DNA gel, visualize DNA fragments, and properly dispose of the gel and running buffer after the experiment is concluded.

DNA Gel Electrophoresis: Concept, Procedure, and Applications

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Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

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Gel Purification

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This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

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Mikrofluidische Kapillarelektrophorese zur Fragmentgrößenbestimmung von PCR-Produkten: Eine mikrochipbasierte elektrophoretische Trenntechnik zur Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe

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DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.
Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.
In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.
To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.
Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.
The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

Agarose Gel Electrophoresis for Separation of DNA Fragments

DNA-Agarose-Gel-Elektrophorese

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Unit 2

Erforschung von DNA und RNA

SCHLÜSSELBEGRIFFE UND KONZEPTE

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

To begin this procedure, add 250 microliters of a previously prepared protein sample solution to each slot of a 13-centimeter IPG strip holder. Place an 18-centimeter IPG strip, gel-side down, onto each protein sample solution, taking care to avoid bubbles. Then, add 3 to 4 milliliters of mineral oil to cover each IPG strip.
Next, assemble each IPG strip holder into an isoelectric focusing system, with the pointed end on the back plate, and the square end on the front plate. After rehydrating the IPG strips for 18 hours at room temperature, set the IEF parameters on the isoelectric focusing system with a total runtime of 7.5 hours and 36,875 volt hours.
After IEF, take out each IPG strip from the isoelectric focusing system, and remove the excess mineral oil with an insoluble paper towel. Then, wrap each strip in a sheet of plastic wrap, and store at -80 degrees Celsius.
To cast a 12% PAGE gel, add double-distilled water, 1.5 molar Tris-hydrochloric buffer, 40% acrylamide/bisacrylamide stock solution, 10% ammonium persulfate, and TEMED to a beaker. Mix the gel solution gently, taking care to avoid bubbles.
Gently pour the gel solution into a multi-casting chamber, up to the expected gel height of 19 centimeters. Immediately, add about 3 milliliters of double-distilled water to the multi-casting chamber to cover each resolving gel, and allow each gel to polymerize for about one hour.
This step is very important to prepare a high-quality SDS-PAGE gel. An equal volume water must be immediately added on the top of each gel.
Prepare two liters of electrophoresis buffer, then, add the buffer to an electrophoresis separation unit buffer tank.
After removing the focused IPG strips from the freezer, place them in a plastic vessel containing 1 milliliter of reducing equilibrium buffer and a trace of bromophenol blue, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking. After removing the reducing equilibrium buffer, add 4 milliliters of alkylation equilibrium buffer, and a trace of bromophenol blue to the IPG strips, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking.
During gel equilibrium, disassemble the multi-casting chamber, and remove the prepared resolving gel cassette. Rinse the gel cassette three times with double-distilled water, then, remove excess water from the gel cassette with an insoluble paper towel, and place it in a gel stander.
Following this, rinse the equilibrated IPG strips with electrophoresis buffer, and remove excess liquid on each IPG strip surface with an insoluble paper towel. Place an IPG strip onto the resolving SDS-PAGE gel, allowing the IPG strip&#39;s plastic side to contact the longer glass plate, with the pointed end to the left.
Now, quickly add 3 to 4 milliliters of hot 1% agarose and SDS electrophoresis buffer, to seal the IPG strip on the top of each SDS-PAGE gel, and place the top side of the IPG strip down on the top of the shorter glass plate, taking care to avoid bubbles.
These steps are very important to seal the IPG strip to an SDS-PAGE gel. The hot agarose solutions must be immediately added, and the IPG strip must be immediately placed into the top of the SDS gel.
After polymerization, insert the assembled gel cassette vertically between the plastic gaskets and a vertical electrophoresis system. Place the top of the gel with the IPG strip next to the cathode. Next, adjust the level of electrophoresis buffer to immerse the gel cassette by adding the appropriate volume of buffer to the electrophoresis system.
Connect and set the power supply in constant voltage mode, and run at 200 volts for about 370 minutes while monitoring the dye. After the run is complete, take the gel cassette out of the electrophoresis system and gently remove the gel from the gel cassette, taking care to avoid tearing the gel.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

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Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

Prepare two separating gels as described in the text manuscript. Pour the gel between the glass plates using a 1-milliliter pipette, ensuring that the upper 2 centimeters are free of the mixture. Add 70% ethanol on top of the separating gel, creating an even interface between the two layers.
Once the separating gels have polymerized, prepare the stacking gels using instructions in the text manuscript. Then, remove the ethanol from the separating gels, and add the stacking gel solution. Carefully insert a comb with the desired number of pockets, without introducing air bubbles, and allow the gel to polymerize for 20 to 30 minutes.
Load 4 microliters of each sample, as well as the protein ladder, into separate wells. Then, run the gel in Tris-Glycine running buffer at 144 volts for 45 minutes at room temperature. Use pre-warmed Fairbanks solution A to stain the gels on a rocker for 30 minutes, and pre-warmed Fairbanks solution D to decolor the gels on a rocker until the desired background is achieved.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts